馬立杰,邵小達,趙晟,潘泓,趙婧,張映曈,凌軍,李鵬霞,4,黃雯,周宏勝,,4*

1(沈陽農業(yè)大學 食品學院,遼寧 沈陽,110866)2(昆山益群農產品有限公司,江蘇 蘇州,215300)3(江蘇省農業(yè)科學院,農業(yè)農村部農產品冷鏈物流技術重點實驗室,江蘇 南京,210014)4(江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室,江蘇 南京,210014)5(南京市蔬菜科學研究所,江蘇 南京,210042)

桃(PrunuspersicaL.)果實口感香甜,汁多味美,營養(yǎng)豐富,深受消費者的喜愛。果皮色澤是桃果實外觀的主要性狀之一,色澤鮮紅的果實容易引起消費者的購買欲望[1]?；ㄉ帐翘夜ど珴尚纬傻闹匾镔|[2],可使植物呈現(xiàn)出豐富的顏色[3]?；ㄉ站哂休^強的抗氧化能力,不僅具有抗衰老、保護視力等保健功能,還能提高植物抵抗逆境脅迫的能力[3-4]。桃果實套袋栽培可使果面潔凈、防止病蟲害的侵害[5],但遮光套袋采收會減少花色苷的合成和果實著色,影響了采后果實外觀品質和商品價值[1]。因此,尋求一種有效地促進套袋桃果實采后花色苷合成的方法具有重要的意義。

花色苷在植物體內的生物合成途徑已基本明確,其主要通過類黃酮類物質合成途徑合成[6]?；ㄉ盏暮铣墒芙Y構基因和調節(jié)基因的控制[7]:結構基因編碼花色苷生物合成途徑中的酶,調節(jié)基因主要為MYB、bHLH和WD40這三類轉錄因子基因[6]?；ㄉ盏暮铣墒加诒奖彼?經苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、查爾酮合成酶(chalcone synthase,CHS)、查爾酮異構酶(chalcone isomerase,CHI)、黃酮醇-3-羥化酶(flavonone 3-hydroxylase,F3H)、類黃酮-3′-羥化酶(flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H)、二氫黃酮醇-4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)、花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)和糖基轉移酶(UDP-glucose-flavonoid 3-O-glucosyltransferase,UFGT)等一系列酶催化,最終形成花色苷,隨后經谷胱甘肽S-轉移酶(glutathioneS-transferase,GST)轉運至液泡貯存[7-8]。苯丙氨酸是花色苷生物合成的前體,在其生物合成中發(fā)揮著重要的作用[6,9]。

苯丙氨酸作為一種芳香族氨基酸,是植物苯丙烷代謝的底物,在植物生長過程中有很重要的作用[10]。苯丙氨酸處理葉面可以降低灰霉菌對擬南芥、矮牽?；ê头阎仓甑慕?增強植株抗性[11];采后苯丙氨酸處理的番茄果實具有較高的酚類物質及抗氧化能力,降低了番茄果實冷害率[12];用含有苯丙氨酸的可食用涂層處理牛油果果實,可以降低果實腐爛率,保持果實的貯藏品質[13]。目前,外源苯丙氨酸處理對花色苷合成的作用正被逐漸探究:適當添加苯丙氨酸能促進野生型擬南芥合成更多的花色苷[14],葉面施用苯丙氨酸可以增加葡萄果實的花色苷含量[15]。本研究以套袋采收的桃果為材料,研究采后苯丙氨酸處理對桃果實貯藏期花色苷合成的影響,以期探討苯丙氨酸影響桃果實著色的初步機制,為苯丙氨酸在調控桃采后色澤形成中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗的桃品種為‘湖景蜜露’桃[Prunuspersica(L.) Batsch cv.‘Hujingmilu’],果實套“內黑外黃”雙層紙袋,桃果實在花后105 d進行采摘(果實七成熟),采摘地點為江蘇省徐州市的某果園。桃果實采后當天運至江蘇省農業(yè)科學院,挑選外觀、大小一致且無機械損傷,無病蟲害的桃果實作為實驗材料。

DL-苯丙氨酸(99%),北京百靈威科技有限公司;甲醇(分析純),上海凌峰化學試劑有限公司;鹽酸(分析純),南京化學試劑有限公司;氯化鉀(分析純),國藥集團化學有限公司;無水乙酸鈉(分析純),廣州市金華大化學試劑有限公司;β-巰基乙醇(99%),上海麥克林生物科技有限公司;FastPure Plant Total RNA Isolation Kit(Polysaccharides & Polyphenolics-rich)RNA提取試劑盒、HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)cDNA合成試劑盒,南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;CR-400型全自動測色色差儀,柯尼卡美能達株式會社(日本);UV-1102型紫外可見分光光度計,上海天美科學儀器有限公司;FM40型雪花制冰機,北京長流科學技術公司;Tissuelyser-64型多樣品組織研磨機,上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司;Centrifuge 5804R型離心機,德國艾本德公司;東勝龍EDC810型PCR儀,北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司;CFX Connect實時定量PCR儀,伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗材料的處理

