劉曉倩，陳佳宇，任文靜，郭 然，彭 琪，丁建英

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

絲瓜（Luffa aegyptiacaMiller）屬于葫蘆科的攀援草本植物[1]，別名為勝瓜、菜瓜，含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、鐵、鈣、磷、維生素B1及抗壞血酸等多種營養(yǎng)成分[2-3]。絲瓜皮可以作為中藥，具有清熱解毒、消炎、抗氧化、提高免疫力等功效[4,5]。相關(guān)研究顯示，絲瓜中含有多酚類物質(zhì)[6]，主要由類黃酮類和酚酸類成分組成[7]；絲瓜皮中的多酚含量高于絲瓜果肉，其醇提物中總多酚含量為9.8 mg/g。而絲瓜皮作為絲瓜食用時(shí)的副產(chǎn)物常被當(dāng)作廢棄物丟棄，利用率極低[4-5]，因此對絲瓜皮功能成分的提取及研究，可為絲瓜皮資源的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

超聲輔助提取方法與傳統(tǒng)提取方法相比，利用其熱作用和機(jī)械作用，可以促使功能成分的溶出，因此可以縮短時(shí)間、提高得率[8]，用于多種功能成分的提取[4,9]，本文用超聲輔助提取方法提取絲瓜皮中的多酚，通過研究不同的提取溫度、時(shí)間、乙醇濃度和料液比對多酚提取率的影響，利用單因素結(jié)合響應(yīng)面法對多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)的提取工藝，同時(shí)研究其抗氧化性，以期為絲瓜皮的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

新鮮壽光絲瓜購于常熟大潤發(fā)超市。

沒食子酸，上海源葉生物技術(shù)有限公司；福林酚試劑、無水乙醇、無水碳酸鈉、1,1- 二苯基-2- 苦基肼自由基（DPPH）、抗壞血酸（VC）、水楊酸、硫酸亞鐵，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；30%過氧化氫溶液，強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-5205A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵，上海力辰邦西儀器科技有限公司；TU-1901 雙光束紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KH-100DB 超聲波清洗機(jī)，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；TG16-WS 高速臺式離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 絲瓜皮多酚提取

絲瓜皮處理：將新鮮的絲瓜刮皮，刮下的絲瓜皮于陰涼處干燥24 h，再將絲瓜皮于60 ℃干燥至恒質(zhì)量，磨成粉末，過60 目篩，置于4 ℃冰箱備用。

絲瓜皮多酚提?。悍Q取4 g 絲瓜皮粉末，倒入錐形瓶中，同時(shí)以不同料液比加入一定濃度的乙醇溶液，振蕩混勻，使絲瓜皮粉末與乙醇溶液充分混合，超聲功率為100 W，連續(xù)超聲提取一定時(shí)間，4 000 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，濃縮成原體積的1/4，得到絲瓜皮多酚濃縮液，備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

絲瓜皮超聲輔助法提取時(shí)，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)，將超聲提取的溫度、時(shí)間、乙醇濃度和料液比四個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，提取溫度為20、30、40、50、60、70 ℃，提取時(shí)間為10、20、30、40、50、60 min，乙醇濃度為60%、65%、70%、75%、80%、85%，料液比（質(zhì)量體積比）為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），依次比較不同因素下各水平對絲瓜皮多酚得率的影響，以期獲得超聲輔助提取絲瓜皮多酚的最佳水平[10]。

1.3.3 絲瓜皮多酚提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

為進(jìn)一步研究各因素的交互作用對多酚提取率的影響，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝[11]?；贐ox-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇對多酚提取率有影響的4 個(gè)主要因素乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取溫度進(jìn)行4 因素3 水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，響應(yīng)面設(shè)計(jì)水平見表1[12]。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface design

1.3.4 絲瓜皮多酚得率的測定

將1.3.1 得到的絲瓜皮多酚濃縮液5.0 mL加入25.0 mL容量瓶中，加水定容，取0.5 mL 置入50 mL 比色皿中，隨后向比色皿中加入1.0 mL 福林酚試劑，振蕩，使溶液充分混勻，再加入2.0 mL 10%碳酸鈉溶液，振蕩，靜置1 h。最后測定溶液在760 nm 下的吸光度，根據(jù)公式（1）計(jì)算絲瓜皮多酚得率[13]。

