劉穎 熊磊 蔡若雪 陳越 葉勁軍 沈波 周國仁

肺癌發(fā)病率在全球惡性腫瘤中位居第二[1]，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌的85%。免疫檢查點(diǎn)抑制劑的臨床應(yīng)用顯著改善了NSCLC患者的臨床預(yù)后。但是，腫瘤微環(huán)境具有復(fù)雜性和異質(zhì)性，因此仍有部分患者不能受益于免疫治療[2]。目前已知的預(yù)測因子包括腫瘤組織中程序性細(xì)胞死亡配體1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）的表達(dá)[3]和腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden, TMB）[4-6]等，評估腫瘤微環(huán)境中的詳細(xì)成分（如骨髓細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞）的研究正在不斷開展[7]。三級淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structure, TLS）是與次級淋巴器官（secondary lymphoid organs, SLO）高度相似的異位淋巴器官，有研究[8,9]發(fā)現(xiàn)TLS的存在與多種實(shí)體瘤（包括NSCLC）免疫治療的良好預(yù)后密切相關(guān)。本文對TLS在NSCLC免疫治療中的預(yù)后價(jià)值進(jìn)行綜述，旨在為篩選NSCLC免疫治療適宜人群以及開展后期研究提供參考。

1 TLS的基本介紹

1.1 TLS的組成 TLS通常在生理?xiàng)l件下不會形成，它是在慢性炎癥部位非淋巴組織中發(fā)育的異位淋巴器官[10]，在各種病理生理學(xué)情況下發(fā)展，包括自身免疫性疾病[11]、感染性疾病[12]和腫瘤[13]等，驅(qū)動(dòng)一系列環(huán)境依賴性效應(yīng)。當(dāng)前已經(jīng)在多種實(shí)體瘤（包括黑色素瘤[14]、結(jié)直腸癌[15]、乳腺癌[16]和NSCLC[17]等）中發(fā)現(xiàn)，TLS與腫瘤免疫治療的預(yù)后密切相關(guān)。TLS主要由B細(xì)胞、T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dentritic cell, DC）組成[18]。在腫瘤微環(huán)境中，TLS作為免疫細(xì)胞聚集體，盡管主要由內(nèi)部CD20+B細(xì)胞區(qū)和周圍CD3+T細(xì)胞區(qū)組成[19]，不同的DC也同時(shí)構(gòu)成DC細(xì)胞群。TLS為DC將相鄰腫瘤抗原局部呈遞給T細(xì)胞，以及為B細(xì)胞、T細(xì)胞的活化和增殖提供場所，從而產(chǎn)生記憶性輔助T細(xì)胞、效應(yīng)記憶性細(xì)胞毒性細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞和產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞[20,21]。TLS的成熟度可分成三個(gè)階段：早期TLSs（early-TLS, E-TLS）——無濾泡樹突狀細(xì)胞（follicle dendritic cell, FDC）的致密淋巴細(xì)胞聚集體；初級濾泡樣TLSs（primary follicle-like TLS, PFL-TLS）——B細(xì)胞簇，無生發(fā)中心的FDC網(wǎng)；次級濾泡樣TLS（secondary follicle-like TLS, SFL-TLS）——B細(xì)胞簇，具有生發(fā)中心的FDC網(wǎng)。

高內(nèi)皮小靜脈作為TLS的重要組成部分，起著招募免疫細(xì)胞的作用[22]。TLS的形成是一個(gè)多步驟的過程，這些免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組分的逐漸積累和組織化最終形成功能性的淋巴組織，從而實(shí)現(xiàn)局部適應(yīng)性免疫應(yīng)答。因此，TLS的存在與良好的預(yù)后和對免疫治療的反應(yīng)有關(guān)[23]。

