周佳俞，陳麗，康瀚云，丁雅容，王巍，袁忠行，雷嘉欣，周忠志

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208； 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

糖尿病及其并發(fā)癥已成為嚴(yán)重影響人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題之一，國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）統(tǒng)計(jì)顯示，截至2021年我國糖尿病患者超過1.4億人，其中糖尿病創(chuàng)面發(fā)病率高達(dá)20%［1］，給家庭和社會(huì)帶來了沉重負(fù)擔(dān)。糖尿病創(chuàng)面多發(fā)展為慢性難愈性創(chuàng)面，患者患病日久、體弱納差、創(chuàng)面色澤晦暗、生長(zhǎng)遲緩、遷延難愈，中醫(yī)辨證為“陰證”范疇［2］。為了進(jìn)一步探究糖尿病創(chuàng)面的病因病機(jī)與治療方法，建立穩(wěn)定的高質(zhì)量動(dòng)物模型是當(dāng)務(wù)之急。目前制備糖尿病、陰證等動(dòng)物模型的方法多樣［3-4］，但仍然存在造模方法不統(tǒng)一、模型不穩(wěn)定、可重復(fù)性不高等問題。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)糖尿病創(chuàng)面特點(diǎn)并結(jié)合前期研究基礎(chǔ)建立糖尿病陰證創(chuàng)面動(dòng)物模型，從動(dòng)物體征、創(chuàng)面病理改變等角度進(jìn)行評(píng)價(jià)，意在對(duì)相關(guān)模型的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠（湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），36 只，體質(zhì)量180～200 g。飼養(yǎng)條件：溫度22 ℃左右，相對(duì)濕度40%～60%，每12 h 光照、黑暗交替，獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)（IVC），3 只一籠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：1107272011007366；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（湘）2019－0004；實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2019－0009；本研究已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)審批，批準(zhǔn)號(hào)：LL2020071401。

1.1.2 主要試劑

高脂乳劑組成：精制豬油（產(chǎn)品標(biāo)志號(hào)：GB/T8937）；6－正丙基－2－硫代尿嘧啶（上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：530643）；膽酸鈉（上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：S30219）；膽固醇（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號(hào)：C8280）；吐溫－80（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號(hào)：T8360）；1，2－丙二醇（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號(hào)：YZ－190001）。SPF 級(jí)大小鼠維持飼料（華阜康公司，貨號(hào)：1022）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號(hào)：S8050）；0.1%檸檬酸鈉緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號(hào)：C1013）；戊巴比妥鈉（西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，貨號(hào)：11715）；氫化可的松（上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：B61935）；蘇木素、伊紅、返藍(lán)液（塞維爾生物科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器

微單相機(jī)［索尼（中國）有限公司］；切片機(jī)、顯微鏡（徠卡公司）；數(shù)字切片掃描系統(tǒng)（3DHISTECH 公司）；YK－8 生物組織攤烤片機(jī)（湖北耀楚醫(yī)療器械科技有限公司）。

1.2 分組與模型建立

36 只SD 大鼠，隨機(jī)分為正常創(chuàng)面組、糖尿病創(chuàng)面組和糖尿病陰證創(chuàng)面組。適應(yīng)性喂養(yǎng)后給予充足飲食，除正常創(chuàng)面組外，其余兩組大鼠連續(xù)14 d灌胃高脂乳2 mL/d［5］，選擇一次性腹腔注射50 mg/kg STZ-檸檬酸鈉混合液，同期正常創(chuàng)面組大鼠灌胃飲用水、腹腔注射生理鹽水。尾靜脈采血測(cè)定大鼠血糖值，若血糖值連續(xù)3 d ≥ 16.7 mmol/L，并糖耐量試驗(yàn)陽性，則認(rèn)為糖尿病造模成功。

糖尿病陰證創(chuàng)面組大鼠按2 mL/kg劑量，連續(xù)7 d左右腿交替肌內(nèi)注射氫化可的松注射液，其余組注射等量生理鹽水。若大鼠創(chuàng)面滲液清稀、肉色灰暗，表現(xiàn)出喜靜懶動(dòng)、納差便溏、體質(zhì)量減低等陰證癥狀，則認(rèn)為糖尿病陰證造模成功。造模成功后第1 天各組大鼠麻醉后備皮、消毒，然后在背部裸區(qū)距正中線1.5 cm處，手術(shù)構(gòu)建全層皮膚缺損創(chuàng)面，術(shù)后置于電熱毯保溫，若術(shù)后及時(shí)恢復(fù)活動(dòng)，3 d未出現(xiàn)死亡，則認(rèn)為創(chuàng)面造模成功。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般情況

