羅宏 代思思 李亞倫 田攀文 李沁桐 蔡緒雨

肺癌是當今全球最常見的癌癥，其發(fā)病率和癌癥致死率都位居前列[1]。多數(shù)肺癌患者就診時已處于疾病晚期，預后較差；以免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）為主的免疫治療的應用是腫瘤治療中的一項重大轉折，顯著提高了晚期非小細胞肺癌患者的臨床預后，已成為晚期肺癌患者的一線治療。但僅有20%肺癌患者從免疫治療中獲益[2]，在目前的臨床實踐中，很難準確篩選患者群體在免疫療法中持續(xù)受益。靶向程序性死亡受體1（programmed death receptor 1, PD-1）和程序性死亡配體1（programmed death ligand 1, PD-L1）是ICIs治療的主要策略，因此，PD-L1的表達最初被認為是預測抗PD-1/PD-L1治療反應的合理生物標志物，但現(xiàn)有研究[3,4]指出，PD-L1表達無法準確預測免疫治療療效。并且，由于PD-L1檢測依賴于腫瘤組織，取材限制導致其表達的時空異質(zhì)性[5,6]，更加影響了PD-L1檢測的穩(wěn)定性和準確性[7]。另外，組織樣本無法多次取樣，難以實時檢測免疫治療過程中的變化。因此迫切地需要取材方便的檢測方法，以監(jiān)測免疫治療全過程的療效。外周血檢測作為臨床常規(guī)的檢查方案，具有簡便且創(chuàng)傷小的優(yōu)勢，且能在不同時間點多點取樣以達到縱向對比分析并全程監(jiān)測的目的，其作為探究免疫治療生物標志物的重要價值正在被不斷開發(fā)[8-10]。除此之外，外周血中免疫細胞狀態(tài)與接受免疫治療的肺癌患者預后的關系也被多次報道[11-13]。本研究對接受ICIs治療的晚期肺癌患者外周血實驗室檢測指標及免疫細胞亞群進行探究，分析其與ICIs治療療效及預后的相關性，以期為晚期肺癌免疫治療療效預測和預后評估提供新的見解。

1 資料與方法

1.1 研究設計 本研究前瞻性納入2021年5月至2023年7月在四川大學華西醫(yī)院肺癌中心就診并接受抗PD-1/PD-L1治療的III-IV期肺癌患者，收集臨床病理資料及外周血實驗室檢查結果。納入標準：①組織病理學檢查確診為肺癌；②臨床分期為III-IV期的肺癌；③基因檢測無表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）/間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）/c-ros肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶（ROSproto-oncogene 1, receptor tyrosine kinase,ROS1）等驅動基因突變；④東部合作腫瘤小組（Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG）評分≤2分；⑤接受免疫聯(lián)合化療作為系統(tǒng)抗腫瘤治療；⑥未患有需要全身治療的活動性自身免疫性疾??；⑦未接受其他已批準的全身性免疫調(diào)節(jié)劑、長期大量使用激素或使用其他免疫抑制劑；⑧臨床資料完整且具備至少1年的隨訪信息。

1.2 資料收集 對于所有符合納入標準的患者，收集臨床病理學資料：診斷、性別、年齡、ECOG、吸煙史、腫瘤家族史、病理類型和臨床分期和治療方案。收集患者外周血實驗室檢查指標包括：外周血白細胞（white blood cell, WBC）計數(shù)、外周血淋巴細胞百分比（lymphocyte percentage,LYMPH%）、中性粒細胞淋巴細胞百分比（neutrophil-tolymphocyte ratio, NLR）及細胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment, CYFRA21-1）等。免疫治療反應根據(jù)實體瘤免疫療效評估標準（modified Response Evaluation Criteria in Solid Tumors 1.1 for immune-based therapeutics, iRECIST 1.1）每周期（3-4周）進行評估，6個月緩解狀態(tài)依據(jù)患者從首次用藥開始隨訪至6個月的全程綜合評估，反應者（responders, R）包括完全緩解（complete response, CR）、部分緩解（partial response, PR）和疾病穩(wěn)定（stable disease,SD）持續(xù)時間≥6個月，無反應者（non-responders, NR）定義為在首次用藥開始6個月內(nèi)發(fā)生疾病進展（progressive disease, PD），無論最佳療效如何。預后的評估指標采用無進展生存期（progression-free survival, PFS）。PFS是指從首次接受免疫治療開始直至影像學或PD或因任何原因死亡的時間。末次隨訪時間為2023年7月9日，隨訪時長為369-844 d。

