沈烈行，李群，岳峰梅，張蕊，高洪錄

（1. 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250021； 2. 山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014； 3. 東營(yíng)同安胸外科醫(yī)院，山東 東營(yíng) 257000）

DNA 條形碼技術(shù)（DNA barcoding）是近些年發(fā)展起來(lái)的分子鑒定的新型技術(shù)［1］，它是一段能代表生物遺傳特性的，相對(duì)較小的，容易擴(kuò)增的DNA 片段。近年間，我國(guó)應(yīng)用DNA 條形碼技術(shù)對(duì)蘚類、芍藥屬、烏頭屬等不同種屬展開科研并效果顯著。目前，對(duì)植物科屬的鑒定研究多采用ITS2 序列，并利用GenBank 中的樣本進(jìn)行了大量的試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明ITS2 序列不僅可以用在植物的鑒定研究上，在動(dòng)物上也是可行的。DNA 條形碼技術(shù)應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域、多個(gè)行業(yè)，針對(duì)不同的研究對(duì)象和內(nèi)容，尤其在保護(hù)生物學(xué)、監(jiān)管動(dòng)植物產(chǎn)品的非法交易、保護(hù)食品安全方面表現(xiàn)突出，提供了有效的鑒定方法。

桑白皮為臨床常用中藥，歷代本草多有記載，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列中品，原名“桑根白皮”，其余主流本草基本沿用“桑白皮”名稱。2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，桑白皮來(lái)源于?？浦参锷＃∕orus alba L.）的干燥根皮。味甘寒，歸肺、脾經(jīng)，具有瀉肺平喘、行水消腫之功效，主治肺熱喘咳、水腫脹滿尿少、面目肌膚水腫等癥，是中醫(yī)臨床常用的止咳平喘藥，用藥歷史悠久。

山東是我國(guó)重要的桑蠶養(yǎng)殖的基地，尤其是在膠東一帶更是如此，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在煙臺(tái)桑園里保存的種質(zhì)資源有300 余份。中藥桑白皮是桑蠶養(yǎng)殖業(yè)的副產(chǎn)品，其獲得途徑主要是廢棄的、生長(zhǎng)年限比較長(zhǎng)的老桑樹的根皮。在桑蠶養(yǎng)殖業(yè)中，桑樹的新品種是以地上部分，即葉、果等進(jìn)行區(qū)分，而且往往是在桑樹老樁上通過嫁接手段實(shí)現(xiàn)的。因此，作為養(yǎng)殖業(yè)的桑樹新品種，其作為藥用的樹根的根皮（桑白皮）究竟來(lái)源于什么品種，是否符合《中華人民共和國(guó)藥典》的藥用標(biāo)準(zhǔn)，有待于結(jié)合現(xiàn)代研究手段進(jìn)行深入研究。

DNA條形碼技術(shù)在鑒定植物種屬方面效果顯著［2-12］在其未出現(xiàn)之前對(duì)桑白皮的鑒別研究主要是基原、性狀、顯微、理化這四大傳統(tǒng)鑒定方法［13-16］。熊永興等［17］用DNA 條形碼技術(shù)對(duì)桑白皮及其混偽品進(jìn)行了鑒定研究，有效區(qū)分了桑白皮及其混偽品。

本研究采用ITS2 片段對(duì)采集自山東煙臺(tái)桑園的、有代表性的桑樹栽培品種的根皮即桑白皮樣品進(jìn)行基原鑒定，以確定樣本的基原物種，為進(jìn)一步的深入研究和桑樹的綜合應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

本研究所用桑白皮樣品分別采集自山東牟平栽培場(chǎng)（簡(jiǎn)稱牟平）及省桑蠶研究所桑園內(nèi)（簡(jiǎn)稱桑園），為桑園培育或栽培的桑樹優(yōu)良及推廣品種，詳見表1。所有樣品采集后立刻放入冰箱冷藏備用。

表1 桑白皮樣品采集信息表

1.2 試劑和儀器

離心機(jī)（5810R/5415D，德國(guó)Eppendorf公司）；冰箱（BCD－178CN，中國(guó)新飛）；上部卸料離心機(jī)（SSC 型，中國(guó)捷達(dá)）；PCR 儀（96 普通型，中國(guó)領(lǐng)宇科技）；測(cè)序儀（3730，美國(guó)ABI 公司）；電子天平（BSM120.4，上海卓精電子科技有限公司）；球磨儀（MM400，德國(guó)萊馳）；電泳儀（JY1000C，北京君意）；水浴鍋（HH－4Y，中國(guó)啟前）。

Plant Genomic DNA Kit 植物基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型，天根生化科技北京有限公司，批號(hào)：DP305）；Platinum?Taq DNA Polymerase［Thermo Fisher、10 × PCR Buffer，Mg2+（50 mmol/L）］；10 μM dNTP Solution（Thermo Fisher）；CTAB提取液（2% CTAB，100 mmol/L pH8.0 Tris－HCl，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA）；液氮；TE緩沖液（10 mmol/L Tris－Hcl，1 mmol/L EDTA pH值8）。

β－巰基乙醇（今品化學(xué)技術(shù)上海有限公司），氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），均為分析純。