式中，Y為絲瓜皮的多酚得率，mg/g；m為絲瓜皮質(zhì)量，g；n 為稀釋倍數(shù)；V為被測液體積，mL；c為多酚濃度，mg/mL。

1.3.5 絲瓜皮多酚對DPPH 自由基的清除作用

在試管中分別滴加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的提取液2 mL，再加入2.0 mL、0.2 mmol/L 的DPPH 溶液，充分震蕩，避光靜置30 min。以無水乙醇調(diào)零，在517 nm 波長下測得吸光度值；把DPPH 溶液換為無水乙醇，作為對照測其吸光度值；取相同體積DPPH 溶液和無水乙醇混合，測其吸光度值。按照上述步驟，將抗壞血酸作為參照物[14]，測定其吸光度值。以上述操作平行3 次，取平均值。用公式（2）計(jì)算多酚對DPPH 自由基的清除率。

式中，A樣品為提取液和DPPH 溶液的吸光度值；A對照為提取液和無水乙醇的吸光度值；A空白為無水乙醇和DPPH 溶液的吸光度值。

1.3.6 絲瓜皮多酚對羥基自由基的清除作用

在試管中分別滴加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 提取液2 mL，再加入9 mmol/L FeSO4溶液和8.8 mmol/L H2O2溶液各2.0 mL，充分震蕩，靜置5 min 再加入9 mmol/L 水楊酸溶液2.0 mL，充分震蕩，放置于水浴鍋中37 ℃恒溫水浴30 min。以蒸餾水調(diào)零，在510 nm 波長下測得吸光度值；把過氧化氫溶液換為蒸餾水，作為對照測其吸光度值；將提取液替換成蒸餾水作為空白對照，測其吸光度值[15]。按照上述步驟，將抗壞血酸作為參照物，測定其吸光度值。以上述操作平行3 次，取平均值。根據(jù)公式（3）計(jì)算絲瓜皮多酚對羥基自由基的清除率。

式中，A樣品為提取液和H2O2溶液的吸光度值；A對照為提取液和蒸餾水的吸光度值；A空白為蒸餾水和H2O2溶液的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

使用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲瓜皮多酚提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對絲瓜皮多酚得率的影響

由圖1 可知，隨著絲瓜皮多酚提取體系中溶劑量的增加，絲瓜皮多酚的得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，這可能是由于溶劑的增加，使絲瓜皮多酚與溶劑中多酚濃度差增大，促進(jìn)多酚的溶出。但當(dāng)料液比超過1∶15 后，隨著溶劑量的不斷增加，多酚在濃縮后處理過程中損失增加[14-15]，使提取率下降。由此將料液比設(shè)定為1∶10～1∶20，作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的條件。

圖1 料液比對絲瓜皮多酚得率的影響Fig.1 Effect of material liquid ratio on the yield of polyphenols from luffa peels

2.1.2 乙醇濃度對絲瓜皮多酚得率的影響

如圖2所示，隨著乙醇濃度的增加，絲瓜皮多酚出現(xiàn)先增后減的趨勢。當(dāng)乙醇濃度為60%～75%時(shí)，絲瓜皮多酚提取率呈明顯上升趨勢，在75%時(shí)達(dá)到最大值，這可能是由于乙醇濃度過低時(shí)，極性過強(qiáng)，導(dǎo)致糖類等水溶性物質(zhì)浸出量增大；但在乙醇濃度為75%～85%時(shí)，得率逐漸降低，可能是乙醇濃度過高造成提取溶劑極性太低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生變性，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變得致密，從而導(dǎo)致多酚不能溶出；另外多酚往往以氫鍵形式與其他成分結(jié)合，乙醇濃度過高，直接影響氫鍵的斷裂，使多酚提取得率下降[16]。因此，將乙醇濃度設(shè)定為70%～80%作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的條件。