1.3 樣本采集 對于流式分析隊列的所有患者，自愿參與研究并簽署書面知情同意書，采集首次用藥前3天內(nèi)的外周血及用藥1個周期后的外周靜脈血5.0 mL于含有EDTA抗凝劑的真空采血管中，顛倒混勻，轉移到離心管中，離心分層后，分離血漿及外周血。將外周血緩慢加入Ficoll液中，4oC、800g20 min，升速=1，降速=1。吸取中間白膜層于5 mL RPMI中，4oC、500g、7 min。加入1-2 mL裂紅液，室溫裂解約3 min后，4oC、500g、5 min。PBS清洗，4oC、500g、5 min。將細胞重懸于PBS至濃度為2×106/mL，備用。

1.4 多色流式細胞術分析 熒光抗體CD3、CD19、CD8、轉錄因子T細胞因子1（transcription factor T cell factor 1,TCF1）購自美國BD公司；CD4、PD-1購自Biolegend公司；LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain（L/D）、BV stain buffer購自Sigma-Aldrich公司。355、405、640 nm激光器配置Symphony A5流式細胞儀（美國BD Bioscience）。根據(jù)已滴定好的抗體質(zhì)量濃度及建立的流式檢測方案，檢測27例晚期肺癌患者接受ICIs治療前后兩次外周血標本。預先將CD3、CD19、CD4、CD8、TCF-1、PD-1抗體和L/D染料混合于50.0 μL BV stain buffer中，抗體加入量按照已滴定好的最適濃度加入。取50.0 μL已準備好的細胞懸液與50.0 μL混合抗體混勻，于冰上避光孵育30 min，加入1 mL PBS，400g5 min清洗，棄上清，加入300 μL PBS重懸，經(jīng)流式細胞儀檢測，記錄約1×106個Events，通過Flowjo軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 本研究所有統(tǒng)計學分析及繪圖均采用R 4.2.1進行。比較不同療效組別間指標差異，分類計數(shù)資料采用例數(shù)（%）表示，采用卡方檢驗或Fisher確切檢驗分析；定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（Mean±SD）或中位數(shù)（Q1, Q3）表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用t檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Wilcoxon秩和檢驗分析。通過繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線確定外周血免疫細胞因子在預測晚期肺癌免疫治療療效中的cut-off值，并通過Logistic回歸分析確定患者免疫治療療效的影響因素。繪制Kaplan-Meier曲線并利用Log-rank檢驗比較組間PFS差異。通過Cox風險比例模型進行單因素與多因素分析校正其他變量后PFS的預后影響因素。檢驗水準為P＜0.05。

2 結果

2.1 患者臨床病理特征 本臨床研究共納入69例晚期肺癌患者。其中男性61例（88.4%），女性8例（11.6%），年齡≥65歲25例（36.2%），＜65歲44例（63.8%）。其中腺癌34例（49.3%），鱗癌20例（29.0%），其他病理類型15例（21.7%）。所有入組患者接受抗PD-1/PD-L1免疫治療，66例（95.7%）患者接受化療聯(lián)合免疫治療，3例（4.3%）患者接受免疫單藥治療?；颊呓邮苤委熀驲組42例（60.9%），NR組27例（39.1%）。流式隊列是來自總臨床研究隊列中的27例患者，其中男性24例（88.9%），女性3例（11.1%），年齡≥65歲10例（37.0%），年齡＜65歲17例（63.0%），R組13例（48.1%），NR組14例（51.9%）。表1為本研究隊列患者不同療效組別臨床病理特征，R組與NR組患者在年齡、性別、吸煙史等臨床病理特征方面無顯著差異（P＞0.05），基線可比。