1.3 提取DNA

取各樣品新鮮根皮組織約30 mg，加入液氮充分研磨。使用植物基因組DNA 試劑盒按照說明書提取DNA。

1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增和測(cè)序

采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后再進(jìn)行雙向測(cè)序。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增物由上海生工生物有限公司（合成）。ITS2F：5'－ATGC GATA CTTG GTGT GAAT－3' ；ITS3R：5' －GACG CTTC TCCA GACT ACAAT－3'。PCR 反應(yīng)體系中各組分、 PCR 反應(yīng)條件分別見表2和表3。

表2 PCR體系中各組分的體積

表3 PCR反應(yīng)條件

1.5 數(shù)據(jù)分析

序列拼接時(shí)應(yīng)用CodonCode Aligner 2.06（CondonCode Co，USA）軟件進(jìn)行序列拼接及校對(duì)。首先進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及預(yù)處理，即去除測(cè)序結(jié)果兩端的低質(zhì)量部分，并對(duì)剩余部分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，如果滿足質(zhì)量要求，方可用于序列拼接，對(duì)于ITS2 序列，根據(jù)Hidden Markov Model（HMM）模型，去除序列兩端5.8 s和28 s 基因區(qū)，獲得完整的ITS2 基因間隔區(qū)序列［18］。然后根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 鑒定以及進(jìn)行DNA條形碼鑒定系統(tǒng)鑒定。

2 結(jié)果

2.1 DNA定量結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果顯示10個(gè)樣本DNA含量合格，符合測(cè)序要求，結(jié)果見表4和圖1。

圖1 DNA條帶結(jié)果

表4 DNA定量檢測(cè)結(jié)果

2.2 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)結(jié)果

電泳檢測(cè)DNA完整性及DNA殘留情況結(jié)果顯示，10個(gè)樣本的DNA完整性較好，可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序。見圖2。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 測(cè)序結(jié)果

樣品PCR 擴(kuò)增測(cè)序后，去除序列兩端5.8 s 和28 s基因區(qū)，獲得基因間隔區(qū)序列，幾個(gè)基因的間隔區(qū)序列完全一致。

2.4 BLAST鑒定結(jié)果

2.4.1 DNA條形碼鑒定系統(tǒng)鑒定

經(jīng)DNA條形碼鑒定系統(tǒng)鑒定，結(jié)果顯示10個(gè)樣本與表內(nèi)物種序列相似度100%，可鑒定為桑屬。結(jié)果見表5。

表5 序列對(duì)比信息表

2.4.2 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST鑒定

結(jié)合 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST 鑒定結(jié)果，所采集的桑白皮樣品皆為桑屬（Morus）。見圖3。

圖3 BLAST鑒定圖

3 討論

桑白皮原植物桑樹資源十分豐富，目前市場(chǎng)藥材來(lái)源桑種包含《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的桑（Morus albaL.）等在內(nèi)的多種來(lái)源，既有野生，也有家種。由于采收時(shí)須毀樹挖根，因此古代桑白皮主要來(lái)源于野生桑樹的可能性較大。歷史上桑類中藥的原植物確為多種桑樹，桑類中藥的不少藥材來(lái)源于養(yǎng)蠶業(yè)的剩余物，因而桑類中藥的原植物來(lái)源于某一種桑樹的可能性很小。當(dāng)今中國(guó)桑樹資源源于不同桑種的桑樹栽培品種上千余個(gè)，僅山東煙臺(tái)保存的種質(zhì)資源就超過300 份，而各地推廣的品種多是為桑蠶業(yè)改良，亦因追求產(chǎn)葉量而經(jīng)常改變。同時(shí)，由于桑樹易于自然雜交，人工雜交的品種亦層出不窮，雖然歷版《中華人民共和國(guó)藥典》中，桑類中藥的原植物Morus albaL.，但是一方面尋找純粹的Morus albaL. 已非易事，另一方面，如果將非Morus albaL. 的桑樹排除在桑類中藥原植物之外的話，也無(wú)助于改變長(zhǎng)期以來(lái)養(yǎng)蠶后桑樹資源嚴(yán)重浪費(fèi)的現(xiàn)狀，不利于資源的有效利用。

中藥桑白皮具有明確的藥用療效和使用價(jià)值，在臨床上應(yīng)用也十分廣泛。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)山東產(chǎn)或栽培的不同批次的792、湖桑、農(nóng)桑、雞冠魯桑等進(jìn)行基原鑒別研究，通過DNA 條形碼技術(shù)對(duì)ITS2基因間隔區(qū)序列進(jìn)行一一比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有目標(biāo)樣品都為桑屬，為進(jìn)一步研究和不同品種桑樹的綜合應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

本文再次證明ITS2 序列鑒定相比傳統(tǒng)鑒別方法更優(yōu)，效果更明顯，是一種有效、精確的鑒定方法。但是此技術(shù)并不是十全十美，依舊存在著諸多缺陷和挑戰(zhàn)，更不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)鑒定方法。不同的藥材具有不同的入藥部位，若由于環(huán)境、操作、貯存等諸多因素導(dǎo)致DNA 降解過多，必然會(huì)影響鑒定的準(zhǔn)確性。倘若在實(shí)際操作中需要鑒定某一中藥材，除用此技術(shù)外，還需輔以其他方法進(jìn)行藥材的綜合鑒定，以確保鑒定結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。