孫娟,沈媛,楊靜,趙春暉,吳侖,陳翔,賈晨,李英*,方芳*

(1.北京市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,北京 100029 2.北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站,北京 100176)

地西泮(Diazepam,DXP),又稱安定,屬苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑,具有抗驚厥、鎮(zhèn)定等作用。近年來(lái),一些不法商販在在水產(chǎn)捕撈和運(yùn)輸環(huán)節(jié)非法使用地西泮,導(dǎo)致地西泮在水產(chǎn)品中出現(xiàn)殘留,人體如果長(zhǎng)期攝入被地西泮污染的水產(chǎn)品,會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。因此許多國(guó)家將鎮(zhèn)靜劑類藥物劃為水產(chǎn)動(dòng)物捕撈和運(yùn)輸過(guò)程中的禁用類藥物[1]。2022年3月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)《2022年國(guó)家產(chǎn)地水產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計(jì)劃》和《2022年國(guó)家水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃》[2],啟動(dòng)新一輪全國(guó)范圍的水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥及其他投入品監(jiān)管和水生動(dòng)物疫病風(fēng)險(xiǎn)防控工作,其中《2022年國(guó)家產(chǎn)地水產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計(jì)劃》共監(jiān)測(cè)7種水產(chǎn)養(yǎng)殖禁(停)用藥、2種常規(guī)用藥、2種農(nóng)藥和地西泮[2]。地西泮作為2022年新增監(jiān)測(cè)指標(biāo),標(biāo)志著農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對(duì)未經(jīng)批準(zhǔn)使用的水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥的監(jiān)管進(jìn)一步加強(qiáng)。地西泮屬于鎮(zhèn)靜類藥物,目前中國(guó)未批準(zhǔn)作為水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥。依據(jù)《獸藥管理?xiàng)l例》有關(guān)規(guī)定,水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中使用該藥物屬于違規(guī)用藥[3]。GB 31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定[4],地西泮不得在動(dòng)物性食品中檢出。2022年11月15日農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局《關(guān)于發(fā)布<水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2022年1、2號(hào)>宣傳材料的通知》新增了地西泮等畜禽用獸藥在中國(guó)均未經(jīng)審查批準(zhǔn)用于水產(chǎn)動(dòng)物,在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中不得使用[5]。

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2023年1月關(guān)于監(jiān)督抽查發(fā)現(xiàn)的15批次問(wèn)題農(nóng)產(chǎn)品情況的通告中顯示,在江蘇省揚(yáng)州市養(yǎng)殖的1批次烏鱧(Channaargus)、安徽省安慶市養(yǎng)殖的3批次黃鱔(Monopterusalbus)中有地西泮藥物檢出[6]。北京市場(chǎng)監(jiān)督管理局2023年第一季度最新數(shù)據(jù)顯示,在北京市大興、門頭溝和昌平等地抽檢樣品中均有地西泮藥物檢出,檢出值在1.35～7.58 μg/kg之間[7]。因此針對(duì)地西泮在全國(guó)檢出率較高的問(wèn)題,建立一種前處理簡(jiǎn)單、檢出限低,適用于水產(chǎn)品中地西泮檢測(cè)的方法意義重大。

目前水產(chǎn)品中地西泮測(cè)定方法在國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的主要有：酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法(HPLC)[8-9]、氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)[10-11]以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12-21]。其中,氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法需要衍生處理,前處理過(guò)程較復(fù)雜;液相色譜法相比液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度較低,不能滿足禁用藥物檢出限低的要求;超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)具有靈敏度高、測(cè)定時(shí)間短、基質(zhì)干擾小,定量限低等優(yōu)勢(shì),在獸藥殘留分析中廣泛應(yīng)用。目前已有的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[22]是唯一可用于水產(chǎn)品中地西泮的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),但在實(shí)驗(yàn)室實(shí)際測(cè)定過(guò)程中發(fā)現(xiàn),由于該方法利用外標(biāo)法定量,存在明顯的基質(zhì)效應(yīng),導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)回收率低、重現(xiàn)性差等不足。而KJ202105[23]《水產(chǎn)品中地西泮殘留的快速檢測(cè)膠體金免疫層析法》規(guī)定了水產(chǎn)品中地西泮膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法,適用于魚、蝦中地西泮的快速定性測(cè)定,適合做篩查使用,出現(xiàn)陽(yáng)性樣品仍需要儀器法準(zhǔn)確定量核實(shí)。