表1 晚期肺癌患者臨床病理特征及實驗室檢查結果Tab 1 Clinical characteristics and laboratory test results of patients with advanced lung cancer

2.2 臨床隊列外周血實驗室檢測指標與免疫治療療效的相關性 共有42例（60.9%）患者在接受免疫治療后獲得持續(xù)6個月以上的臨床緩解。收集患者治療前基線（B1）與1個周期治療后（B2）的實驗室檢查結果，對比R組和NR組治療前及治療1個周期后外周血檢測指標的差異，結果顯示治療1個周期后R組患者的LYMPH%（P=0.006）高于治療NR組。而治療1個周期后有R組患者的腫瘤標志物CYFRA21-1（P＜0.001）、WBC（P＜0.001）、NLR（P=0.011）明顯低于治療NR組（表1）。采用ROC曲線，確定第1個周期治療后外周血的WBC的cut-off值為8.275×109/L（圖1A），高于8.275×109/L的患者為高水平組；CYFRA21-1的cut-off值為4.255 ng/mL（圖1B），高于4.255 ng/mL的患者為高水平組；LYMPH%的cut-off值為31.550%（圖1C），高于31.850%的患者為高水平組；NLR的cut-off值為1.738（圖1D），高于1.738的患者為高水平組。將患者治療1個周期后外周血的CYFRA21-1、LYMPH%、WBC、NLR以及年齡、吸煙史、腫瘤家族史等指標納入Logistic單因素分析（表2），結果顯示治療1個周期后高CYFRA21-1（OR=15.00,95%CI: 3.40-66.00,P＜0.001）、高WBC（OR=13.00,95%CI: 2.80-63.00,P=0.001）、高NLR（OR=10.00, 95%CI:1.20-86.00,P=0.033）是免疫治療療效的危險因素，高LYMPH%（OR=0.09, 95%CI: 0.01-0.74,P=0.025）是免疫治療療效的保護因素（表2）。

表2 晚期肺癌患者療效與外周血指標單因素Logistic回歸分析Tab 2 Univariate Logistic regression analysis between response to treatment and peripheral factors in patients with advanced lung cancer

2.3 臨床隊列外周血實驗室檢測指標與患者PFS的相關性69例晚期肺癌患者中位PFS為250 d。對PFS進行單因素和多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)治療1個周期后低水平的WBC可以降低進展風險（HR=0.44, 95%CI: 0.23-0.84,P=0.013），治療后低水平的CYFRA21-1（HR=0.51, 95%CI: 0.26-1.00,P=0.049）的患者有更長的PFS，詳見表3。根據(jù)Cox回歸發(fā)現(xiàn)的影響預后的因素分組繪制相應的生存曲線圖（圖2A-圖2C）。發(fā)現(xiàn)治療1個周期后WBC＜8.275×109/L組的患者相較于WBC≥8.275×109/L組有更長的PFS（P＜0.001），治療1個周期后LYMPH%≥31.550%的患者PFS顯著長于低水平組（P=0.041），NLR＜1.738的患者比高水平組的患者有更長的PFS（P=0.030）。

圖2 晚期肺癌患者PFS的Kaplan-Meier生存分析。A：用藥1個周期后（B2），按WBC分組的患者PFS的Kaplan-Meier生存曲線；B：用藥1個周期后（B2），按LYMPH%分組的患者PFS的Kaplan-Meier生存曲線；C：用藥1個周期后（B2），按NLR分組的患者PFS的Kaplan-Meier生存曲線；D：治療前（B1），按外周血TCF1+CD8+ T 細胞分組的患者PFS的Kaplan-Meier生存曲線；E：用藥1個周期后（B2），按WBC細胞分組的患者PFS的Kaplan-Meier生存曲線。Fig 2 Kaplan-Meier survival analysis for PFS of patients with advanced lung cancer.A: Kaplan-Meier survival curves for PFS in 69 patients with advanced lung cancer grouped by WBC 1 cycle after treatment (B2); B: Kaplan-Meier survival curves for PFS in 69 patients with advanced lung cancer grouped by LYMPH% 1 cycle after treatment (B2); C: Kaplan-Meier survival curves for PFS in 69 patients with advanced lung cancer grouped by NLR 1 cycle after treatment (B2); D: Kaplan-Meier survival curves for PFS in FACS cohort patients grouped by TCF1+CD8+ T at baseline(B1); E: Kaplan-Meier survival curves for PFS in FACS cohort patients grouped by peripheral WBC 1 cycle after treatment (B2).PFS: progression-free survival.

