王娜,余衛(wèi)忠,張旻,景宏麗,王彩霞 ,馮春燕,李清,吳紹強(qiáng)*

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 北京 100176;2.全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站 北京 100125)

鯽造血器官壞死病(Crucian carp haematopoietic necrosis,CHN)是由鯉皰疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2),也稱為金魚(yú)造血器官壞死病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus,GFHNV),引起的鯽(Carassiusauratus)、金魚(yú)等魚(yú)類死亡的一種病毒性傳染病,在全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有流行,給金魚(yú)、鯽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2],自2009年以來(lái),在中國(guó)江蘇省部分地區(qū)養(yǎng)殖的異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)中檢測(cè)到CyHV-2病毒,隨后該病毒在國(guó)內(nèi)鯽主要養(yǎng)殖區(qū)域暴發(fā)流行[3-4]。CyHV-2屬于皰疹病毒目(Herpesvirales)、異樣皰疹病毒科(Alloherpesviridae)、鯉科皰疹病毒屬(Cyprinivirus),是具有囊膜的雙鏈DNA病毒[5]。由于幼魚(yú)和成魚(yú)均可感染,發(fā)病急、死亡率高,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2022年在《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》中將其列為二類水生動(dòng)物疫病[6]。

目前,針對(duì)CyHV-2感染尚無(wú)有效的防治藥物。因此,加強(qiáng)監(jiān)測(cè)成為控制和預(yù)防鯽造血器官壞死病的重要手段。雖然已有很多CyHV-2的檢測(cè)方法[3],但在實(shí)際應(yīng)用中主要還是基于分子的檢測(cè)技術(shù),血清學(xué)診斷并沒(méi)有得到廣泛的應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)權(quán)威的CyHV-2檢測(cè)方法是GB/T 36194—2018《金魚(yú)造血器官壞死病毒檢測(cè)方法》[7]中推薦的方法,分別使用特異性引物PCR擴(kuò)增CyHV-2 DNA聚合酶(pol)基因片段(362 bp)和解旋酶(hel)基因片段(366 bp),當(dāng)檢測(cè)樣品能同時(shí)擴(kuò)增出2段基因且測(cè)序結(jié)果正確時(shí),才可判定樣品中CyHV-2核酸陽(yáng)性。

針對(duì)某種疾病或病原的能力驗(yàn)證結(jié)果,是衡量相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的重要指標(biāo)[8],也是評(píng)價(jià)全系統(tǒng)對(duì)該疫病防控能力的重要參數(shù)[9-10]。為加強(qiáng)水生動(dòng)物防疫系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室鯽造血器官壞死病病原檢測(cè)能力,提高疫病監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性,2018—2022年,全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站分別組織5次水生動(dòng)物防疫系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室“鯽造血器官壞死病病原檢測(cè)能力驗(yàn)證”項(xiàng)目,并委托中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院承擔(dān)相關(guān)測(cè)試評(píng)價(jià)工作。通過(guò)此次考核和比對(duì),能力測(cè)試的結(jié)果可以客觀反映參加實(shí)驗(yàn)室的鯽造血器官壞死病病原檢測(cè)能力,同時(shí)幫助和促進(jìn)參加實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)管理和技術(shù)問(wèn)題,并加以糾正,提高檢測(cè)能力水平,保證各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 能力驗(yàn)證樣品的制備

經(jīng)檢測(cè)未感染CyHV-2的健康草魚(yú)(CtenopharyngodonIdella)采自北京,取脾臟、腎臟和肝臟組織研磨均勻,按照質(zhì)量體積比1∶10(m/v),用1×PBS緩沖液懸浮待用。

病毒樣顆粒溶液CyHV-2-pol包含GB/T 36194-2018《金魚(yú)造血器官壞死病毒檢測(cè)方法》[7]中的pol基因片段(GenBank No：AFJ20509),長(zhǎng)度為1 536 bp;病毒樣顆粒溶液CyHV-2-hel包含標(biāo)準(zhǔn)中的hel基因片段(GenBank No：AFJ20501),長(zhǎng)度1 707 bp。2種病毒樣顆粒溶液由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢驗(yàn)與檢疫研究所制備保存。

按照組織勻漿液：CyHV-2-pol溶液：CyHV-2-hel溶液=3∶1∶1(v/v/v)的體積比,將各溶液混勻。混合液作為陽(yáng)性檢測(cè)樣品,每管800 μL分裝,-80 ℃保存。單獨(dú)的草魚(yú)組織勻漿液作為陰性檢測(cè)樣品,同樣分裝保存。