本研究通過(guò)參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn),對(duì)樣品的前處理方法以及儀器分析方法進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化,并對(duì)本研究方法的有效性進(jìn)行了評(píng)價(jià),建立了一種應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)測(cè)定水產(chǎn)品中地西泮的定量分析方法,該方法具有操作簡(jiǎn)單、高效快捷,可有效節(jié)省檢測(cè)時(shí)間以及試劑耗材用量,為實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行批量樣品快速篩查測(cè)定提供依據(jù),也為今后完善地西泮殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

配有電噴霧離子源ESI+的超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜(型號(hào)為UPLC-XEVO TQ-XS),美國(guó)沃特世科技有限公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：Sorvall ST16R,美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司;氮吹儀：N-EVAP 112,上海力創(chuàng)科學(xué)儀器有限公司;電子天平(感量0.000 1 g)：ME204E,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;渦旋混勻器,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司;MILLI-Q Advangtage純水機(jī),法國(guó) Merck Millipore公司。

1.2 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品于2023年2月購(gòu)于北京大紅門京深海鮮批發(fā)市場(chǎng),體重約2 kg,不少于3尾魚,購(gòu)買后取背部肌肉,試樣量不少于400 g,將肌肉部分切成小塊勻漿裝入樣品袋,密封后貼上樣品標(biāo)簽于-18 ℃冰箱保存。

乙腈、乙酸乙酯、甲醇及甲酸(均為HPLC級(jí)),購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司;地西泮(DXP)及內(nèi)標(biāo)物氘代地西泮(DXP-D5),購(gòu)于國(guó)家標(biāo)物中心,純度均大于99%。HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),CORTECS UPLC(2.1 mm×100 mm,1.6 μm)和ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)3種不同型號(hào)色譜柱均購(gòu)于美國(guó)沃特世科技有限公司。

1.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱：ACQUITY BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),進(jìn)樣體積為5 μL,柱溫為35 ℃,流速為0.3 mL/min,流動(dòng)相為甲醇和0.1%甲酸水溶液。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源(ESI),采用正離子掃描方式,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM),離子源溫度為110 ℃,毛細(xì)管電壓為2.50 kV,溶劑氣溫度為450 ℃,去溶劑氣流量為800 L/h。其他質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

表1 地西泮液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)Tab.1 UPLC-MS/MS parameters for determining diazepam

1.4 樣品前處理

稱取5.00 g魚糜試樣(精確到0.01 g)于50 mL離心管中,加入0.2 mL氘代地西泮內(nèi)標(biāo)溶液,準(zhǔn)確加入25.0 mL乙酸乙酯,恒溫振蕩器中渦旋10 min,4 000 r/min離心5 min,取5 mL乙酸乙酯于15 mL離心管中,50 ℃水浴氮吹至干,用20%甲醇水溶液溶解,定容至2 mL,渦旋2 min,加入3.5 mL正己烷,振蕩2 min,棄上層正己烷層及中間雜質(zhì)膜,過(guò)0.22 μm聚醚砜濾膜于2 mL樣品瓶中,待測(cè)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

地西泮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 mg/L)配制方法：準(zhǔn)確稱取10 mg地西泮標(biāo)準(zhǔn)品,用純甲醇超聲溶解,完全溶解后定容至100 mL棕色容量瓶中,配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,-18 ℃儲(chǔ)存,保存期為6個(gè)月。

氘代地西泮內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 mg/L)配制方法：準(zhǔn)確稱取10 mg氘代地西泮標(biāo)準(zhǔn)品,用純甲醇超聲溶解,完全溶解后定容至100 mL棕色容量瓶中,配制成100 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,-18 ℃儲(chǔ)存,保存期為6個(gè)月。

氘代地西泮內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液(200 μg/L)配制方法：準(zhǔn)確移取200 μL氘代地西泮內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,用純甲醇定容至100 mL棕色容量瓶中,配制成200 μg/L的內(nèi)標(biāo)工作液,-4 ℃儲(chǔ)存,保存期為3個(gè)月。

地西泮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制方法：用20%甲醇水溶液稀釋地西泮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,加入內(nèi)標(biāo)溶液最終配制成0.01、0.05、0.10、0.50、1.00和2.00 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱優(yōu)化