1.2 TLS的特點(diǎn)及臨床應(yīng)用 關(guān)于TLS在腫瘤中的分布位置尚無統(tǒng)一定論，這和它的位置難以確切評估相關(guān)。當(dāng)前較多研究的是其在腫瘤周邊和腫瘤內(nèi)位置與預(yù)后的關(guān)系。盡管在肝細(xì)胞癌和膽管癌中都有研究[24,25]證實(shí)腫瘤內(nèi)TLS相較于腫瘤周邊與腫瘤更好的預(yù)后相關(guān)，但是大多數(shù)腫瘤中尚未發(fā)現(xiàn)TLS分布位置與預(yù)后的確切關(guān)系。此外，TLS在腫瘤中的成熟狀態(tài)具有異質(zhì)性，不同成熟狀態(tài)的TLS在腫瘤中的預(yù)后作用可能不同。具有高成熟TLS的NSCLC患者免疫治療預(yù)后更好[26]，這在食管癌[27]和胰腺癌[28]等多種實(shí)體瘤中都有證實(shí)。

由于TLS的位置、成熟度和豐度等均可能對腫瘤患者免疫治療的預(yù)后有影響，因此研究者們綜合TLS的特征，建立評分系統(tǒng)，以完善TLS在預(yù)后作用中的臨床應(yīng)用。根據(jù)TLS在腫瘤周圍組織和腫瘤內(nèi)的TLS豐度進(jìn)行評分是應(yīng)用較多的方法[8]，以此為基礎(chǔ)的免疫分型系統(tǒng)在很大程度上提高了TLS預(yù)后預(yù)測潛力，有助于精準(zhǔn)治療的推動(dòng)?？偟膩碚f，TLS的組成、位置和空間結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性，在臨床應(yīng)用上體現(xiàn)在不同空間分布下其密度與腫瘤預(yù)后的相關(guān)性。評分過程中不可避免地會出現(xiàn)誤差，這主要是由于不同病理學(xué)家的評估標(biāo)準(zhǔn)不同以及評估過程中出現(xiàn)的問題，未來需要對TLS各個(gè)方面進(jìn)行細(xì)化，對評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行更嚴(yán)格的規(guī)定，以提高其對腫瘤預(yù)后作用的預(yù)測精確性。

1.3 TLS的檢測方法 對腫瘤組織切片進(jìn)行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色是檢測TLS最簡單的方法。目前，通過免疫組化在組織中檢測TLS已成為較為普遍的形式，且特異性較好，可鑒定CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和CD20+B細(xì)胞[29]。但TLS陽性的腫瘤組織中提取到的mRNA的多個(gè)特征比較具有異質(zhì)性，且該方法無法探究TLS中免疫細(xì)胞互相作用的情況，因此仍需要開發(fā)更可靠的TLS檢測方法。多重免疫熒光技術(shù)可以在組織切片上標(biāo)記TLS相關(guān)細(xì)胞，進(jìn)行識別和定量分析，區(qū)分不同亞型和成熟度的TLS[30]，是當(dāng)前使用較多的檢測方法，用于評估TLS成熟度、密度以及組成對腫瘤預(yù)后的影響。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是高通量分析的理想選擇，但是受限于參考數(shù)據(jù)的偏差，并且需要大量樣本才能建立參考數(shù)據(jù)并進(jìn)行驗(yàn)證[31,32]。空間組學(xué)的進(jìn)步使得TLS的檢測方法過渡到數(shù)字空間分析技術(shù)和多重免疫熒光技術(shù)，可以從分子層面更清晰地探索TLS的組成和功能[33]。

2 TLS在NSCLC預(yù)后中的作用

既往有研究[34]證實(shí)，TLS評分是一個(gè)獨(dú)立的陽性預(yù)后因素，提高了各病理分期的預(yù)后能力，因此有望完善可切除NSCLC的腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-nodemetastasis, TNM）分期。一項(xiàng)納入112例接受完全切除的IB期肺腺癌患者的研究[35]也證實(shí)了TLS作為獨(dú)立預(yù)后因素的作用。該研究中，TLS陽性患者與TLS陰性患者相比，TLS陽性與更長的無復(fù)發(fā)生存期（recurrence free survival, RFS）相關(guān)（HR=0.47, 95%CI: 0.23-0.88,P=0.02），多因素分析發(fā)現(xiàn)TLS是RFS的獨(dú)立預(yù)后因素，且TLS陽性和陰性患者的PD-L1表達(dá)（P=0.54）和TMB（P=0.39）均無明顯差異。該研究中通過HE染色和免疫組化評估TLS是否存在，表明NSCLC中存在TLS是有利的預(yù)后因素，且與肺腺癌患者的PD-L1表達(dá)無關(guān)。在軟組織肉瘤中也證實(shí)存在TLS患者的6個(gè)月無進(jìn)展生存率（non-progression rate, NPR）和客觀緩解率（objective response rate, ORR）分別為40%（95%CI:22.7%-59.4%）和30%（95%CI: 14.7%-49.4%），遠(yuǎn)高于全隊(duì)列的NPR和ORR[36]。一項(xiàng)納入147例NSCLC患者的單中心回顧性研究[37]中，TLS高表達(dá)組的無病生存期（diseasefree survival, DFS）高于低表達(dá)組（P=0.027），證實(shí)II、III期NSCLC患者手術(shù)后TLS高表達(dá)與預(yù)后良好相關(guān)。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)外周血中低中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比值和少量抗原呈遞細(xì)胞可表明腫瘤微環(huán)境中存在TLS。