以3 d 為周期測(cè)量并記錄每只大鼠體質(zhì)量、飲食、飲水、隨機(jī)血糖。

1.3.2 糖耐量檢測(cè)

口服糖耐量（OGTT）試驗(yàn)：隨機(jī)選取每組大鼠各10 只，禁食不禁水過夜，然后給予50%葡萄糖溶液（2 g/kg）灌胃，分別于灌胃后0、30、60、120 min 測(cè)量大鼠尾靜脈血血糖值。

1.3.3 創(chuàng)面愈合情況

肉眼觀察各組大鼠的創(chuàng)面顏色、創(chuàng)面形狀、腫脹程度、滲液量、皮膚收縮情況。在造模后、第7、14 天放置標(biāo)尺于創(chuàng)面相機(jī)拍照，并使用Image J 圖像分析軟件獲取創(chuàng)面面積數(shù)據(jù)，計(jì)算愈合面積所占百分比（A）。

A（%） = （造模前創(chuàng)面面積-造模后創(chuàng)面面積）/造模后創(chuàng)面面積 × 100%

1.3.4 病理形態(tài)觀察

處死后取材皮膚組織、胰腺檢測(cè)。脫水、包埋、切片、脫蠟、HE 染色、中性樹脂封片，使用3DHISTECH SlideViewer系統(tǒng)閱片并拍攝圖片。

1.3.5 臟器指數(shù)

大鼠取材時(shí)選取腎、脾、腎上腺、胸腺，稱濕重，用取材時(shí)體質(zhì)量計(jì)算器官體質(zhì)量分?jǐn)?shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，運(yùn)用ANOVA單因素方差分析方法。P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠成模率、死亡率統(tǒng)計(jì)

動(dòng)物飼養(yǎng)與灌胃期間，大鼠健康活潑，狀態(tài)良好，糖尿病造模后血糖不達(dá)標(biāo)大鼠1 只，陰證造模后飼養(yǎng)后期，因虛弱死亡大鼠1 只，均予剔除數(shù)據(jù)。糖尿病創(chuàng)面組與糖尿病陰證創(chuàng)面組造模成功率均為91.7%。結(jié)果見表1。

表1 造模成功率及失敗原因

2.2 飲食、飲水、體質(zhì)量情況比較

實(shí)驗(yàn)期間大鼠的體質(zhì)量、飲食飲水量緩慢增長(zhǎng)。糖尿病造模后，糖尿病創(chuàng)面組、糖尿病陰證創(chuàng)面組大鼠較正常創(chuàng)面組出現(xiàn)明顯的多飲多食現(xiàn)象，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），創(chuàng)面造模后糖尿病創(chuàng)面組比糖尿病陰證創(chuàng)面組變化更顯著（P< 0.05）；正常創(chuàng)面組大鼠體質(zhì)量持續(xù)增長(zhǎng)，糖尿病創(chuàng)面組和糖尿病陰證創(chuàng)面組大鼠于創(chuàng)面造模后體質(zhì)量明顯下降，低于正常創(chuàng)面組大鼠（P< 0.05），其中糖尿病陰證創(chuàng)面組較糖尿病創(chuàng)面組降幅更大（P< 0.05）。結(jié)果見圖1～圖3。

圖1 各時(shí)間點(diǎn)不同組別大鼠飲食量變化趨勢(shì)折線圖

圖2 各時(shí)間點(diǎn)不同組別大鼠飲水量變化趨勢(shì)折線圖

圖3 各時(shí)間點(diǎn)不同組別大鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)折線圖

2.3 血糖

糖尿病造模前，3 組大鼠隨機(jī)血糖濃度均屬正常范圍，血糖值低于16.7 mmol/L。糖尿病造模后，糖尿病創(chuàng)面組與糖尿病陰證創(chuàng)面組大鼠血糖濃度明顯高于正常創(chuàng)面組（17.1～26.2 mmol/L），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。結(jié)果見圖4。

