熊潤秋，高月，陳魯

（1. 山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250014； 2. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014）

功能性便秘（functional constipation，F(xiàn)C）是指排便次數(shù)減少或糞便干硬難以排出，是兒童期最常見的消化系統(tǒng)疾病之一，國外一項系統(tǒng)性回顧研究顯示， 全球兒童FC 平均患病率為9.5%［1］。便秘發(fā)病原因不甚明朗，且持續(xù)時間長，影響患兒生活質量［2］?，F(xiàn)代醫(yī)學治療功能性便秘的藥物主要是以滲透性瀉藥、刺激性瀉藥、腸道促分泌劑、5－HT4受體激動劑、膽汁酸轉運抑制劑以及腸道微生態(tài)治療為主［3］，現(xiàn)有適合兒童的藥物較少且治療大多以解決癥狀為目的，易反復、產生依賴性，故中藥治療便秘具有巨大的研究價值。小兒臟腑嬌嫩，形氣未充，飲食不能自節(jié)，加之肺常不足、脾常不足，故氣虛便秘為其臨床常見證型，益氣潤腸方為借助中醫(yī)傳承輔助平臺并結合小兒生理、病理特點以及臨床經驗篩選而成［4］，在臨床運用中取得顯著療效。本文通過對氣虛型便秘大鼠一般情況及其對結腸組織血管活性腸肽（VIP）/環(huán)磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）/水通道蛋白3（AQP3）通路的影響，進一步探討益氣潤腸方的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

4 周齡SPF 級SD 雄性大鼠48 只，許可證號：SCXK（魯）20190003，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，體質量（180 ± 10）g，實驗單位使用許可證編號：SYXK（魯）20170022。實驗動物飼養(yǎng)于山東省中醫(yī)院動物實驗中心屏障環(huán)境中，適應性飼養(yǎng)1周，自由飲水采食。

1.2 藥物

益氣潤腸方組方：黃芪24 g，白術24 g，火麻仁6 g，陳皮6 g，肉蓯蓉12 g，生地黃12 g，麥冬12 g，玄參12 g，當歸12 g和甘草3 g；所有飲片均來自于山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院。洛哌丁胺膠囊（西安楊森制藥有限公司，國藥準字H10910085）；乳果糖口服溶液（北京韓美藥品有限公司，國藥準字H20065730）。益氣潤腸方按原方比例混合后加入沒過藥面約一指節(jié)的蒸餾水，大火燒開后轉小火熬15 min，收集藥液，再次加入蒸餾水大火燒開后轉小火熬煮20 min，兩次藥液混合后濃縮；洛哌丁胺灌胃前予生理鹽水配置混懸液，乳果糖灌胃前予生理鹽水稀釋。

1.3 主要儀器與試劑

KZ－Ⅲ－F 低溫型研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Protein Simple 公司）；電泳儀（BIO－RAD）；RIPA裂解液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；PMSF（武漢賽維爾生物科技有限公司）；BCA 蛋白定量檢測試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）；10% SDS－PAGE 凝膠制備試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）；5 × 蛋白上樣緩沖液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；蛋白預染Marker（Vazyme）；HRP 標記的山羊抗兔二抗（武漢賽維爾生物科技有限公司）；Anti－Aquaporin 3 Rabbit pAb（武漢賽維爾生物科技有限公司）；Anti－VIP Rabbit pAb（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 動物模型制備

將SD大鼠隨機分為空白組8只及模型組40只，空白組每日予生理鹽水灌胃，模型組每日予洛哌丁胺混懸液3 mg/（kg·d）灌胃并同時采用饑飽飲食法［5］，每隔5 d稱重調整用藥劑量，連續(xù)2周，建立氣虛便秘大鼠模型。2周后將8只空白組大鼠以及隨機選取的模型組8只大鼠稱重，放入獨立代謝籠中24 h，收集糞便，稱取糞便重量，結果顯示空白組糞便重量及粒數(shù)分別為（18.44 ±5.68）g及（62.89 ± 13.23）粒，模型組糞便重量及糞便粒數(shù)分別為（9.40 ± 9.88）g及（36.40 ± 10.77）粒，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.01），表示造模成功。