表3 晚期肺癌患者PFS相關單因素和多因素分析Tab 3 Univariate and multivariate analysis of PFS in patients with advanced lung cancer

2.4 外周血淋巴細胞亞群與療效的相關性 對本研究隊列中27例具有治療前后配對的外周血樣本進行多色流式細胞術，分析淋巴細胞亞群與治療反應的相關性。對比分析R組和NR組治療前及治療1個周期后外周血檢測指標的差異，結果顯示治療前R組患者的基線TCF1+CD8+T淋巴細胞占比（P=0.035）高于治療NR組。治療1個周期后PD-1+CD4+T淋巴細胞在R組患者中顯著更高（P=0.043）（表4），而相應指標在治療前基線樣本中未發(fā)現(xiàn)顯著差異。采用ROC曲線，確定基線（B1）外周血的TCF1+CD8+T淋巴細胞百分比的cut-off值為24%（圖1E），高于24%的患者為高水平組；治療1個周期后（B2）PD-1+CD4+T淋巴細胞百分比的cut-off值為3.3%（圖1F），高于3.3%的患者為高水平組。將基線TCF1+CD8+T淋巴細胞占比、治療1個周期后PD-1+CD4+T淋巴細胞占比、CYFRA21-1、LYMPH%以及WBC等指標作為變量納入Logistic回歸模型，結果顯示，治療1個周期后高WBC（OR=7.30, 95%CI: 1.20-46.00,P=0.034）是免疫治療反應的危險因素，基線外周血中高水平TCF1+CD8+T淋巴細胞占比（OR=0.05, 95%CI: 0.0047-0.49,P=0.010）、治療1個周期后高LYMPH%（OR=0.09, 95%CI: 0.01-0.90,P=0.041）和高水平PD-1+CD4+T淋巴細胞占比（OR=0.12, 95%CI: 0.02-0.69,P=0.017）是免疫治療反應的保護性因素（表2）。

2.5 外周血淋巴細胞亞群與患者PFS的相關性 流式隊列27例晚期肺癌患者中位PFS為199 d。對PFS進行單因素和多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)基線低水平TCF1+CD8+T淋巴細胞占比的疾病進展風險更高（HR=4.84, 95%CI: 1.44-16.31,P=0.011），治療1個周期后低水平WBC（HR=0.32, 95%CI:0.11-0.93,P=0.037）和低水平CYFRA21-1（HR=0.16, 95%CI:0.05-0.54,P=0.003）可以降低患者疾病進展風險，詳見表5。根據(jù)Cox回歸發(fā)現(xiàn)的影響預后的因素分組繪制相應的生存曲線圖（圖2D-圖2E）。發(fā)現(xiàn)基線TCF1+CD8+T淋巴細胞占比＞24%的患者的PFS顯著長于低水平組患者（P=0.020），治療1個周期后WBC＜8.275×109/L組的患者相較于WBC≥8.275×109/L組有更長的PFS（P=0.017）。

表5 流式隊列晚期肺癌患者PFS相關單因素和多因素分析Tab 5 Univariate and multivariate analysis of PFS in FACS cohort patients with advanced lung cancer