參考SOGVAR等[16]的方法,略有改變,采用8 mmol/L 苯丙氨酸進行浸泡處理,對照組采用清水浸泡,均浸泡10 min處理。所有處理組浸泡完成后自然吹風晾干,將2組果實(8個一組)分別置于打孔的保鮮袋內,隨后放到室內常溫[(22±2) ℃,光照強度(200±50) Lux,模擬水果超市室內環(huán)境]條件下貯藏8 d,每個處理組設置3次重復實驗。在貯藏期間,每隔一天取樣,每組隨機取桃24個,用不銹鋼刀片分離桃果皮和果肉樣本,取桃果實整果果皮,將組織樣本置于液氮中速凍并存放在-80 ℃冰箱中,用于測定相關指標。

1.3.2 果皮色差的測定

參考田夢瑤等[1]的方法,并稍作改動。采用CR-400全自動色差儀對桃果實赤道部位相對的4個點進行果皮色差的測定,得到L*、a*和b*值,按公式(1)～公式(4)計算飽和度C*、色調值h、顏色指數(shù)(color index of red grape,CIRG)和總色差值ΔE:

(1)

(2)

(3)

(4)

1.3.3 總花色苷含量的測定

采用pH示差法[17]測定桃果皮中總花色苷含量。稱取0.8 g桃皮樣品,加入4.0 mL 95%(體積分數(shù))酸化甲醇(0.1 mol/L HCl),于黑暗條件下振蕩提取4 h后離心(10 000 r/min,20 min,4 ℃),取上清液備用。將上清液分別用0.025 mol/L KCl緩沖液(pH=1.0)和0.4 mol/L CH3COONa緩沖液(pH=4.5)稀釋,室溫下靜置15 min后測定溶液在520 nm和700 nm 下的吸光度值。根據(jù)公式(5)計算得出桃果皮中總花色苷含量:

(5)

式中:ΔA=(A520-A700)pH1.0-(A520-A700)pH4.5;Mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子質量,449.2 g/mol;DF為稀釋因子;V為提取液總體積,mL;ε為摩爾吸收率,26 900 L/(mol·cm);m為樣品質量,g;1為比色皿寬度1 cm。

1.3.4 桃果皮總RNA的提取及cDNA的合成

桃果皮總RNA提取參考FastPure Plant Total RNA Isolation Kit(Polysaccharides & Polyphenolics-rich)RNA提取試劑盒的產品說明,然后經HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)cDNA合成試劑盒的方法反轉錄成cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 qRT-PCR測定基因表達水平

花色苷合成相關基因引物序列參考相關文獻[18-19],具體的基因引物序列和內參基因TEF2的序列如表1所示。反應體系為:10 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix,0.4 μL正向引物,0.4 μL反向引物,2 μL DNA模板,7.2 μL ddH2O。采用2-ΔΔct法進行相對定量分析。

表1 花色苷合成相關基因引物序列Table 1 Sequence of primers for genes related to anthocyanin synthesis

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計,采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行t-test檢驗分析,比較差異顯著性(P<0.05),采用OriginPro 2021軟件進行繪圖。所有數(shù)據(jù)均平行測定3次。

2 結果與分析

2.1 苯丙氨酸處理對采后桃果皮著色的影響

苯丙氨酸處理對采后桃果皮著色的影響如圖1所示。由圖1可以看出,采收時桃果實表面偏白,對照組與苯丙氨酸組的桃果皮著色程度均隨著貯藏時間延長逐漸增加,但苯丙氨酸處理可以顯著提高桃果皮的著色程度。苯丙氨酸處理組桃果實的著色時間明顯早于對照組:貯藏第2天時苯丙氨酸組已出現(xiàn)明顯變紅,對照組剛開始著色;貯藏第4天時,苯丙氨酸組桃果皮表面已幾乎全部變?yōu)榧t色,對照組在貯藏第8天時桃果皮表面才全變?yōu)榧t色。苯丙氨酸處理組果實的著色程度也明顯高于對照組:貯藏第8天時,苯丙氨酸組桃果皮的紅色程度明顯地深于對照組,顏色更為鮮紅。

