陳文鈺 陳言 司國瑞 李曉龍 段萌媛 鄧鑫鑫 戶慶慶 陳俊儒 孟欣 黃克杰 平靜濤 王鵬禹 馬夢舸 李曉冰

(河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450008)

慢性疲勞綜合征(CFS)是一種復(fù)雜的、使人衰弱的疾病,其特征是極度疲勞,不因休息而改善。CFS通常與焦慮、抑郁、神經(jīng)內(nèi)分泌異常及各種軀體疾病相關(guān),特征不僅為嚴重疲勞,還常伴有神經(jīng)內(nèi)分泌、認知和免疫功能損傷〔1〕。研究發(fā)現(xiàn),CFS患者外周血炎癥因子水平較健康人明顯升高〔2〕,提示CFS可能通過影響免疫系統(tǒng)從而導(dǎo)致機體微炎癥狀態(tài)〔3〕?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對該病缺乏特異診斷標準和有效治療方案。歸脾湯始載于宋代《濟生方》,是祖國醫(yī)學(xué)經(jīng)典名方,具有益氣補血、健脾養(yǎng)心等功效。臨床觀察發(fā)現(xiàn),歸脾湯能顯著消除患者疲勞感,對CFS療效確切,臨床應(yīng)用廣泛〔4〕。本研究立足中醫(yī)傳統(tǒng)理論,選取臨床療效確切的歸脾湯對CFS小鼠模型進行干預(yù),從炎癥角度探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔健康 SPF級雄性小鼠30只,6～8周齡,體質(zhì)量18～22 g,生產(chǎn)許可證號:SCXK-(豫)2019-0002。實驗動物的飼養(yǎng)管理和實驗操作過程均遵守河南中醫(yī)藥大學(xué)實驗室相關(guān)規(guī)定。

1.2藥物與試劑 歸脾湯(藥用白術(shù)30 g、人參15 g、黃芪30 g、當(dāng)歸15 g、炙甘草8 g、茯神30 g、遠志15 g、酸棗仁30 g、木香15 g、龍眼肉30 g)購自河南張仲景大藥房。乳酸試劑盒、白細胞介素(IL)-1測定試劑盒、腫瘤壞死因子(TNF)-α測定試劑盒均購自南京建成生物研究所。

1.3主要儀器 全自動酶標儀(美國Bio-tek公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(廣州市康恒儀器有限公司);精密天平(上海奔普科技儀器有限公司);高速離心機(貝克曼庫爾特公司);曠場箱、SA101B 動物跑臺(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)。

1.4實驗分組 將小鼠隨機分成5組,即正常組、模型組、歸脾湯低劑量(GPT-L)組、歸脾湯中劑量(GPT-M)組、歸脾湯高劑量(GPT-H)組。

1.5造模及給藥 采用跑臺式疲勞方法制備CFS小鼠模型〔5〕。除正常組外其余4組進入動物跑臺造模4 w。第1周將每只小鼠放在速度為10 m/min的跑臺上運動30 min。在第2、3周和第4周,運行輪的速度逐漸增加到12 m/min,13 m/min和17 m/min,持續(xù)時間從第3周延長到60 min。如小鼠疲勞,不愿繼續(xù)運動,將從跑臺前方滑入邊緣觸電網(wǎng),迫使其必須繼續(xù)運動,以避免電擊。每周小鼠運行5 d休息2 d。造模后,GPT-L、GPT-M、GPT-H組按照3、6、12 g/(kg·d)劑量灌胃,連續(xù)2 w。

1.6取材 稱量小鼠體質(zhì)量,取小鼠外周血。取腎臟、肝臟稱重并冰上勻漿。

1.7生化法檢測血清乳酸水平 采用1.6中所得外周血,以3 000 r/min離心15 min后取上清,嚴格按試劑說明書測定血清乳酸水平。

1.8力竭游泳實驗 將小鼠尾部固定一約為體質(zhì)量5%的夾子,置入深為20 cm、水溫20～25 ℃的游泳池內(nèi),記錄小鼠從入水到力竭的時間。

1.9懸尾實驗 將小鼠尾端1 cm部分固定于不銹鋼板上,板面距離地面1 m左右,使小鼠呈倒掛狀,觀察5 min內(nèi)的掙扎次數(shù)及不動時間。

1.10曠場實驗 曠場實驗箱底部為50 cm×50 cm×50 cm的正方形開闊地,被劃分為25個黑線網(wǎng)格,中心9個網(wǎng)格被定義為中心區(qū)域。將動物放中心格中探索5 min,自動記錄動物越過黑線次數(shù)(水平得分)、表現(xiàn)出豎立行為的次數(shù)(垂直得分)及平均速度。每次實驗之間用75%乙醇清洗場地。