1.1.2 能力驗(yàn)證樣品的均勻性和穩(wěn)定性

1.1.2.1 均勻性

為保證所有參加實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的樣品成分一致,所有樣品(包括陽(yáng)性樣品和陰性樣品)各一次性準(zhǔn)備250管,每管樣品800 μL分裝。按照CNAS-GL003：2018《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》[11]測(cè)試均勻性。陰性樣品和陽(yáng)性樣品各隨機(jī)抽取11份進(jìn)行檢測(cè)。使用GB/T 36194-2018《金魚(yú)造血器官壞死病毒檢測(cè)方法》[7]中推薦的PCR方法擴(kuò)增目的基因,并委托上海生工生物進(jìn)行測(cè)序。若全部樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與目的基因大小一致,則樣品均一性良好。若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與目的基因大小不符,或有DNA污染,或目的基因條帶不明顯甚至無(wú)DNA條帶,則樣品不能使用,需重新制備和檢驗(yàn)。

1.1.2.2 穩(wěn)定性

為保證各參加實(shí)驗(yàn)室收到的樣品性質(zhì)未發(fā)生改變,分別設(shè)置3組陽(yáng)性樣品和陰性樣品,每組5份,模擬保存溫度和運(yùn)輸溫度放置于-20、4和37 ℃下測(cè)試樣品的穩(wěn)定性。分別在第0 d、第2 d、第5 d、第9 d和第14 d,將3種溫度保存的樣品各取1份,于-80 ℃保存。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序,檢測(cè)在不同保存條件下樣品的穩(wěn)定性。

1.1.3 樣品的包裝及發(fā)放

1.1.3.1 樣品的包裝

樣品為盲樣,擬給每個(gè)參加實(shí)驗(yàn)室發(fā)放4份檢測(cè)樣品,其中至少包含1份陽(yáng)性樣品或1份陰性樣品。陰性樣品(N)、陽(yáng)性樣品(P)可有10種不同的組合方式,隨機(jī)決定參加者采用哪一種組合,由發(fā)樣單位記錄并保密,從而保證能力驗(yàn)證項(xiàng)目的測(cè)試效果,防止實(shí)驗(yàn)室間互相比對(duì)結(jié)果。給參加實(shí)驗(yàn)室一個(gè)隨機(jī)代碼,再隨機(jī)決定發(fā)送哪種組合的樣品。4個(gè)檢測(cè)樣品標(biāo)簽為實(shí)驗(yàn)室的代碼和樣品編號(hào)(例如：代碼為C10的參加實(shí)驗(yàn)室,樣品標(biāo)簽為C10-1、C10-2、C10-3、C10-4)。

2.1.3.2樣品的發(fā)放

樣品避光保存于1.5 mL管中,管壁上防水標(biāo)簽包含測(cè)試樣品名稱、編號(hào)及實(shí)驗(yàn)室代碼,樣品管放置于包裝盒內(nèi)。包裝盒上防水標(biāo)簽包含項(xiàng)目名稱、測(cè)試樣品名稱、數(shù)量、編號(hào)、保存溫度、發(fā)送單位及接收單位名稱(圖1)。根據(jù)樣品穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果,將包裝盒放置于充滿干冰和冰袋的厚泡沫塑料盒內(nèi),密封后放置于硬殼紙箱中,再次密封后通過(guò)特快專遞發(fā)放至各參加實(shí)驗(yàn)室。同時(shí)在樣品的寄送包裝中附有樣品接收確認(rèn)單、能力測(cè)試作業(yè)指導(dǎo)書(shū)和能力測(cè)試結(jié)果報(bào)告單等紙質(zhì)材料。

圖1 送檢樣品包裝Fig.1 The packaging of testing samples

圖2 CyHV-2陽(yáng)性樣品均一性A：目的基因362 bp;B：目的基因366 bpM：DL2000 DNA Marker;1～22：11份陽(yáng)性樣品DNA,每個(gè)樣品2次重復(fù);N：空白對(duì)照(ddH2O);P：陽(yáng)性對(duì)照。Fig.2 Homogeneity of CyHV-2 positive samplesA：Target gene 362 bp;B：Target gene 366 bpM：DL2000 DNA Marker;1-22：DNA in 11 positive sample,each sample with two replicates;N：Blank control (ddH2O);P：Positive control.