圖2 乙醇濃度對絲瓜皮多酚得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on polyphenol yield rate of luffa peels

2.1.3 提取時(shí)間對絲瓜皮多酚得率的影響

如圖3所示，當(dāng)提取時(shí)間為10～30 min 時(shí)，絲瓜皮多酚得率隨提取時(shí)間增加而增加；當(dāng)達(dá)到30 min 時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值，為7.50 mg/g；提取時(shí)間達(dá)到30 min以后，多酚得率隨提取時(shí)間的增加而下降?？赡艿脑蚴嵌喾尤芙庥谌軇﹥?nèi)需要時(shí)間，所以在30 min 之前，多酚得率呈上升趨勢；當(dāng)達(dá)到30 min 臨界點(diǎn)時(shí)，多酚得率將不再增長，而且隨著提取時(shí)間延長，提取液中的多酚物質(zhì)會發(fā)生氧化、聚合、分解等各種反應(yīng)[17]，從而使其含量有所下降。由此將提取時(shí)間設(shè)定為20～40 min 作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的條件。

圖3 提取時(shí)間對絲瓜皮多酚得率的影響Fig.3 Effects of extraction time on the polyphenol yield rate of luffa peels

2.1.4 提取溫度對絲瓜皮多酚得率的影響

如圖4所示，當(dāng)提取溫度在20～60 ℃時(shí)，絲瓜皮多酚得率隨提取溫度的升高而上升，當(dāng)提取溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，達(dá)到最大值，為6.08 mg/g。這是因?yàn)殡S著提取溫度的升高，分子運(yùn)動加劇，從而使多酚析出增加；但溫度超過60 ℃，過高的溫度使多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)破壞，從而使多酚得率下降[17]。由此將提取時(shí)間設(shè)定為50～70 ℃作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的條件。

圖4 提取溫度對絲瓜皮多酚得率的影響Fig.4 Influence of extraction temperature on polyphenol yield rate of luffa peels

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2（見下頁）所示，利用軟件Design- Expert 10.0.3 對數(shù)據(jù)進(jìn)行解析[18]，得到二次多項(xiàng)回歸方程：多酚提取率Y（%）=9.96+0.96A+0.87B+0.26C+109D+0 .37AB-0 .24AC+0 .30AD+0 .28BC-0.62BD+0.045CD-3.24A2-1.86B2-0.85C2-1.64D2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Test design and results

對模型進(jìn)行回歸分析，其結(jié)果見表3，一次項(xiàng)A、B、C、D 對多酚提取率線性效應(yīng)顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)A、B、C、D 對多酚提取率曲面效應(yīng)顯著（P＜0.05），AB、AD、BD 對多酚提取率交互效應(yīng)顯著（P＜0.05）。該模型的負(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.991 8，P＜0.000 1，可以證明該模型達(dá)到極顯著水平，該模型失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），證明該模型可信，擬合度較高，可用于絲瓜皮超聲波輔助提取工藝的分析和優(yōu)化。由F值可知，各因素對絲瓜皮多酚提取量的影響大小順序?yàn)樘崛囟龋疽掖紳舛龋咎崛r(shí)間＞料液比。

2.2.2 因素間交互作用分析結(jié)果

由圖5（見53 頁）結(jié)合表3（見54 頁）可知，提取時(shí)間-乙醇濃度、乙醇濃度-提取溫度、乙醇濃度-料液比交互作用對絲瓜皮多酚提取率影響顯著（P＜0.05），其他因素交互作用對絲瓜皮多酚提取率影響不顯著。

圖5 各因素的交互作用對多酚提取率的影響Fig.5 The influence of the interaction of various factors on the extraction rate of polyphenols

表3 絲瓜皮多酚提取率擬合回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of the Prate fit regression equation

2.2.3 最優(yōu)工藝條件試驗(yàn)驗(yàn)證

多酚最優(yōu)提取工藝為乙醇濃度76.02%、提取時(shí)間30.19 min、料液比1∶15.75（g/mL）、提取溫度62.62 ℃，在此條件下模型預(yù)測的多酚提取率為10.24 mg/g。