1.11Morris水迷宮實驗 將圓形水箱分為4個象限,在水箱內(nèi)部每個象限處貼上4個不同形狀、不同顏色的標記物(標記物之間距離相等),將平臺放在第四象限中間固定不動。定位航行實驗:水箱溫度為19～22 ℃,水的高度超過平臺1 cm,將小鼠置于象限中央頭朝平臺內(nèi)壁方向,當(dāng)小鼠找到平臺并在上面停留5 s,實驗結(jié)束取出小鼠擦干,放進鼠籠。若小鼠1 min時未找到平臺,則實驗自動結(jié)束,需人工引導(dǎo)其到平臺上,停留10 s取出。最后一次檢測時不需引導(dǎo),撤掉平臺,時間限定1 min。觀察1 min內(nèi)潛伏期及運動總距離。空間探索試驗:定位航行試驗結(jié)束后,撤除平臺。任選一相同入水點將小鼠放入水中,觀察受試鼠的空間定位能力及在空間探索過程中的變化規(guī)律,記錄小鼠平均速度及平臺區(qū)域運動距離。

1.12酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α 采用ELISA法嚴格按照說明書操作檢測血清IL-1、IL-6、TNF-α水平。

1.13統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件進行單因素方差分析。兩兩比較符合方差齊用LSD,不符合方差齊用塔姆黑尼或鄧尼特。

2 結(jié) 果

2.1歸脾湯對CFS血清乳酸水平、力竭游泳時間及懸尾實驗影響 與正常組比較,模型組血清乳酸水平和懸尾靜止時間明顯升高、力竭時間和懸尾掙扎次數(shù)明顯降低(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,GPT-M、GPM-G組血清乳酸水平顯著降低、懸尾掙扎次數(shù)明顯升高(P<0.05,P<0.01),GPT各組懸尾靜止時間明顯減少、力竭時間明顯延長(P<0.05,P<0.01),見表1。

表1 歸脾湯對CFS血清乳酸水平、力竭游泳時間、懸尾實驗及曠場實驗影響

2.2歸脾湯對CFS曠場實驗影響 與正常組比較,模型組平均速度、水平得分及垂直得分明顯降低(P<0.01);與模型組比較,GPT各組平均速度、GPT-L、GPM-G組水平得分及垂直得分明顯增加(P<0.05,P<0.01),見表1。

2.3歸脾湯對CFS小鼠Morris水迷宮實驗影響 與正常組比較,模型組定向巡航實驗中逃避潛伏期、運動總距離顯著提高,空間探索實驗中平均速度、平臺區(qū)運動距離明顯縮短(P<0.05,P<0.01);與模型組相比,CPT各組逃避潛伏期、運動總距離明顯縮短,平均速度、平臺區(qū)運動距離明顯增加(P<0.05,P<0.01),見表2。

表2 歸脾湯對CFS小鼠Morris水迷宮實驗影響

2.4歸脾湯對CFS外周血炎癥因子影響 與正常組比較,模型組血清IL-1、IL-6及TNF-α濃度明顯升高(P<0.01);與模型組比較,CPT各組IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯降低(P<0.01),見表2。

3 討 論

CFS特征在于身體長期無法休息從而導(dǎo)致的嚴重疲勞狀態(tài)。CFS多伴有不同程度中樞神經(jīng)受損改變,如失眠、記憶力和注意力減退等精神認知功能障礙表現(xiàn)〔6〕。認知功能障礙是CFS的重要組成部分,主要影響執(zhí)行功能,表現(xiàn)為注意力無法集中、信息處理速度變慢等。中醫(yī)將CFS歸為虛勞,認為脾虛是CFS發(fā)生的根本病機〔7〕,脾主生清,若脾氣虛弱不能升清,上不得精微之滋養(yǎng)則九竅不通,腦失所養(yǎng),而見頭目眩暈,精神疲憊,記憶力減退〔8〕,其表現(xiàn)與CFS認知功能障礙相似。

本實驗通過檢測力竭游泳、懸尾實驗、血清乳酸水平評價小鼠疲勞狀態(tài)。力竭游泳實驗是判斷疲勞程度的經(jīng)典行為學(xué)實驗〔9〕,懸尾實驗靜止時間和掙扎次數(shù)反映小鼠體力變化〔10〕。血乳酸是缺氧狀態(tài)下糖代謝產(chǎn)物,劇烈運動時體內(nèi)乳酸升高,血乳酸水平可用來評定機體疲勞狀態(tài)〔11〕。本實驗提示,疲勞模型制備成功。曠場實驗利用小鼠懼怕空曠、趨向探索陌生環(huán)境的天性,通過記錄小鼠活動狀態(tài)評估其自主探究行為〔12〕。Morris水迷宮實驗反映小鼠空間記憶等認知能力〔13〕。本實驗通過以上行為學(xué)實驗綜合評價小鼠認知能力,結(jié)果提示,歸脾湯能影響CFS模型小鼠自主探究行為,提高小鼠空間記憶等認知能力。

CFS患者外周血IL-6、TNF-α及IL-1β水平顯著升高,可加劇下丘腦-垂體-腎上腺軸功能紊亂,導(dǎo)致注意力下降、抑郁等中樞神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)。近期研究發(fā)現(xiàn)IL-1和IL-6憑借與TNF-α相似的機制活化腦內(nèi)的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞,使其進一步分泌 IL-1 和 IL-6,導(dǎo)致神經(jīng)炎癥,引發(fā)認知和記憶損傷,提示IL-6、TNF-α及IL-1β的持續(xù)存在可能與CFS認知障礙密切相關(guān)〔3,14〕。本結(jié)果提示,歸脾湯對CFS模型小鼠炎癥細胞因子有一定調(diào)節(jié)作用。