圖4 各時(shí)間點(diǎn)不同組別大鼠血糖變化趨勢(shì)折線圖

2.4 OGTT試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

OGTT 試驗(yàn)結(jié)果表明，正常創(chuàng)面組、糖尿病創(chuàng)面組及糖尿病陰證創(chuàng)面組在未給予葡萄糖負(fù)荷前，均表現(xiàn)為非高血糖狀態(tài)（ < 13.6 mmol/L）。給予葡萄糖負(fù)荷后，正常創(chuàng)面組血糖出現(xiàn)上升且在30 min達(dá)到高峰，而后逐步下降，全程未出現(xiàn)高血糖狀態(tài)。而糖尿病創(chuàng)面組及糖尿病陰證創(chuàng)面組血糖值高居不下，血糖清除明顯減緩，30、60、120 min均高于正常創(chuàng)面組且表現(xiàn)為高血糖狀態(tài)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01）。以上結(jié)果說明，糖尿病創(chuàng)面組及糖尿病陰證創(chuàng)面組大鼠存在胰島素抵抗。結(jié)果見圖5。

圖5 OGTT試驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)各組平均血糖曲線

2.5 臟器指數(shù)

取材后，糖尿病陰證創(chuàng)面組大鼠腎臟、脾臟、腎上腺、胸腺臟器指數(shù)均低于其余兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05，P< 0.01）；糖尿病創(chuàng)面組各類臟器指數(shù)高于正常創(chuàng)面組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。結(jié)果見表2和表3。

表2 各組7 d臟器指數(shù)比較（ ± s，%）

表2 各組7 d臟器指數(shù)比較（ ± s，%）

注：與正常創(chuàng)面組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與糖尿病創(chuàng)面組比較，##P < 0.01。

組別正常創(chuàng)面組糖尿病創(chuàng)面組糖尿病陰證創(chuàng)面組F值P值n6 5 5臟器指數(shù)/%腎臟0.604 ± 0.018 0.730 ± 0.014**0.594 ± 0.032##58.694 0.000脾臟0.256 ± 0.010 0.287 ± 0.017**0.245 ± 0.015##11.897 0.001腎上腺0.315 ± 0.022 0.345 ± 0.022*0.299 ± 0.021**5.523 0.018胸腺0.190 ± 0.004 0.195 ± 0.005 0.187 ± 0.004*4.602 0.031

表3 各組14 d臟器指數(shù)比較（ ± s，%）

表3 各組14 d臟器指數(shù)比較（ ± s，%）

注：與正常創(chuàng)面組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與糖尿病創(chuàng)面組比較，#P < 0.05，##P < 0.01。

組別正常創(chuàng)面組糖尿病創(chuàng)面組糖尿病陰證創(chuàng)面組F值P值n 6 6 6臟器指數(shù)/%腎臟0.644 ± 0.030 0.761 ± 0.021**0.609 ± 0.015*##72.425 0.000脾臟0.263 ± 0.012 0.289 ± 0.008**0.244 ± 0.009**##32.310 0.000腎上腺0.338 ± 0.046 0.407 ± 0.066*0.251 ± 0.044**#13.051 0.001胸腺0.176 ± 0.005 0.196 ± 0.009**0.139 ± 0.005**##105.000 0.000

表4 各組不同時(shí)間大鼠創(chuàng)面愈合率比較（ ± s，%）

表4 各組不同時(shí)間大鼠創(chuàng)面愈合率比較（ ± s，%）

注：與正常創(chuàng)面組比較，**P < 0.01；與糖尿病創(chuàng)面組比較，##P < 0.01。

組別正常創(chuàng)面組糖尿病創(chuàng)面組糖尿病陰證創(chuàng)面組F值P值第7天創(chuàng)面數(shù)量24 22 22愈合率及統(tǒng)計(jì)量0.783 ± 0.065 0.610 ± 0.107**0.501 ± 0.083**##62.473 0.000第14天創(chuàng)面數(shù)量12 12 12愈合率及統(tǒng)計(jì)量0.908 ± 0.039 0.853 ± 0.041**0.745 ± 0.053**##40.944 0.000