TLS組成和空間結(jié)構(gòu)決定其與免疫治療的關(guān)系密不可分，因此它在化學(xué)治療中的預(yù)測作用十分有限。一項(xiàng)納入來自114例接受鉑類化療作為轉(zhuǎn)移性一線治療NSCLC患者的研究[38]中，TLS陽性組的ORR和中位無進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）與TLS陰性組之間無差異（50%vs48.8%，P=1；4.7個(gè)月vs4.4個(gè)月，P=0.9），表明TLS不能預(yù)測接受化療的轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的臨床結(jié)果。然而，有研究[39]顯示TLS與新輔助化療可切除NSCLC患者的主要病理反應(yīng)密切相關(guān)，亦有研究[40,41]報(bào)道新輔助化療增加細(xì)胞毒性T細(xì)胞和B細(xì)胞浸潤，并降低可切除NSCLC患者腫瘤中叉頭框蛋白P3（forkheadbox P3, FoxP3）T細(xì)胞的密度。

總結(jié)來說，TLS是否存在、成熟度和表達(dá)度等都會對NSCLC患者的預(yù)后產(chǎn)生影響，并且主要是與接受免疫治療的患者相關(guān)。但是TLS的特征中究竟何者是最佳選擇尚無定論，因此當(dāng)前越來越多研究基于TLS的分布位置，結(jié)合其豐度等特點(diǎn)，建立TLS評分系統(tǒng)，旨在提高其對NSCLC預(yù)后的預(yù)測能力。

3 TLS對NSCLC免疫治療的影響

研究者們[42]通過建立小鼠模型研究TLS與肺腺癌免疫治療反應(yīng)之間的潛在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)小鼠模型中有效的免疫療法需要形成CXCL13依賴性TLS，并且TLS與肺腺癌對免疫治療的反應(yīng)相關(guān)。多項(xiàng)研究[43,44]都證明免疫治療可以誘導(dǎo)腫瘤小鼠模型的TLS形成和成熟。在肺腺癌患者中，研究者們通過免疫組化研究TLS表型，將TLS分為高成熟組和低成熟組，證實(shí)成熟TLS與引流淋巴結(jié)中細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞數(shù)量增加和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移頻率降低相關(guān)，這表明成熟的TLS 可能通過活化淋巴細(xì)胞增強(qiáng)抗腫瘤免疫治療效果[45]。在食管癌[46]、膽管癌[25]和結(jié)直腸癌[15]等實(shí)體瘤中，也證實(shí)了TLS的空間分布和豐度與免疫治療反應(yīng)顯著相關(guān)。