1.2 方法

1.2.1 推薦的檢測(cè)方法

使用GB/T 36194-2018《金魚(yú)造血器官壞死病毒檢測(cè)方法》[7]中推薦的PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。先提取樣品總DNA,再使用PCR方法檢測(cè)病毒的DNA。根據(jù)擴(kuò)增得到的片段大小及測(cè)定序列比對(duì)結(jié)果來(lái)判斷。樣品DNA的抽提試劑和PCR反應(yīng)試劑可根據(jù)參加實(shí)驗(yàn)室情況自行選擇,或采用商品化試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 檢測(cè)樣品結(jié)果判定方法

本項(xiàng)目為定性檢測(cè)類項(xiàng)目,檢測(cè)結(jié)果僅用陽(yáng)性和陰性表示,沒(méi)有定量標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)滿足以下2條即可判定為GFHNV陽(yáng)性[7]。一是利用CyHV引物PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,且通過(guò)分析測(cè)序結(jié)果確定是GFHNV。二是利用CyHV-2引物PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,且測(cè)序結(jié)果正確。

1.2.3 能力驗(yàn)證結(jié)果判定原則

參加實(shí)驗(yàn)室的定性檢測(cè)結(jié)果必須與發(fā)放樣品預(yù)設(shè)結(jié)果完全一致,方可判定為結(jié)果“滿意”,并且檢測(cè)流程和檢測(cè)結(jié)果判定方法必須符合GB/T 36194—2018《金魚(yú)造血器官壞死病毒檢測(cè)方法》[7]的規(guī)定。

1.2.4 驗(yàn)證結(jié)論

如果參加單位報(bào)送結(jié)果為“滿意”,則表明該實(shí)驗(yàn)室已具備鯽造血器官壞死病病原的檢測(cè)能力;如果報(bào)送結(jié)果為“不滿意”,則需分析原因,進(jìn)行相應(yīng)的整改。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的均勻性與穩(wěn)定性

2.1.1 均勻性檢測(cè)結(jié)果

隨機(jī)選取11份陽(yáng)性樣品和陰性樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,陽(yáng)性樣品均可擴(kuò)增出362 bp條帶和366 bp條帶,PCR產(chǎn)物測(cè)序序列與參考序列同源性達(dá)100%,陰性樣品均與預(yù)期結(jié)果一致。說(shuō)明陽(yáng)性樣品和陰性樣品均一性良好,滿足能力驗(yàn)證要求。

2.1.2 穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

樣品保存于-20、4和37 ℃ 14 d后,檢測(cè)結(jié)果仍全部為陽(yáng)性,序列比對(duì)結(jié)果顯示與參考序列的同源性都達(dá)到100%,表明樣品穩(wěn)定性良好。在37 ℃保存第14 d時(shí)PCR擴(kuò)增條帶會(huì)變淺?？紤]到使用特快專遞,一般2～5 d可運(yùn)抵參加能力驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室,因此本項(xiàng)目制備的能力驗(yàn)證樣品經(jīng)長(zhǎng)途運(yùn)輸后仍滿足參加實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)需求。按照GB/T 36194—2018《金魚(yú)造血器官壞死病毒檢測(cè)方法》[7],CyHV-2的PCR檢測(cè)為定性檢測(cè),不需要定量,因此樣品的均勻性和穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果也只統(tǒng)計(jì)了定性結(jié)果,未統(tǒng)計(jì)定量和誤差分析。

2.2 參加實(shí)驗(yàn)室情況

2018—2022年“鯽造血器官壞死病病原檢測(cè)能力驗(yàn)證”項(xiàng)目分別有67、71、74、106和93家實(shí)驗(yàn)室參加,包括推廣(疫控)機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室、科研機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室、高校實(shí)驗(yàn)室、海關(guān)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室、企業(yè)實(shí)驗(yàn)室和其他單位實(shí)驗(yàn)室(表1)。其中農(nóng)業(yè)農(nóng)村部各級(jí)水產(chǎn)技術(shù)推廣站,以及某些研究CyHV-2的高校、科研院所和企業(yè),主要負(fù)責(zé)檢測(cè)監(jiān)測(cè)國(guó)內(nèi)CyHV-2的流行情況;海關(guān)系統(tǒng)各級(jí)技術(shù)中心和實(shí)驗(yàn)室,負(fù)責(zé)出入境水生動(dòng)物的CyHV-2檢測(cè)。地域分布上,各參加實(shí)驗(yàn)室分布于全國(guó)各省市,沿海省市和長(zhǎng)江流域水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)比較發(fā)達(dá)地區(qū)占比較高。