2.2 分組及給藥方法

8 只空白組大鼠每日繼續(xù)予生理鹽水灌胃，40 只造模成功大鼠隨機分為模型組、乳果糖組和益氣潤腸方高、中、低劑量組，每組8只，模型組大鼠每日予生理鹽水灌胃，乳果糖組每日給予乳果糖1.67 g/（kg·d）灌胃，益氣潤腸方低、中、高劑量組每日給予益氣潤腸方4.375、8.75、17.5 g/（kg·d）灌胃，持續(xù)2 周。灌胃結束后，益氣潤腸方中劑量組及高劑量組各因灌胃不當致死亡脫落1只大鼠。

2.3 檢測指標與方法

2.3.1 大鼠體質量、糞便粒數(shù)、糞便濕重及糞便含水率的測定

灌胃1 周及2 周測量大鼠體質量，給藥結束后，將每組大鼠隨機選取5 只放入獨立代謝籠中，收集24 h糞便，稱取糞便濕重，常溫晾干后稱取糞便干重，計算糞便含水率。

糞便含水率（%） = ［（糞便濕重 - 糞便干重）/糞便濕重］ × 100%

2.3.2 HE染色法觀察結腸病理變化

禁食不禁水12 h 后麻醉大鼠，取約0.5 cm 結腸組織立即放入4%多聚甲醛中固定，后進行酒精梯度脫水、浸蠟、包埋、切片，蘇木精、伊紅進行染色，梯度脫水、脫蠟后中性樹膠封固，顯微鏡下觀察結腸病理變化情況。

2.3.3 qPCR 檢測結腸組織VIP、cAMP、PKA、AQP3 mRNA的表達

使用TRIzol 試劑提取結腸組織總RNA，Nanodrop 2 000 檢測RNA 濃度及純度，稀釋使其終濃度為200 ng/μL，將RNA 逆轉錄為cDNA，再根據(jù)PCR 試劑盒說明書制備反應體系及引物于PCR 儀上完成擴增，反應條件為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性15 s；60 ℃延伸30 s；60 ℃退火30 s；40 個循環(huán)，繪制溶解曲線，根據(jù)各組的 Ct 值，通過內參數(shù)值和目的基因數(shù)值，計算 ΔCt和 ΔΔCt，得出 2-ΔΔCt，以GAPDH 為內參。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

2.3.4 蛋白免疫印跡分析法（Western blot）檢測大鼠結腸組織VIP、AQP3蛋白表達量

大鼠麻醉后取結腸組織，立即放入液氮中后轉入-80 ℃冰箱中冷凍保存。每組取50 mg 組織用裂解液裂解，離心后取上清液，BCA 法進行蛋白定量后，12% SDS－PAGE 分離，濕轉法將蛋白轉移到激活后的PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉，洗膜后一抗孵育過夜，充分洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h，最后加入ECL 發(fā)光試劑使用全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)掃描拍照并用ImageJ進行灰度值分析，結果重復3個批次。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況及糞便

益氣潤腸方可顯著增加便秘大鼠糞便重量及糞便粒數(shù)，改善便秘大鼠身體狀況，增加便秘大鼠體質量，但糞便含水率無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）。與空白組比較，模型組大鼠體質量明顯降低（P< 0.01），糞便濕重及粒數(shù)明顯減少（P< 0.01），糞便含水量無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）；與模型組比較，益氣潤腸方低、中、高劑量組和乳果糖組體質量明顯增高（P< 0.01，P<0.05），糞便濕重增加、糞便粒數(shù)增多（P< 0.05，P<0.01）， 但糞便含水率無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）。與乳果糖組比較，益氣潤腸方中、高劑量組糞便濕重明顯增加、糞便粒數(shù)顯著增多（P< 0.05）。見表2。