圖1 苯丙氨酸處理桃果實表型圖Fig.1 Fruit phenotype of peach treated with phenylalanine

2.2 苯丙氨酸處理對采后桃果皮色差的影響

色差是判斷色澤變化的重要數(shù)據(jù):其中ΔE值表明顏色的總體變化;a*值表示紅綠值,正值表示偏紅;L*值表示亮度,數(shù)值越大表示越白亮[20];CIRG值表示果實色澤,與花色苷含量有關[21]。由圖2-a可以看出,對照組和苯丙氨酸組果實的ΔE值在貯藏期間均逐漸上升,但苯丙氨酸組果實的ΔE值顯著高于對照組(P<0.05),說明苯丙氨酸組果實顏色變化最大。2組果實的L*值也隨著貯藏時間延長逐漸降低(圖2-b),表明果面色澤逐漸形成。紅色相關指標a*值和CIRG值變化趨勢一致,均呈上升趨勢(圖2-c和圖2-d),但苯丙氨酸組果實的a*值和CIRG值顯著高于對照組(P<0.05),說明苯丙氨酸處理明顯促進了果實表面紅色的形成。貯藏第2天,苯丙氨酸組a*值為正值,說明苯丙氨酸組果實已經出現(xiàn)紅色著色現(xiàn)象,貯藏第4天,對照組a*值達到正值,但僅為苯丙氨酸組的21.82%,表明苯丙氨酸組果實著色時間也明顯早于對照組。

a-ΔE值;b-L*值;c-a*值;d-CIRG值圖2 苯丙氨酸處理對采后桃果皮色差ΔE值、L*值、a*值和CIRG值的影響Fig.2 Effects of phenylalanine treatment on ΔE, L*, a* and CIRG values of postharvest peach peel color difference注:*表明同一貯藏時間下2種處理間具有顯著性差異(P<0.05)(下同)。

2.3 苯丙氨酸處理對采后桃果皮總花色苷含量的影響

花色苷是桃果皮呈色的主要物質,花色苷的含量可以表明色澤的變化[2]。由圖3可以看出,2組桃果皮總花色苷含量在貯藏期間均不斷上升,苯丙氨酸處理組的花色苷含量顯著高于對照組(P<0.05)。貯藏第2天時,苯丙氨酸組果皮的花色苷含量高出對照組4.86倍,顯著高于對照組(P<0.05),表明苯丙氨酸處理明顯加快了果實的著色。貯藏第8天,2組桃果皮花色苷含量均達到8 d貯藏期間的最大值,其中苯丙氨酸組果皮的花色苷含量是對照組的1.64倍,說明苯丙氨酸處理明顯提高采后桃果皮總花色苷含量。

圖3 苯丙氨酸處理對采后桃果皮總花色苷含量的影響Fig.3 Effects of phenylalanine treatment on total anthocyanins content in postharvest peach peel

2.4 苯丙氨酸處理對采后桃果皮花色苷合成和轉運相關基因表達的影響

花色苷的合成受多種結構基因和調控基因的控制,其中PAL,CHS,CHI,F3H,F3′H,DFR,ANS和UFGT基因是花色苷合成途徑的關鍵結構基因[22],GST基因是花色苷轉運途徑的關鍵基因[23]。如圖4所示,整個貯藏過程中2組桃果實的大多數(shù)結構基因的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,其中苯丙氨酸處理顯著促進了貯藏前期桃果皮中相關結構基因的表達。如圖4-a所示,貯藏第2天,第4天和第6天時,黃酮類化合物合成途徑的上游基因PAL在苯丙氨酸處理組中的表達量顯著高于對照組(P<0.05),且在第4天時達到貯藏期最高的峰值。苯丙氨酸處理也顯著促進了下游基因的表達,并且在第4天時達到最高峰值:苯丙氨酸處理組中CHS,CHI,F3H,DFR,ANS和UFGT基因在第4天時的表達量分別是對照組的6.79倍、9.85倍、5.26倍、3.16倍、2.56倍和1.33倍。貯藏第6天時,苯丙氨酸處理組中CHS,F3H,F3′H,ANS和UFGT基因的表達量顯著高于對照組(P<0.05)。苯丙氨酸處理也顯著地提升了花色苷轉運相關基因的表達量,貯藏第6天和第8天時,苯丙氨酸處理組中GST基因表達量分別為對照組的1.73和2.56倍。

a-PAL;b-CHS;c-CHI;d-F3H;e-F3′H;f-DFR;g-ANS;h-UFGT;i-GST圖4 苯丙氨酸處理對采后桃果皮花色苷代謝相關途徑關鍵基因的基因表達的影響Fig.4 Effects of phenylalanine treatment on gene expression of key genes related to anthocyanin metabolism in postharvest peach peel