新輔助治療可降低原發(fā)灶腫瘤負(fù)荷，為患者爭取手術(shù)機(jī)會，隨著精準(zhǔn)治療理念的深入，新輔助治療方案也從既往的新輔助化療發(fā)展至新輔助靶向治療、新輔助免疫治療和新輔助內(nèi)分泌治療等多種策略。輔助免疫治療可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持久的抗腫瘤免疫反應(yīng)，并清除微小殘留病灶。因此，可切除肺癌患者可通過新輔助免疫治療方案獲得更低的術(shù)后復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，從而有更好的臨床獲益[47-49]。探索新輔助免疫治療的適宜人群也刻不容緩。截至目前，TLS在肺癌免疫治療預(yù)后中的價(jià)值已被大量研究證實(shí)。越來越多的研究者們開始探索TLS在肺癌新輔助免疫治療中的預(yù)后作用。一項(xiàng)回顧性研究[50]探討了腫瘤微環(huán)境與不同新輔助方式治療的病理反應(yīng)在NSCLC的相關(guān)性，研究中達(dá)到主要病理緩解（major pathological response,MPR）的患者有更高的TLS，達(dá)到完全病理緩解（pathologic complete response, PCR）的患者有顯著較低的FoxP3 T細(xì)胞密度，從腫瘤微環(huán)境角度為理解新輔助免疫聯(lián)合化療優(yōu)于單獨(dú)化療的機(jī)制提供新見解。TLS與病理反應(yīng)的關(guān)系不僅存在于NSCLC中，在接受新輔助免疫聯(lián)合化療的乳腺癌患者中，TLS狀態(tài)與PCR顯著相關(guān)，TLS豐度對人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）陰性乳腺癌病理反應(yīng)具有獨(dú)立預(yù)測價(jià)值[16]。接受了伊匹木單抗和納武利尤單抗雙免治療的尿路上皮癌患者中，達(dá)到完全緩解的患者可觀察到TLS富集[51]。為探索新輔助免疫聯(lián)合化療方案的潛在分子機(jī)制，研究者們選取了IIIA期行手術(shù)切除的NSCLC患者，對其CD45免疫細(xì)胞行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和T細(xì)胞受體測序，這些患者都接受了新輔助免疫聯(lián)合化療，研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤病變中，CXCL13和CXCL12趨化因子顯著富集，證實(shí)新輔助免疫聯(lián)合化療刺激了TLS形成[17]。一項(xiàng)探索三級淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)的成熟度和豐度與接受新輔助免疫治療的肺癌患者的療效相關(guān)性的研究[26]發(fā)現(xiàn)，TLS高成熟度和高豐度組比低成熟度和低豐度組具有更好的DFS，多變量分析顯示TLS成熟度在新輔助免疫聯(lián)合化療組中（P=0.014, HR=4.527, 95%CI: 1.351-15.167）是DFS的獨(dú)立預(yù)測因子。該研究通過HE和免疫組化對TLS進(jìn)行鑒定和定量分析，證實(shí)TLS成熟度與MPR相關(guān)，是接受新輔助免疫聯(lián)合化療的NSCLC患者DFS的獨(dú)立預(yù)測因子，并且誘導(dǎo)TLS成熟可能是新輔助化療免疫治療在可切除NSCLC中的潛在作用機(jī)制。鑒于TLS不同特征在NSCLC預(yù)后和免疫治療中的作用，本文在表1對相關(guān)研究進(jìn)行了總結(jié)。

表1 TLS與NSCLC患者預(yù)后的相關(guān)性研究Tab 1 Studies on the relationship between TLS and the prognosis of NSCLC

4 展望

在腫瘤微環(huán)境的背景下，TLS的形成和發(fā)展有利于調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫應(yīng)答并改善腫瘤患者對免疫檢查點(diǎn)抑制劑的耐藥性。當(dāng)前多項(xiàng)研究探索了TLS在NSCLC免疫治療中的預(yù)后作用，尤其在新輔助免疫療法推進(jìn)的同時(shí)，起著不可或缺的作用，但其具體作用機(jī)制仍不清楚。并且，由于TLS的檢測方法多樣，最常用的HE染色難以清晰識別TLS并進(jìn)行評估，多重免疫熒光和轉(zhuǎn)錄組測序等尚不能在臨床普遍應(yīng)用，因此TLS在臨床上的擴(kuò)展受限。TLS的空間分布和豐度等都與NSCLC免疫治療的預(yù)后相關(guān)，未來需進(jìn)一步細(xì)化TLS結(jié)構(gòu)和功能，綜合TLS多種特征，建立完善的評分機(jī)制。并且后續(xù)在研究TLS作用機(jī)制的同時(shí)，探索TLS誘導(dǎo)、化療藥物和免疫治療間的潛在協(xié)同作用將有利于制定更有效的治療方案。未來在腫瘤微環(huán)境的推動(dòng)下，腫瘤預(yù)后生物標(biāo)志物的研究將越來越精準(zhǔn)化，逐步實(shí)現(xiàn)NSCLC的個(gè)性化治療。