表2 各組大鼠體質量、糞便濕重、糞便粒數(shù)及糞便含水率的比較（ ± s）

表2 各組大鼠體質量、糞便濕重、糞便粒數(shù)及糞便含水率的比較（ ± s）

注：與空白組比較，△P < 0.01；與模型組比較，#P < 0.05，*P < 0.01；與乳果糖組比較，▲P < 0.05。

組別空白組模型組乳果糖組益氣潤腸方低劑量組益氣潤腸方中劑量組益氣潤腸方高劑量組n5 5 5 5 5 5造模1周后體質量/g 275.13 ± 11.81 224.88 ± 7.83△229.88 ± 9，20#232.88 ± 6.73#235.63 ± 11.92#233.75 ± 12.08#造模2周后體質量/g 330.88 ± 13.63 288.13 ± 21.05△298.13 ± 14.60#315.75 ± 12.01*313.57 ± 9.50#318.00 ± 12.77*糞便濕重/g 13.60 ± 4.16 5.40 ± 3.29△8.60 ± 4.93#9.80 ± 3.12#15.40 ± 2.61*▲15.00 ± 3.87*▲糞便粒數(shù)/粒34.20 ± 18.02 14.60 ± 6.43△18.20 ± 8.04#27.00 ± 12.81#33.80 ± 13.07*▲35.60 ± 19.87*▲糞便含水率/%66.67 ± 11.18 52.94 ± 13.56 58.14 ± 8.53 63.27 ± 6.72 62.34 ± 7.36 58.67 ± 4.91

3.2 各組大鼠結腸HE染色觀察

HE 染色可見，空白組黏膜層上皮細胞完整，并且排列整齊、規(guī)則，杯狀細胞數(shù)目多并且形態(tài)正常；模型組黏膜層上皮細胞破損、缺失，形態(tài)紊亂，杯狀細胞減少，腺體形態(tài)異常，有大量炎性細胞浸潤；乳果糖組結腸腺形態(tài)正常，杯狀細胞較多，但固有層有大量炎細胞浸潤；中藥低劑量組偶見黏膜層上皮細胞破損、缺失，杯狀細胞數(shù)目較模型組增多且形態(tài)正常，腺體結構偶見異常；益氣潤腸方中劑量組及高劑量組黏膜層上皮細胞結構較完整且排列整齊、規(guī)則，杯狀細胞數(shù)目多且形態(tài)正常，腺體結構正常，未見炎細胞浸潤。見圖1。可見益氣潤腸方可以改善洛哌丁胺造成便秘大鼠的腸道病理形態(tài)損害。

圖1 各組大鼠腸道病理損害HE染色圖（× 200）

3.3 各組大鼠結腸組織VIP、cAMP、PKA、AQP3 mRNA表達的比較

與空白組比較，模型組VIP、cAMP、PKA、AQP3 mRNA 表達明顯降低（P< 0.01，P< 0.05）；與模型組比較，乳果糖組及益氣潤腸方各劑量組VIP、cAMP、PKA、AQP3mRNA 表達升高（P< 0.05，P< 0.01），其中益氣潤腸方高劑量組最為顯著（P< 0.01）。見表3。

表3 各組大鼠結腸組織VIP、cAMP、PKA、AQP3 mRNA表達的比較（ ± s）

表3 各組大鼠結腸組織VIP、cAMP、PKA、AQP3 mRNA表達的比較（ ± s）

注：與空白組比較，△P < 0.01，△△P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05，*P < 0.01；與乳果糖組比較，▲P < 0.05。

組別空白組模型組乳果糖組益氣潤腸方低劑量組益氣潤腸方中劑量組益氣潤腸方高劑量組n3 3 3 3 3 3 VIP 1.00 ± 0.10 0.08 ± 0.01△△0.55 ± 0.25#0.13 ± 0.09#0.10 ± 0.43 1.99 ± 0.36*▲cAMP 1.00 ± 0.15 0.02 ± 0.01△△0.05 ± 0.00#0.64 ± 0.30*0.83 ± 0.40*4.19 ± 1.34*▲PKA 1.00 ± 0.14 0.75 ± 0.08△0.90 ± 0.08#0.76 ± 0.02 1.90 ± 0.10#2.19 ± 0.33*▲AQP3 1.00 ± 0.22 0.15 ± 0.05△△0.39 ± 0.10#0.34 ± 0.07#0.28 ± 0.04 2.14 ± 0.17*▲

3.4 各組大鼠結腸組織VIP、AQP3蛋白表達的比較

蛋白免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，相較于空白組，模型組結腸組織中的VIP、AQP3 的蛋白表達量明顯降低（P<0.01），經乳果糖及益氣潤腸方各劑量組治療后，VIP及AQP3的表達水平明顯升高（P< 0.05），益氣潤腸方低、中劑量的益氣潤腸方提升VIP 表達水平略遜于乳果糖，高劑量的益氣潤腸方能顯著提高VIP 的蛋白表達水平；相較于乳果糖組，益氣潤腸方提高AQP3 蛋白表達的能力更強，且呈劑量依賴性，益氣潤腸方高劑量組能顯著提升AQP3的蛋白表達。見圖2。