表1 參加能力驗(yàn)證活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)室Tab.1 The laboratories particpated in proficiency testing 個(gè)

2.3 參加實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)及評(píng)價(jià)結(jié)果

2018年,有67家單位參加能力驗(yàn)證測(cè)試,其中58家單位測(cè)試結(jié)果滿意,占86.57%;9家單位測(cè)試結(jié)果不滿意,占13.43%。2019年,有71家單位參加能力驗(yàn)證測(cè)試,其中59家單位測(cè)試結(jié)果滿意,占83.10%;12家單位測(cè)試結(jié)果不滿意,占16.90%。2020年,有74家單位參加能力驗(yàn)證測(cè)試,其中64家單位測(cè)試結(jié)果滿意,占86.50%;10家單位測(cè)試結(jié)果不滿意,占13.50%。2021年,有106家單位參加能力驗(yàn)證測(cè)試,其中93家單位測(cè)試結(jié)果滿意,占87.74%;13家單位測(cè)試結(jié)果不滿意,占12.26%。2022年,有92家單位參加能力驗(yàn)證測(cè)試,其中79家單位測(cè)試結(jié)果滿意,占85.86%;13家單位測(cè)試結(jié)果不滿意,占14.14%(表2)?？v觀5次能力驗(yàn)證項(xiàng)目,2021年參測(cè)實(shí)驗(yàn)室數(shù)量最多(圖3),滿意率除2019年稍低外,其余4年均超過(guò)85.00%(圖4)。

表2 2018—2022年能力驗(yàn)證滿意結(jié)果對(duì)比表Tab.2 The proficiency testing satisfaction results of laboratories in 2018—2022

圖3 2018—2022年參測(cè)實(shí)驗(yàn)室數(shù)量Fig.3 The number of laboratories tested in proficiency testing in 2018—2022

圖4 2018—2022年參測(cè)實(shí)驗(yàn)室滿意率Fig.4 The satisfaction rate of laboratories tested in proficiency testing in 2018—2022

3 討論

近年來(lái),隨著鯽養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸擴(kuò)大,鯽造血器官壞死病已成為嚴(yán)重威脅中國(guó)鯽和金魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要疾病之一。因此,加強(qiáng)鯽造血器官壞死病的監(jiān)測(cè)和防控是當(dāng)前的首要工作。開(kāi)展鯽造血器官壞死病病原檢測(cè)能力驗(yàn)證工作,提升該病的檢測(cè)能力,為鯽造血器官壞死病的監(jiān)測(cè)預(yù)警提供了有力支撐。本能力驗(yàn)證具有持續(xù)時(shí)間久、參加實(shí)驗(yàn)室數(shù)量多、地域分布廣泛等特點(diǎn)。2018—2022年,共有411家(次)實(shí)驗(yàn)室參加,測(cè)試結(jié)果滿意率依次為86.57%、83.10%、86.50%、87.74%和85.86%。表明大部分實(shí)驗(yàn)室具備了鯽造血器官壞死病病原檢測(cè)能力和質(zhì)量管理水平[12],可以承擔(dān)該病原的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)工作,為有關(guān)部門(mén)提供技術(shù)支持工作。

病原檢測(cè)的能力驗(yàn)證樣品,一般采用活病原、病原總核酸或核酸片段來(lái)制備[13]。由于用活病毒做能力測(cè)試有病原泄漏和擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn),中國(guó)也明令禁止隨意轉(zhuǎn)運(yùn)。為盡量模擬實(shí)際情況,本項(xiàng)目將健康草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)組織勻漿液與包含病毒DNA的病毒樣顆粒溶液混合,作為檢測(cè)能力驗(yàn)證樣品。病毒樣顆粒溶液中包含CyHV-2的pol和hel目的基因片段,因此可以使用PCR方法進(jìn)行檢測(cè);同時(shí)病毒樣顆粒具有病毒結(jié)構(gòu)特點(diǎn),除滿足安全穩(wěn)定的條件外,無(wú)生物安全風(fēng)險(xiǎn)。因?qū)嶋H檢測(cè)工作中是提取感染組織的DNA進(jìn)行檢測(cè),該項(xiàng)目不僅可以驗(yàn)證各參加實(shí)驗(yàn)室的PCR檢測(cè)能力,還可以驗(yàn)證其從組織中提取核酸的能力。