3 討論

大部分肺癌患者確診時已處于病情中晚期階段，喪失手術根治性切除病灶的機會。以抗PD-1/PD-L1為主的免疫檢查點抑制劑聯(lián)合化療治療已經(jīng)成為驅動基因陰性中晚期肺癌的一線標準治療，在大量的臨床研究中都顯示出優(yōu)于化療的效果[14-17]，能夠有效延長肺癌患者總生存期及PFS。然而，只有一少部分患者可從免疫治療中獲益，而目前尚缺乏用于指導臨床實踐的生物標志物。目前對于免疫治療生物標志物的探索，大多研究者都關注于在腫瘤微環(huán)境、腫瘤免疫和循環(huán)腫瘤DNA等層面的研究，但腫瘤組織取材具有較大難度，無法作為常規(guī)臨床監(jiān)測方案。近期有不少研究關注到免疫治療過程中外周血指標的動態(tài)變化，提示外周血免疫細胞狀態(tài)與免疫治療反應的相關性[12,13,18]，因此本研究收集了入組中晚期肺癌患者的臨床病理學資料，結合臨床常規(guī)的血液學標志物結果，探索出一些與PD-1/PD-L1抑制劑療效及預后相關的因素。以期望能夠篩選出中晚期肺癌患者中最可能從免疫治療中獲益的人群，為臨床用藥決策提供一些思路。

本研究的療效相關性分析結果提示相對于NR組的患者而言，治療1個周期后R組患者有顯著更高的LYMPH%，而治療1個周期后腫瘤標記物CYFRA21-1、WBC及NLR水平明顯更低。推測可能與免疫治療有效地激活了機體的免疫系統(tǒng)并縮減了患者腫瘤負荷有關。此外，治療早期的外周血標志物能夠很好地預測患者6個月的臨床獲益，這與既往文獻[8,19,20]報道的早期外周血指標具有預測免疫治療療效的價值的觀點一致。在預后分析結果中，治療1個周期后LYMPH%、WBC、CYFRA21-1、NLR可以預測PFS，且WBC與CYFRA21-1是PFS的獨立預測因子。

總研究隊列中發(fā)現(xiàn)在治療1個周期后外周血LYMPH%與治療反應顯著相關，本研究進一步探索與免疫療效及預后相關的外周血細胞亞群。前瞻性地采集了27例患者新鮮外周血樣本進行流式細胞術的檢測。通過分析患者治療前后的縱向外周血發(fā)現(xiàn)基線TCF1+CD8+T細胞與治療1個周期后PD-1+CD4+T細胞與免疫治療反應顯著相關，并且基線TCF1+CD8+T細胞占比是中晚期肺癌患者PFS的獨立影響因素。我們的結果提示，基線TCF1+CD8+T細胞占比更高的患者對免疫檢查點抑制劑治療有更好的反應并且PFS更長。既往小鼠研究也提到TCF1+干性記憶T細胞亞群可能是腫瘤免疫微環(huán)境中T細胞的主要來源，可以自我更新以及分化，介導對免疫治療的持續(xù)反應[21-24]。推測具有此類特征的患者更可能從免疫治療中獲益，但尚需研究揭示其反應機制。

本研究作為單中心前瞻性隊列研究，符合標準的入組患者數(shù)量少，導致一定的集合偏倚，患者使用的免疫治療藥物和治療周期不同，隨訪時間不同。另外，本研究入組患者中23%患者的CYFRA21-1水平結果未完善導致未能收集。因此需要更大規(guī)模多中心前瞻性研究來進一步驗證本研究結論。

綜上所述，本研究顯示基線高TCF1+CD8+T細胞占比、治療1個周期后外周血LYMPH%更高、WBC、NLR及CYFRA21-1水平明顯更低的中晚期肺癌患者更可能從免疫檢查點抑制劑治療中獲益。未來可以通過更大樣本量的研究進一步探索TCF1+CD8+T細胞相關指標在晚期肺癌患者中的應用價值，為臨床醫(yī)生提供更方便有效的參考依據(jù)。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Cai XY and Li QT conceived and designed the study.Luo H and Dai SS performed the experiments.Luo H and Dai SS analyzed the data.Li YL and Tian PW contributed analysis tools.Cai XY, Li QT, Li YL and Tian PW provided critical inputs on design, analysis and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the fnal manuscript as submitted.