宋健平，郭欣奕，劉欣雨，路 昌，王雨萌，王 磊，于 梅*

（1.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省林草種質(zhì)資源中心暖溫帶林草種質(zhì)資源保存與利用國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250102）

文冠果（Xanthoceras sorbifoliumBunge）是無患子科文冠果屬落葉灌木或小喬木,是我國北方特有的珍稀木本油料植物[1]，種仁可以榨油，制得的文冠果油是高檔食用油，具有抗炎、清除自由基、抗腫瘤活性和修復(fù)腦神經(jīng)等功能[2]。文冠果籽粕是文冠果種仁加工制油后得到的副產(chǎn)物，含有豐富的蛋白質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)其營養(yǎng)價(jià)值和消化吸收率高于大豆蛋白和葵花蛋白，接近于酪蛋白，是一種利用率較高的優(yōu)質(zhì)蛋白，具有良好的開發(fā)利用價(jià)值[3]。但目前文冠果籽粕利用率不高，主要用于飼料或直接丟棄，潛在價(jià)值尚未得到充分開發(fā)，綜合利用水平和經(jīng)濟(jì)效益低下。文冠果籽粕高值化深加工和綜合性研究對(duì)于緩解文冠果資源浪費(fèi)、增加產(chǎn)品附加值具有重要意義[4]。

現(xiàn)已有較多研究發(fā)現(xiàn)，植物蛋白質(zhì)酶解后的產(chǎn)物具有降低膽固醇和血脂、抗疲勞、抗氧化等功能活性[5-7]。植物源蛋白酶解物的制備方法主要有酶解法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和直接提取法[8]，但是采用以上方法進(jìn)行酶解反應(yīng)所需的酶解時(shí)間較長，酶解效率較低，對(duì)酶解產(chǎn)物的抗氧化活性有一定影響[9]。為了優(yōu)化蛋白質(zhì)酶解進(jìn)程及提高酶解產(chǎn)物的抗氧化性能，超聲波在抗氧化酶解制備中的應(yīng)用引起了廣泛關(guān)注與研究[10-13]。超聲波是近年來興起的綠色環(huán)保的聚合物降解方法[14-16]，且利用超聲波協(xié)同作用在其他物質(zhì)的提取方面效果顯著[17]。

迄今為止，文冠果籽粕蛋白的提取方法和相關(guān)研究鮮有報(bào)道，未見超聲波技術(shù)應(yīng)用于文冠果籽粕的研究。趙晨煊等[18]采用改良Osborne 法分級(jí)分離文冠果油粕中的醇溶蛋白、谷蛋白、球蛋白和清蛋白，并用木瓜蛋白酶分解，并從4 個(gè)酶解產(chǎn)物中分離出活性肽，通過測(cè)定它們對(duì)DPPH 和ABTS 自由基的清除能力來評(píng)價(jià)其抗氧化活性。陳江魁等[3]對(duì)文冠果多肽水解條件進(jìn)行了優(yōu)化，并測(cè)定酶解液的水解度、對(duì)DPPH 和ABTS 自由基的清除能力，結(jié)果較好。本研究以文冠果籽粕為原料，利用超聲波輔助酶解技術(shù)得到文冠果籽粕酶解液，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝，并通過自由基清除試驗(yàn)對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步擴(kuò)大文冠果的開發(fā)利用范圍提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

文冠果籽粕，山東林昱宏生物科技有限公司；Arazyme 高效蛋白酶（5 000 U/mg），中韓食品研究所提供；Tris-HCl 緩沖液、鄰苯三酚、二硫蘇糖醇（DTT）、2,2-聯(lián)氮-二(3- 乙基-苯并噻唑-6- 磺酸) 二銨鹽（ABTS）、1,1- 二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海源葉生物技術(shù)有限公司；過硫酸鉀、茚三酮（Ninhydrin），上海麥克林生化科技有限公司；七水合硫酸亞鐵、鄰二氮菲、正己烷等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 主要設(shè)備

WZJ-6J 振動(dòng)式超細(xì)粉碎機(jī)，濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司；BK-600B 型超聲清洗儀，濟(jì)南巴客超聲波科技有限公司；TGL-20M高速臺(tái)式離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FD-1D-80 冷凍干燥機(jī)，美國西蒙公司；TU-1810 紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 文冠果酶解液的制備