2.6 創(chuàng)面形態(tài)觀察

正常創(chuàng)面組在第7 天創(chuàng)面干凈，痂皮縮小且較?。坏?4天，創(chuàng)面殘存少許痂殼，基本修復(fù)。糖尿病創(chuàng)面組在第7天創(chuàng)面有痂皮形成，出現(xiàn)流膿滲血；第14天，創(chuàng)周痂皮基本干燥，修復(fù)趨勢(shì)明顯，上述各時(shí)間點(diǎn)與正常創(chuàng)面組比較，愈合效果差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01）。糖尿病陰證創(chuàng)面組在第7天，創(chuàng)面干燥，痂皮完整，創(chuàng)周有明顯收勢(shì)；第14天，創(chuàng)面色澤晦暗污穢，修復(fù)遲緩，各時(shí)間點(diǎn)與正常創(chuàng)面組、糖尿病創(chuàng)面組比較，愈合效果更差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01）。見圖6～圖7。

圖6 各時(shí)間點(diǎn)大鼠創(chuàng)面肉眼觀圖

圖7 各組創(chuàng)面愈合率情況比較

2.7 病理切片HE染色

2.7.1 皮膚組織

造模后第7 天：正常創(chuàng)面組創(chuàng)緣平整且薄，創(chuàng)面被新生肉芽組織覆蓋，組織結(jié)構(gòu)清楚（圖8A1），肉芽組織和毛細(xì)血管較豐富，可見豐富細(xì)密而平行排列的膠原纖維（圖8A2）；糖尿病創(chuàng)面組生長(zhǎng)緩慢，創(chuàng)面尚未有新生組織填充，創(chuàng)緣結(jié)構(gòu)紊亂，痂皮、表皮層脫落（圖8B1），新生細(xì)胞少，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯（圖8B2）；糖尿病陰證創(chuàng)面組生長(zhǎng)遲緩，有厚重痂皮覆蓋（圖8C1），邊緣可見纖細(xì)的膠原纖維向中央爬行（圖8C2）。

圖8 創(chuàng)面病理形態(tài)觀察（HE，× 20，× 100）

造模后第14 天：正常創(chuàng)面組表皮層出現(xiàn)且表面平整，各層組織細(xì)胞排列有序（圖8A3），粗壯的膠原纖維排列整齊，填滿缺損，炎細(xì)胞消退，肉芽組織趨于成熟，甚至可見毛囊生發(fā)，創(chuàng)面基本愈合（圖8A4）；糖尿病創(chuàng)面組皮膚組織肥厚，分泌物堆積，中間缺失（圖8B3），可見明顯的肉芽組織生長(zhǎng)、爬行趨勢(shì)，結(jié)構(gòu)層次較紊亂，膠原排列疏松且不規(guī)則，伴有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，表皮層尚未形成（圖8B4）；糖尿病陰證創(chuàng)面組可見全層皮膚較前兩組薄，出現(xiàn)不連續(xù)的新生表皮覆蓋，表皮生長(zhǎng)不平整，尚未完全填充創(chuàng)面（圖8C3），創(chuàng)面中成纖維細(xì)胞數(shù)量多，有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞排列紊亂（圖8C4）。

2.7.2 胰腺

造模后第7 天：正常創(chuàng)面組大鼠胰腺組織肥厚、完整，胰島數(shù)量多，呈類圓形，胰島β細(xì)胞呈索狀排列，細(xì)胞大小一致，細(xì)胞顆粒淡染，核染色質(zhì)清晰，胞漿界線清楚（圖9A1）；而糖尿病創(chuàng)面組大鼠胰腺組織萎縮，胰島處于逐漸消失狀態(tài)，胰島邊界模糊，胞漿有空泡形成（圖9B1）；糖尿病陰證創(chuàng)面組胰島邊界消融，胰島β 細(xì)胞排列緊密（圖9C1）。

圖9 胰腺病理形態(tài)觀察（HE染色，× 400）

造模后第14 天：正常創(chuàng)面組大鼠胰腺組織愈加肥厚，胰島多且大（圖9A2）；糖尿病創(chuàng)面組大鼠胰島縮小甚至消失，β細(xì)胞皺縮，溶界消失（圖9B2）；糖尿病陰證創(chuàng)面組胰島邊界不均，排列稀疏，細(xì)胞核淡染，出現(xiàn)大量空泡（圖9C2）。