2.5 苯丙氨酸處理對采后桃果皮MYB、bHLH和WD40類轉錄因子基因表達的影響

花色苷合成結構基因的表達受MYB、bHLH和WD40類轉錄因子以及其組成的MBW復合體調控[24]。如圖5-a所示,苯丙氨酸處理顯著促進了MYB10.1基因的表達,其表達量在貯藏第2天,第4天和第8天時均顯著高于對照組(P<0.05)。苯丙氨酸組的bHLH3和WD40-1基因表達量在貯藏期間均呈先上升后下降的趨勢,在貯藏第2天、第4天和第6天時,其基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)(圖5-b和圖5-c)。貯藏前4 d,苯丙氨酸處理顯著促進了MYB、bHLH和WD40類轉錄因子的基因表達,這與苯丙氨酸處理對大多數(shù)花色苷合成相關結構基因表達量變化趨勢的影響一致(圖4)。

a-MYB10.1;b-bHLH3;c-WD40-1圖5 苯丙氨酸處理對采后桃果皮轉錄因子MYB10.1、bHLH3和WD40-1基因表達的影響Fig.5 Effects of phenylalanine treatment on gene expression of transcription factors, MYB10.1, bHLH3, and WD40-1 in postharvest peach peel

3 討論

花色苷是桃果皮色澤形成的主要物質[2],但研究發(fā)現(xiàn)遮光套袋會影響采收果實花色苷的生物合成,導致果實外觀偏白[1,19]。花色苷合成途徑是目前研究的最清楚的植物次生代謝途徑之一,在一些模式植物和園藝作物上已經被清楚地闡明[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸是花色苷生物合成的前體物質,在其生物合成中發(fā)揮著重要的作用[6,9]。為了探究苯丙氨酸對套袋桃果實著色的影響,本研究以套袋采收的‘湖景蜜露’桃為實驗品種,發(fā)現(xiàn)采后苯丙氨酸浸泡處理可有效提早和增加桃果實著色(圖1),苯丙氨酸處理后桃果皮的花色苷含量顯著高于對照組,紅色相關色差值a*值和CIRG值也顯著提高(P<0.05)。EDAHIRO等[25]采用苯丙氨酸作為培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)產花色苷的草莓細胞,在一定濃度范圍內增加苯丙氨酸的量可以增加花色苷的產生量;SOGAVR等[16]發(fā)現(xiàn)外源苯丙氨酸處理提高了李果實花色苷、黃酮和酚類物質的含量,這些研究均與本研究結果一致,表明苯丙氨酸可在促進花色苷合成中發(fā)揮作用。PORTU等[15]發(fā)現(xiàn)葉面噴施苯丙氨酸和尿素可輕微促進Tempranillo葡萄總花色苷含量,但苯丙氨酸處理幾乎沒有增加Garnacha葡萄的總花色苷含量[26],這說明苯丙氨酸處理對果實花色苷積累可能具有多重性和復雜性。桃果實花色苷合成相關基因在果實采后著色過程中明顯地升高[19,27];BISWAS等[28]發(fā)現(xiàn)添加苯丙氨酸和水解乳蛋白能提高Panaxsikkimensis細胞的L-苯丙氨酸解氨酶、類黃酮半乳糖苷轉移酶活性和其基因的表達,提升花色苷的產量;AGHDAM等[12]發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸處理可以提升番茄果實L-苯丙氨酸解氨酶酶活性提高和酚類和黃酮類物質的積累。本研究發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸處理可以有效地促進花色苷合成途徑中相關基因的表達,特別是顯著促進了貯藏前期PAL、F3H、DFR基因和MYB10.1、bHLH3轉錄因子的表達(P<0.05),與前人結果一致[19,27]。這表明采后苯丙氨酸處理可能是通過促進桃花色苷合成相關基因的表達實現(xiàn)花色苷含量增加和促進著色的效果。目前關于苯丙氨酸在促進果實著色中的應用主要聚焦在采前階段:FANYUK等[29]發(fā)現(xiàn)采前2～4周施用苯丙氨酸可以促進芒果和蘋果果皮著色,GOHARI等[30]發(fā)現(xiàn)采前葉面施用殼聚糖結合苯丙氨酸的納米復合材料可以提高葡萄L-苯丙氨酸解氨酶酶活性和花色苷含量。本研究發(fā)現(xiàn)采后苯丙氨酸處理同樣可以促進套袋桃果皮花色苷合成和著色,為苯丙氨酸在桃采后色澤調控中的應用提供了新的思路。

4 結論

本研究以套袋采收的‘湖景蜜露’桃果實為實驗材料,探究了采后苯丙氨酸處理對桃果皮色澤形成的影響。結果表明,采后苯丙氨酸處理可以顯著提高采后桃果皮色差a*值、CIRG值和總花色苷含量,促進果皮的著色;苯丙氨酸處理可提升花色苷合成途徑相關結構基因和調節(jié)基因的表達量,有利于其花色苷的合成。本研究為苯丙氨酸在桃采后色澤調控中的應用提供了新的理論參考。