選取文冠果籽粕為原料，文冠果籽粕與正己烷按照1∶3（g/mL）進(jìn)行脫脂處理，用振動(dòng)式超細(xì)破碎機(jī)超微粉碎籽粕得到文冠果籽粕粉，過300 目篩。利用超聲清洗儀在溫度37 ℃、超聲波功率300 W，超聲時(shí)間20 min，選用Arazyme 高效蛋白酶在料液比1∶12（g/mL）、高效蛋白酶添加量0.15%、酶解溫度37 ℃，酶解時(shí)間6 h 和pH 8.5條件下對(duì)文冠果籽粕粉進(jìn)行酶解。酶解結(jié)束后迅速置于80 ℃水浴中加熱15 min 進(jìn)行滅酶得到酶解液，酶解液進(jìn)行超濾，截留分子量小于3 kDa 的組分，經(jīng)-80 ℃冷凍干燥后得到酶解物，配置成不同濃度（2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5mg/mL）的文冠果籽粕酶解液。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以不同的超聲時(shí)間（10、15、20、25、30 min），酶添加量（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%），超聲功率（100、200、300、400、500 W）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察不同因素對(duì)文冠果籽粕酶解液水解度的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)響應(yīng)面分析法中Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以超聲時(shí)間、酶添加量、超聲功率為試驗(yàn)因素，以水解度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

1.4 蛋白質(zhì)水解度（Degree of hydrolysis，DH）測(cè)定方法

采用茚三酮比色法測(cè)定[19]。取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中，再依次加入1 mL 緩沖液、1 mL 茚三酮溶液、2 mL蒸餾水，封好搖勻后放入沸水浴中加熱15 min，取出放至冷水中冷卻15min。結(jié)束后，向每支比色管中分別加入5mL碘酸鉀溶液搖勻，于波長568 nm 處測(cè)定吸光度。水解度按照公式（1）計(jì)算得出。

式中，h為未加酶的酶解液的水解度；htot為1 g 文冠果籽粕中的肽鍵摩爾數(shù)（氨基酸分析儀測(cè)定）。

1.5 抗氧化活性研究

1.5.1 羥基自由基清除能力的測(cè)定

參照宗玉霞[20]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.5.2 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

參照徐鎖玉等[21]的研究方法。

1.5.3 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

參照程蕾等[22]的研究方法進(jìn)行測(cè)定。

1.5.4 ABTS 自由基清除能力的測(cè)定

參照李奕葶等[23]的研究方法進(jìn)行測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 2021、Design-Expert 13、IBM SPSS Statistics 26、GraphPad Prism 9.5 和Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響

如圖1所示，隨著超聲時(shí)間不斷增加，蛋白質(zhì)的水解度不斷升高，當(dāng)超聲波時(shí)間超過20 min 后，蛋白質(zhì)的水解度逐漸下降?？赡苁且?yàn)槌暡ǖ臋C(jī)械和空切等作用，使文冠果蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，更多的酶結(jié)合位點(diǎn)暴露出來，但是當(dāng)超聲波時(shí)間過長，結(jié)合位點(diǎn)和酶的結(jié)構(gòu)也會(huì)被逐漸破壞，底物濃度不斷減少，而產(chǎn)物濃度逐漸增高，導(dǎo)致兩者之間逐漸處于不平衡狀態(tài)，從而影響蛋白質(zhì)水解。因此選擇最佳超聲時(shí)間為20min。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響Fig.1 Influence of ultrasonic duration on protein hydrolysis degree

2.1.2 酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響

如圖2所示，隨著酶添加量的增加，蛋白質(zhì)水解度呈現(xiàn)先上升后下降最后逐漸趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。當(dāng)酶添加量為0.05%時(shí)，酶含量過低，無法完全酶解文冠果籽粕粉，隨著酶添加量的增加，蛋白質(zhì)水解度也不斷增大，在酶添加量達(dá)到0.15%時(shí)，水解最徹底；酶添加量超過0.15%，水解度反而逐漸降低趨于平穩(wěn)，這是因?yàn)榈孜锱c酶反應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，多余的高效蛋白酶無法發(fā)揮其作用。因此，最適酶添加量為0.15%。