圖2 各組大鼠VIP、AQP3蛋白表達情況比較

4 討論

小兒臟腑嬌嫩，形氣未充，飲食不能自節(jié)，加之肺常不足、脾常不足，故氣虛便秘為其常見證型，小兒腎常虛，故治療便秘時常加入補腎益精之品。益氣潤腸方來源于黃芪湯加味，在黃芪湯基礎上加用補氣健脾之白術，補腎益精通便之肉蓯蓉二藥，意在加強補氣健脾之功，同時佐以補腎填精滋陰。方中黃芪為補氣健脾第一要藥，白術為生，可益氣健脾，專補脾陰不足，為治便秘之良藥，《傷寒論》中已有白術治療便秘之記載，現(xiàn)代藥理研究也發(fā)現(xiàn)白術中的蒼術酮可使平滑肌收縮，促進胃腸運動來治療便秘［6］，此二藥等量而用，同為君藥，共奏補氣健脾、潤腸通便之用。陳皮歸肺、脾經，助白術、黃芪補氣健脾之功，同時陳皮入肺經，肺與大腸相表里，有助通腑之力。當歸除歸肝、心經外亦歸于脾經，陳士鐸對其治療便秘有極高的評價，稱“大便燥結，非君之以當歸，則硬糞不能下”［7］。有研究表明當歸可影響水通道蛋白4（AQP4）的表達水平治療便秘［8］。火麻仁歸脾、胃及大腸經，可潤腸通便，有藥理研究表明火麻仁的主要成分火麻仁油可以調節(jié)腸道菌群結構，起到通便的作用［9］。玄參、生地黃、麥冬三藥組成增液湯，有“寓泄于補，增水行舟”之效。現(xiàn)代藥理學研究表明，麥冬中的麥冬多糖可以促進小鼠腸道菌群多樣性，增強腸道益生菌的增殖［10］。三藥都可增強其免疫力［11-13］。肉蓯蓉不僅歸于腎經，亦歸于大腸經，可增強潤腸通便之力，又不失其補腎益精之功。甘草調和諸藥。

血管活性腸肽（VIP）為研究最為深入的腸神經遞質之一，可以介導廣泛的胃腸道功能，如調節(jié)胃酸分泌、腸道陰離子分泌、胰腺酶釋放、細胞運動、血管擴張和腸道運動等。可以增加細胞內環(huán)磷酸腺苷（cAMP），從而激活蛋白激酶A（PKA），此外，VIP 還增加調節(jié)性T 細胞的產生，同時抑制巨噬細胞的促炎作用，從而有助于其抗炎作用［14］。這可能就是益氣潤腸方各劑量組炎性細胞浸潤減輕的原因。雖然VIP 為抑制性腸神經遞質，但有研究表明，VIP 含量降低，可能會減弱結腸的有效推動［15］。

水通道蛋白（AQPs）在人體的水運輸系統(tǒng)中扮演著重要角色，目前已發(fā)現(xiàn)13 種，早期研究中發(fā)現(xiàn)，其中的AQP3 在大鼠結腸中的分布和人相似［16］。AQP3 在結腸中的表達水平在滲透性瀉藥和刺激性瀉藥的通便作用中起著重要作用［17］。研究發(fā)現(xiàn)，細胞內 Mg2+濃度升高可激活AC－cAMP－PKA 信號通路，從而導致AQP3 基因表達長期上調，為MgSO4導瀉機制之一［18］。大黃素可以上調AQP3 的表達水平從而達到通便的作用［19］，占煜等［20］認為眾多藥物通便的生物學基礎可能是通過調控細胞膜上AQP3 的表達來調節(jié)水運輸?shù)男?，進一步對結腸的水液代謝產生影響。VIP 可調控AQP3表達水平，是通過cAMP/PKA通路實現(xiàn)的［21-22］。

綜上所述，益氣潤腸方治療便秘，其機制可能是通過調控VIP－cAMP－PKA－AQP3 信號通路來實現(xiàn)的。值得思考的是，目前許多研究VIP－cAMPPKA－AQP3 信號通路的表達水平與便秘關系的研究結果不甚一致，還需進一步探討。