本單位承擔(dān)的“鯽造血器官壞死病病原檢測(cè)”能力測(cè)試項(xiàng)目均按照組織核酸提取、PCR、測(cè)序的技術(shù)方法判定結(jié)果,每個(gè)實(shí)驗(yàn)室4份測(cè)試樣品。結(jié)果報(bào)告單中要求每個(gè)參測(cè)實(shí)驗(yàn)室注明所使用的儀器設(shè)備、參考物質(zhì)的種類及來(lái)源、采標(biāo)情況、核酸制備方法、檢測(cè)結(jié)果及測(cè)試中出現(xiàn)的問(wèn)題等,同時(shí)需附完整實(shí)驗(yàn)記錄。上述信息的提供用以考察和評(píng)定參測(cè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力和水平。在檢測(cè)過(guò)程中重點(diǎn)關(guān)注以下問(wèn)題。

3.1 標(biāo)準(zhǔn)的正確運(yùn)用

依據(jù)所采用標(biāo)準(zhǔn)中的結(jié)果判定條件,PCR陽(yáng)性條帶,需經(jīng)測(cè)序及序列比對(duì),若比對(duì)結(jié)果確認(rèn)為CyHV-2,才能判定為樣品陽(yáng)性。有的參加單位PCR僅檢測(cè)一個(gè)基因或PCR檢測(cè)結(jié)果正確,未對(duì)所擴(kuò)增條帶進(jìn)行測(cè)序或者僅對(duì)其中一個(gè)基因或一個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行測(cè)序或序列比對(duì)后判定樣品核酸陰性或陽(yáng)性,不符合標(biāo)準(zhǔn)中的結(jié)果判定條件。建議參加單位嚴(yán)格按照檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的流程和結(jié)果判定條件進(jìn)行檢測(cè)。核酸制備方法在標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的是常規(guī)方法,目前商品化試劑盒應(yīng)用比較普遍,便捷且提取質(zhì)量較好,建議檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室在選擇使用商品化核酸提取試劑盒時(shí)應(yīng)設(shè)立常規(guī)方法對(duì)比監(jiān)控核酸提取質(zhì)量,防止假陰性的錯(cuò)誤判定。5次能力驗(yàn)證中不滿意結(jié)果存在7個(gè)假陰性結(jié)果。

3.2 體系質(zhì)量控制

此次能力測(cè)試活動(dòng)中結(jié)果不滿意實(shí)驗(yàn)室存在陰性測(cè)試樣品出現(xiàn)陽(yáng)性的結(jié)果。假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn),主要由以下幾方面因素造成：一是硬件環(huán)境方面,部分檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室空間布局和區(qū)域劃分存在缺陷,為防止從PCR反應(yīng)間污染的擴(kuò)散,最好將PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)或者分成多個(gè)房間,嚴(yán)格從潔凈區(qū)(前區(qū))到污染區(qū)(后區(qū))的單向流程[14];二是軟件操作方面,操作過(guò)程不規(guī)范、人員技術(shù)等方面存在不足,防污染意識(shí)淡薄,因此極容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的情況;三是測(cè)試過(guò)程中部分參測(cè)單位在結(jié)果報(bào)告單的模糊分析,暴露了對(duì)CyHV-2檢測(cè)流程不夠熟悉等問(wèn)題。建議承擔(dān)檢測(cè)任務(wù)的實(shí)驗(yàn)室加強(qiáng)該方面培訓(xùn),將檢測(cè)誤差風(fēng)險(xiǎn)降到最低。此次測(cè)試結(jié)果不滿意的實(shí)驗(yàn)室中,57次不滿意結(jié)果中有13次是假陽(yáng)性和假陰性導(dǎo)致,占22.80%。導(dǎo)致假陽(yáng)性的主要原因是在試驗(yàn)過(guò)程中未嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行,忽視細(xì)節(jié),導(dǎo)致樣品污染。為避免產(chǎn)生假陽(yáng)性,應(yīng)在以下檢測(cè)步驟中特別注意：DNA提取過(guò)程中避免交叉污染,尤其注意更換移液器吸頭和避免手指沾染樣品液體;PCR反應(yīng)體系加樣時(shí),注意更換移液器吸頭,按照空白對(duì)照、陰性對(duì)照、待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照的順序加樣;電泳點(diǎn)樣時(shí),避免樣品量過(guò)多溢出點(diǎn)樣孔,或手抖使樣品流入其他點(diǎn)樣孔[15]。