3 討論

全球糖尿病患者約4.63 億，其中難愈合創(chuàng)面并發(fā)率高達(dá)20%［1］，嚴(yán)重危害人類健康，給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。糖尿病慢性創(chuàng)面臨床過程中常出現(xiàn)創(chuàng)面平塌、色澤灰白、滲液清稀、神疲乏力、生肌長(zhǎng)肉遲緩等表現(xiàn)，有纏綿難愈、易于復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，屬于“陰證”范疇，嚴(yán)重時(shí)成為“脫疽”。中醫(yī)學(xué)采用箍圍、熏洗等外治方法治療糖尿病并發(fā)癥取得了良好的治療效果［6-7］。糖尿病遷延日久，陽氣虛衰，溫煦推動(dòng)失職，氣血瘀滯，而氣血不達(dá)肌表，阻礙新肉化生，創(chuàng)面遷延難愈［8］。這與糖尿病狀態(tài)下機(jī)體代謝功能減弱、生長(zhǎng)減緩等因素相符，創(chuàng)面特征為愈合受損、炎癥延長(zhǎng)和上皮化動(dòng)力學(xué)降低［9］。因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)M糖尿病慢性創(chuàng)面患者臨床特征，制備糖尿病陰證創(chuàng)面大鼠模型，觀察動(dòng)物疾病特征、創(chuàng)面發(fā)展現(xiàn)象，建立合適的動(dòng)物模型，并提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

目前建立糖尿病大鼠模型的有效方法是使用胰島細(xì)胞特異性毒性藥物STZ 破壞胰島細(xì)胞，通過影響胰島素基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄翻譯，直接減少胰島素分泌，同時(shí)針對(duì)胰島細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激不耐受的特性，STZ 直接誘導(dǎo)可造成胰島細(xì)胞DNA 斷裂，造成胰島細(xì)胞功能障礙并死亡，胰島形態(tài)破壞［10］。當(dāng)前，注射STZ主要包括腹腔、肌肉、尾靜脈注射等方法，其中，腹腔注射因操作簡(jiǎn)單、傷害小，且能有效避免因推注造成的血容量增長(zhǎng)過快所致的心衰問題，成為目前主要的給藥方式［11］。研究表明，高脂飲食可以引起糖脂代謝異常，影響胰島素信號(hào)傳導(dǎo)等途徑，降低胰島素敏感性，從而誘發(fā)胰島素抵抗造成肥胖基礎(chǔ)，之后采用高脂飲食配合高濃度高劑量單次注射STZ破壞胰島是成功制備糖尿病大鼠模型的有效方法［12］。

陰證模型主要通過免疫抑制進(jìn)行誘導(dǎo)，包括物理射線照射、注射免疫抑制劑等方法［13］，其中通過大劑量注射糖皮質(zhì)類激素誘導(dǎo)的陰證模型所表現(xiàn)出的蜷縮、皮溫下降、大便溏稀、創(chuàng)面局部晦暗、膿液清稀，肉芽紅而不澤等表現(xiàn)與糖尿病創(chuàng)面患者臨床表現(xiàn)更為相似［14］。糖皮質(zhì)激素在局部穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞發(fā)育和免疫細(xì)胞激活中具有重要的生理作用［15］，而糖皮質(zhì)激素過度使用會(huì)通過誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞死亡并抑制免疫細(xì)胞的各項(xiàng)功能而發(fā)揮免疫抑制作用，從而影響胸腺、脾臟等免疫器官；并通過下丘腦－垂體－腎上腺軸（hypothalamicpituitary－adrenal axis，HPA）影響內(nèi)分泌、消化系統(tǒng)［16-19］，對(duì)大鼠造成全身改變，如喜靜怠動(dòng)、納差便溏、形體消瘦等。這些表現(xiàn)與中醫(yī)理論中陰證特點(diǎn)相符合，且病理機(jī)制與脾、腎等臟腑密切相關(guān)［20］?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，HPA 的功能障礙是陽虛的病理基礎(chǔ)，同時(shí)臟器指數(shù)降低說明造模后HPA 調(diào)節(jié)紊亂，脾、腎等功能下降［21-22］。此外，糖皮質(zhì)激素直接影響物質(zhì)代謝，通過抑制外周組織對(duì)葡萄糖的利用、加劇糖尿病，促進(jìn)蛋白質(zhì)分解同時(shí)抑制蛋白質(zhì)合成、促進(jìn)脂肪分解，減少細(xì)胞能量供應(yīng)，造成大鼠體質(zhì)量下降，消化吸收功能減弱［23］。糖皮質(zhì)激素甚至存在阻礙創(chuàng)面皮膚愈合、導(dǎo)致皮膚萎縮的副作用［24］。