根據(jù)軟件預(yù)測結(jié)果，結(jié)合實(shí)際工藝設(shè)置的可行性，取乙醇濃度76%、提取時(shí)間30 min、料液比1∶16（g/mL）、提取溫度63 ℃為條件進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，平均多酚提取率為10.13 mg/g，與模型預(yù)測結(jié)果接近，表明模型擬合效果良好，基于該響應(yīng)面模型分析優(yōu)化多酚提取率提取工藝的方法有效可行[19]。

2.3 絲瓜皮多酚溶液的抗氧化能力分析結(jié)果

2.3.1 絲瓜皮多酚對DPPH 自由基的清除效果

酚類化合物是果蔬中主要的抗氧化物質(zhì)之一，DPPH自由基被廣泛應(yīng)用于天然植物或化合物的抗氧化能力評價(jià)。如圖6（見53頁）所示，絲瓜皮多酚與VC在消除DPPH自由基方面效果相近，其清除率隨溶液濃度的增加而增加，呈現(xiàn)正相關(guān)。當(dāng)絲瓜皮多酚濃度為0.6 mg/mL 時(shí)，對DPPH 自由基的清除率為92.8%，顯示絲瓜皮多酚對DPPH 自由基具有良好的清除效果。有研究表明胎菊多酚對DPPH 自由基的清除率為97.49%[20]，與絲瓜皮多酚相當(dāng)。

圖6 絲瓜皮多酚對DPPH 清除效果Fig.6 Effect of luffa peels on the effect of DPPH removal

2.3.2 絲瓜皮多酚對羥基自由基的清除效果

絲瓜皮多酚溶液與VC 溶液對羥基自由基清除效果如圖7所示，VC 與絲瓜皮多酚對羥基自由基具有清除效果，但通過數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，絲瓜皮多酚對羥基自由基的清除效果超過VC 對羥基自由基的效果。當(dāng)絲瓜皮多酚濃度為0.6 mg/mL 時(shí)，對羥基自由基的清除率為88.17%。遠(yuǎn)高于邵安冉等[20]報(bào)道的胎菊多酚26.42%的羥基自由基清除率，可見絲瓜皮多酚對羥基自由基具有較好的清除效果。

圖7 絲瓜皮多酚對羥基自由基清除效果Fig.7 Effect of luffa peels polyphenols on hydroxyfree radicals removal

3 結(jié)論

在構(gòu)建資源節(jié)約型社會的進(jìn)程中，農(nóng)業(yè)生物廢棄物的再利用越來越受到人們的重視。本文以絲瓜食用后丟棄的絲瓜皮作為原料，采用超聲輔助乙醇提取的方法對絲瓜皮中的多酚進(jìn)行提取，優(yōu)化提取工藝參數(shù)，并對絲瓜皮多酚的抗氧化性進(jìn)行了研究。得出絲瓜皮多酚超聲輔助提取的最佳工藝條件為乙醇濃度76%、提取時(shí)間30 min、料液比1∶16（g/mL）、提取溫度63 ℃。以此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到絲瓜皮多酚得率為10.13 mg/g，與響應(yīng)面模型預(yù)測值10.24 mg/g 相近。絲瓜皮多酚抗氧化性能研究發(fā)現(xiàn)，隨著絲瓜皮多酚濃度增大，絲瓜皮多酚對DPPH 和羥基自由基的清除率均不斷增加，絲瓜皮多酚濃度達(dá)到0.6 mg/mL 時(shí)，對DPPH 和羥基自由基的清除率分別為92.8%和88.17%，說明絲瓜皮多酚具有良好的抗氧化活性。絲瓜皮作為絲瓜烹飪或加工時(shí)產(chǎn)生的廢棄物，但其含有豐富的多酚成分，絲瓜皮多酚具有良好的抗氧化性，在食品加工以及化妝品行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景，后續(xù)將對絲瓜皮多酚進(jìn)一步純化并對其組分研究，為其進(jìn)一步應(yīng)用提供基礎(chǔ)。