3.3 參考物質(zhì)的規(guī)范

參考物質(zhì)作為整個(gè)檢測(cè)質(zhì)量體系運(yùn)行情況的監(jiān)控與指示起到非常重要的作用,其使用和保存均應(yīng)有規(guī)范的記錄并應(yīng)統(tǒng)一或者定期對(duì)其有效性進(jìn)行監(jiān)控[11,16]。有的單位PCR檢測(cè)未設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,有的單位結(jié)果報(bào)告中電泳圖未作標(biāo)記。不滿意結(jié)果中有10次是因上述原因?qū)е碌摹?/p>

3.4 樣品接收時(shí)間

因能力測(cè)試項(xiàng)目參加單位較多,能力測(cè)試樣品分批次使用快遞發(fā)出,據(jù)統(tǒng)計(jì),接收樣品時(shí)間期限從2 d到5 d不等,樣品的性質(zhì)未受到氣溫等外界因素的影響。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示37 ℃放置9 d時(shí)仍能擴(kuò)增出目的條帶。

3.5 實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)能力的差異

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力,除了測(cè)試預(yù)期結(jié)果滿意外,其他的細(xì)節(jié),比如實(shí)驗(yàn)記錄、溝通交流、問(wèn)題處理等方面也可以全面反映出一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的綜合能力。通過(guò)此次能力測(cè)試活動(dòng),在參測(cè)實(shí)驗(yàn)室中確實(shí)存在能力參差不齊的情況。

能力測(cè)試項(xiàng)目開(kāi)展過(guò)程中,隨樣品寄送了測(cè)試項(xiàng)目的“作業(yè)指導(dǎo)書(shū)”,對(duì)參測(cè)單位的代碼、樣品的保存方式、狀態(tài)、采用標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果提交時(shí)間等信息做了詳盡的說(shuō)明。但部分實(shí)驗(yàn)室對(duì)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)重視度不夠,并未認(rèn)真閱讀和理解,從而影響檢測(cè)結(jié)果的判定。某些單位未按照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)要求提交完整的實(shí)驗(yàn)記錄,建議參加單位認(rèn)真閱讀“作業(yè)指導(dǎo)書(shū)”,嚴(yán)格按照指導(dǎo)書(shū)的要求撰寫(xiě)結(jié)果報(bào)告單和實(shí)驗(yàn)記錄。

4 結(jié)語(yǔ)

2018—2022年先后開(kāi)展的5次鯽造血器官壞死病病原檢測(cè)能力驗(yàn)證項(xiàng)目,檢測(cè)樣品為CyHV-2-pol、CyHV-2-hel病毒樣顆粒溶液與草魚(yú)組織勻漿液制備的盲樣,檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 36194—2018《金魚(yú)造血器官壞死病毒檢測(cè)方法》。經(jīng)統(tǒng)計(jì),2018年有67家單位參加能力驗(yàn)證測(cè)試,滿意率86.57%;2019年有71家單位參加能力驗(yàn)證測(cè)試,滿意率83.10%;2020年有74家單位參加能力驗(yàn)證測(cè)試,滿意率86.50%;2021年有106家單位參加能力驗(yàn)證測(cè)試,滿意率87.74%;2022年有92家單位參加能力驗(yàn)證測(cè)試,滿意率85.86%。除2019年滿意率稍低外,其余4年均超過(guò)85.00%。通過(guò)這5次能力驗(yàn)證活動(dòng),客觀反映了國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室CyHV-2核酸檢測(cè)技術(shù)水平較高,因技術(shù)問(wèn)題導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤的占不滿意結(jié)果的22.80%,今后還需在實(shí)驗(yàn)室管理和試驗(yàn)操作細(xì)節(jié)上嚴(yán)格控制[17]。因此,通過(guò)此項(xiàng)能力驗(yàn)證,表明大部分實(shí)驗(yàn)室具備了鯽造血器官壞死病病原檢測(cè)能力和質(zhì)量管理水平,可以承擔(dān)該病原的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)工作,同時(shí)各參加實(shí)驗(yàn)室有必要將實(shí)驗(yàn)室管理和技術(shù)人員能力測(cè)試考察工作長(zhǎng)期化,以期不斷提升和維持各實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力水平,為中國(guó)水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)和防控提供技術(shù)支持。