分別選取HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),CORTECS UPLC(2.1 mm×100 mm,1.6 μm)和ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)3種不同規(guī)格的色譜柱進(jìn)行地西泮及其內(nèi)標(biāo)化合物的分離比較。結(jié)果(圖1)表明,ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)作為地西泮化合物的分離色譜柱時(shí),分離度和峰型較好,無(wú)分叉及拖尾現(xiàn)象,且能夠在5.0 min內(nèi)完成樣品分離。因此,選擇ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)作為分析色譜柱。

圖1 不同甲酸濃度流動(dòng)相對(duì)地西泮響應(yīng)值的影響Fig.1 Effect of different concentration of formic acid on the response of diazepam

2.2 流動(dòng)相種類和比例的選擇

根據(jù)地西泮化合物含有苯環(huán),極性較小的特征,選擇以C18色譜柱作為色譜分析柱。分別考察了乙腈-水溶液、甲醇-水溶液作為流動(dòng)相,發(fā)現(xiàn)使用以上兩種流動(dòng)相地西泮均能出峰。相比較甲醇-水溶液作為流動(dòng)相,質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)較高,色譜峰形較對(duì)稱。為了確定更優(yōu)流動(dòng)相種類條件,分別添加濃度為0.05%、0.10%、0.20%、0.50%及1.00%的甲酸,考察甲酸對(duì)地西泮響應(yīng)的影響。結(jié)果表明：甲酸濃度為0.10%時(shí),地西泮響應(yīng)和峰型均較好(圖1),因此采用甲醇-0.10%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

在此流動(dòng)相條件下,優(yōu)化流動(dòng)相比例,確定流動(dòng)相梯度洗脫程序?yàn)?.0～1.0 min,95% A;1.0～3.0 min,95%～0% A;3.0～4.0 min,0%～95% A;4.0 min,95% A,平衡1 min(A為0.1%甲酸水溶液)得到地西泮及其內(nèi)標(biāo)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖(圖2)。

圖2 地西泮及其內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖(ESI+)Fig.2 MRM chromatograms of diazepam and inter standard in ESI+ model

2.3 提取條件的選擇

根據(jù)前期查閱資料,地西泮極性較弱,易溶于甲醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑,不易溶于水。本研究以鯉(Cyprinuscarpio)和狹鱈(Theragrachalcogramma)為例,比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、1%甲酸乙腈、1%甲酸甲醇5種提取方式(圖3),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：直接加入1%(V/V)甲酸甲醇、1%(V/V)甲酸乙腈、甲醇、乙腈做提取劑后樣品提取效率和加標(biāo)回收率均沒(méi)有乙酸乙酯高,因此,選擇乙酸乙酯作為最終提取溶液。

圖3 不同提取劑對(duì)地西泮回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction solvent on the recovery rates of diazepam

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍

在最佳優(yōu)化條件下,用初始流動(dòng)相準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度分別為0.01～20.00 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線系列,同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)溶液,液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定分析,以定量離子峰面積與氘代地西泮峰面積之比為縱坐標(biāo)(y),待測(cè)化合物濃度與氘代地西泮濃度之比為橫坐標(biāo)(x),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,得到線性工作范圍及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明,地西泮在正離子模式下線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)均不低于0.995(圖4)。

圖4 地西泮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.4 Standard working curve of diazepam

2.4.2 檢出限和定量限

分別取空白狹鱈和鯉魚糜樣品作為基質(zhì),添加不同濃度的地西泮標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.4樣品前處理方法處理,分析測(cè)定后,以S/N=3作為最低檢出限,以S/N=10作為最低定量限(表2)。結(jié)果表明,地西泮的最低檢出限LOD在0.05～0.10 μg/kg,最低定量限LOQ在0.25～0.50 μg/kg之間,均低于中國(guó)、歐盟和日本等國(guó)家和地區(qū)規(guī)定的最大殘留限量。

表2 地西泮檢出限及定量限Tab.2 LODs and LOQs of diazepam

表3 地西泮不同添加水平回收率及精密度Tab.3 Recoveries and precisions of diazepam in different additive level

2.5 方法回收率與精密度

分別稱取狹鱈和鯉魚糜空白樣品5.00 g,對(duì)地西泮進(jìn)行低、中、高3個(gè)不同水平的添加,添加含量依次為2.0、5.0和10.0 μg/kg,不同添加水平進(jìn)行6次平行測(cè)定,計(jì)算添加回收率以及方法日內(nèi)精密度。按照同樣的樣品處理方法,連續(xù)測(cè)定6 d,計(jì)算方法的日間精密度。結(jié)果表明：地西泮藥物平均回收率為89.70%～100.80%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.80%～9.70%(表4)。