針對(duì)創(chuàng)面模型的制備，主要有全層皮膚切除術(shù)［25］、皮膚磁片壓迫法［26］、高溫燙傷法［27］等，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)打孔器難以穿透皮膚或造成創(chuàng)面位置不統(tǒng)一；皮膚磁片壓迫法、溫度誘導(dǎo)法操作難度大、創(chuàng)面深度及面積不可控，且大鼠溫度耐受不同，綜上本實(shí)驗(yàn)選擇了直接手術(shù)法。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病造模后的大鼠陰證癥狀突出，表現(xiàn)為毛發(fā)粗糙雜亂，二便劇增，氣味烘臭、毛發(fā)黯淡污穢、行動(dòng)遲緩、蜷縮畏寒、大便溏稀等。與正常創(chuàng)面組比較，糖尿病陰證創(chuàng)面組與糖尿病創(chuàng)面組大鼠血糖明顯升高（P< 0.05），維持在17.1～26.2 mmol/L；OGTT 試驗(yàn)結(jié)果提示，糖尿病陰證創(chuàng)面組及糖尿病創(chuàng)面組大鼠存在胰島素抵抗。相較于正常創(chuàng)面組，糖尿病陰證創(chuàng)面組與糖尿病創(chuàng)面組表現(xiàn)出糖尿病多飲、多食、體質(zhì)量減輕等癥狀（P <0.05）。糖尿病陰證創(chuàng)面組大鼠腎臟、脾臟、腎上腺、胸腺臟器指數(shù)低于其余兩組，糖尿病創(chuàng)面組各類臟器指數(shù)高于正常創(chuàng)面組（P<0.05）。HE 染色結(jié)果表明，正常創(chuàng)面組大鼠胰腺組織肥厚，胰島完整，而糖尿病陰證創(chuàng)面組與糖尿病創(chuàng)面組胰島邊界模糊，β 細(xì)胞消融；第14 天較第7 天胰腺組織消融更明顯。創(chuàng)面修復(fù)情況顯示：糖尿病陰證創(chuàng)面組相較于糖尿病創(chuàng)面組、正常創(chuàng)面組修復(fù)速度明顯緩慢，第7、14天時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率均更低（P< 0.01）。且糖尿病陰證創(chuàng)面組HE 切片染色可見全層皮膚較前兩組薄，出現(xiàn)不連續(xù)的新生表皮覆蓋，表皮生長(zhǎng)不平整，創(chuàng)面中成纖維細(xì)胞數(shù)量多，有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞排列紊亂。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的大鼠糖尿病陰證創(chuàng)面模型確有依據(jù)且符合中醫(yī)辨證思路。本研究在取材過程中發(fā)現(xiàn)糖尿病陰證創(chuàng)面組大鼠脾、腎萎縮顯著，有別于其他組，今后有望從此著手深入探究脾腎陽虛模型機(jī)制。

目前已有大鼠糖尿病創(chuàng)面模型［13］、小鼠糖尿病陰證創(chuàng)面模型［5］等相關(guān)研究，方法均為分步依次造模。但是大鼠糖尿病陰證創(chuàng)面模型各步驟造模方法尚未統(tǒng)一，模型效果也存在差距，影響了相關(guān)實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性與可重復(fù)性。本團(tuán)隊(duì)所采用的通過2 mL 高脂乳劑灌胃14 d 后，予以一次性腹腔注射50 mg/kg STZ－檸檬酸鈉混合液聯(lián)合2 mL/kg 肌內(nèi)注射氫化可的松注射液7 d 后行創(chuàng)面手術(shù)，可建立穩(wěn)定高效的糖尿病陰證大鼠創(chuàng)面模型。同時(shí)探索出制備符合中醫(yī)陰證證候的糖皮質(zhì)類激素的適宜濃度與注射方法，提高了糖尿病大鼠陰證創(chuàng)面的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，具有一定的推廣意義。