表4 本方法與國(guó)家已有標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)比結(jié)果Tab.4 Comparison results between the method used in the study and the national standard method

2.6 同標(biāo)準(zhǔn)方法比對(duì)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的可行性,采取了與標(biāo)準(zhǔn)方法的比對(duì)試驗(yàn)。目前可查到的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法只有SN/T 3235—2012《出口動(dòng)物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[22],該標(biāo)準(zhǔn)方法適用于水產(chǎn)品中地西泮的篩查和測(cè)定,采用外標(biāo)法定量,樣品經(jīng)過(guò)處理后上機(jī)會(huì)存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng),影響回收率,而內(nèi)標(biāo)法通過(guò)內(nèi)標(biāo)校正可以有效解決基質(zhì)效應(yīng)問(wèn)題,通過(guò)隨機(jī)抽取實(shí)際樣品送到有資質(zhì)的部級(jí)質(zhì)檢中心進(jìn)行測(cè)定比對(duì),結(jié)果表明(表5),該方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的結(jié)果均在規(guī)定范圍內(nèi),從而證明該方法的可靠性。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用所建立的分析方法,對(duì)190份樣品進(jìn)行測(cè)定,有8份樣品檢出,檢出樣品結(jié)果見表5。190份樣品中,地西泮檢出率為4.2%,其中最高檢出濃度為34.1 μg/kg。而且在實(shí)際樣品測(cè)定過(guò)程中發(fā)現(xiàn),所有檢出樣品品種均為鯉。

本實(shí)驗(yàn)室從2019年至今每年對(duì)北京地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)及市場(chǎng)進(jìn)行樣品抽取測(cè)定,從近幾年檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)有部分鯉樣品有地西泮檢出,而且2022年檢出率較前幾年要高。王守英等[24]研究發(fā)現(xiàn)上海市售水產(chǎn)品中有一定的地西泮殘留隱患,其殘留主要存在于鯽(Carssiusauratus)、草魚(Ctenopharyngodonidella)等淡水魚類中。在檢出產(chǎn)品中,殘留量絕大多數(shù)低于1 μg/kg。張璇等[25]對(duì)2020年8月采自上海市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市的 167 個(gè)水產(chǎn)品(包括魚、蝦、蟹、貝) 進(jìn)行鎮(zhèn)靜劑殘留篩查,結(jié)果表明除了草魚以及鯽檢出地西泮殘留外,還包括淡水鱸(Lateolabraxjaponicus)。從目前北京地區(qū)抽樣檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果來(lái)看地西泮檢出主要存在于鯉品種,因此,不同水產(chǎn)品品種之間地西泮藥物代謝差異仍需進(jìn)一步探討。

目前地西泮檢出原因仍待研究,分析可能原因有運(yùn)輸過(guò)程作為鎮(zhèn)定劑使用、漁用餌料中作為誘食劑使用、水體污染或投入品添加等。楊光昕等[26]調(diào)查了漁用餌料中地西泮及其降解產(chǎn)物的殘留狀況,發(fā)現(xiàn)地西泮的檢出率較高,殘留量較大,最高可達(dá)82 214 μg/kg,其認(rèn)為餌料中的地西泮極有可能是人為添加所致,且存在非法原藥來(lái)源途徑,使用來(lái)源不受監(jiān)控增加了藥物在水產(chǎn)品中污染殘留風(fēng)險(xiǎn),這可能是造成養(yǎng)殖環(huán)境污染、水產(chǎn)品中頻繁檢出地西泮的主要原因。下一步研究工作將通過(guò)對(duì)檢出樣品繼續(xù)跟蹤調(diào)查,對(duì)養(yǎng)殖魚塘底泥、水體、品種、代謝物等進(jìn)一步分析探究,爭(zhēng)取找到地西泮檢出來(lái)源。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC/MS/MS)測(cè)定水產(chǎn)品中地西泮殘留的分析方法,該方法提取步驟簡(jiǎn)單快速穩(wěn)定,通過(guò)內(nèi)標(biāo)法定量有效消除了基質(zhì)效應(yīng)以及前處理過(guò)程損失的影響,有效提高了水產(chǎn)品中地西泮測(cè)定的回收率,方法具有較低的檢出限和定量限,重復(fù)性好,可適用于水產(chǎn)品中地西泮藥物殘留的快速篩查和定量分析。