圖2 酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響Fig.2 Influence of enzyme addition on protein hydrolysis degree

2.1.3 超聲功率對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響

如圖3所示，隨著超聲功率的不斷增加，蛋白質(zhì)的水解度也不斷升高，當(dāng)超聲功率超過300 W 后蛋白質(zhì)的水解度開始下降。主要原因是隨著超聲功率的加大，增大了超聲波的空化及機(jī)械攪拌作用，增加了液體流動(dòng)性，蛋白酶能更好地與底物接觸，促進(jìn)酶解物的溶出，利于提高提取率，但隨著超聲功率的增加，容易造成內(nèi)部環(huán)境局部過熱，使酶無法與底物充分接觸，從而降低蛋白質(zhì)的水解度。因此，最佳超聲功率為300 W。

圖3 超聲功率對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響Fig.3 Influence of ultrasonic power on protein hydrolysis degree

2.2 酶解條件響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 回歸模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，并由IBMSPSS Statistics 26 軟件進(jìn)行分析可得，超聲時(shí)間、酶添加量和超聲功率對(duì)水解度影響均顯著（P＜0.05），因此以水解度為響應(yīng)值，分析超聲時(shí)間、酶添加量、超聲功率對(duì)響應(yīng)值的影響，設(shè)計(jì)3因素3 水平共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 酶解條件響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results of enzymatic hydrolysis conditions

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)測(cè)得的結(jié)果，使用Design-Expert 13 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸擬合，并進(jìn)一步研究和優(yōu)化影響穩(wěn)定系數(shù)的因素，做響應(yīng)面圖。多元回歸擬合得到穩(wěn)定系數(shù)與各因素的二次方程模型為Y=22.30-0.087 5A-0.125 0B-0.137 5C+0.025 0AC-0.050 0BC-1.74A2-1.81B2-3.54C2。

由表3 方差分析結(jié)果表明，模型F值為404.10，建立的回歸模型對(duì)水解度達(dá)顯著水平（P＜0.01），表明該回歸方程模型顯著，說明了方程有意義；方程失擬項(xiàng)P=0.60差異性均不顯著（P＞0.05），說明回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合情況誤差不大，能很好地表現(xiàn)出各影響因素和響應(yīng)值之間的聯(lián)系，并能夠較好地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)值。模型判定系數(shù)R2=0.987 5，表明試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值有很好的相關(guān)性；R2Adj=0.995 6，表明模型可以解釋99.56%的響應(yīng)值變化。說明該模型可用于分析和預(yù)測(cè)超聲波輔助酶解文冠果籽粕的水解度。其中，C 對(duì)文冠果籽粕酶解液水解度有顯著影響（P＜0.05），A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），其他影響不顯著，3 個(gè)因素對(duì)水解度影響大小依次為超聲功率、酶添加量、超聲時(shí)間。

表3 回歸模型水解度方差分析Table 3 Variance analysis of regression model hydrolysis degree

2.2.2 酶解條件響應(yīng)面試驗(yàn)交互作用結(jié)果分析

由圖4 可直觀看出各因素對(duì)文冠果籽粕酶解液水解度的影響，其中C 的影響較顯著，表現(xiàn)為曲線相對(duì)較陡，對(duì)文冠果籽粕的水解度影響較大，A、B 的影響較不顯著，表現(xiàn)為曲線比較平滑對(duì)文冠果籽粕的水解度影響較小，這與回歸方程的方差分析結(jié)果一致。

圖4 因素的交互作用對(duì)文冠果籽粕酶解液水解度的影響Fig.4 The influence of the interaction of factors on the hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate of X.sorbifolia Bunge seed meal hydrolysate

2.2.3 最佳酶解條件及驗(yàn)證試驗(yàn)

模型預(yù)測(cè)得到最佳酶解條件為超聲時(shí)間18.99 min，酶添加量0.14%，超聲功率309.09 W，此時(shí)的水解度為22.30%?？紤]到實(shí)際可操作性，將最佳酶解條件調(diào)整為超聲時(shí)間20 min、酶添加量0.15%、超聲功率300 W，在此條件下，經(jīng)3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際得到水解度為22.57%，與理論值相接近，表明采用響應(yīng)面分析法得到的優(yōu)化條件是可靠的。

2.3 水解法與超聲波輔助酶解法效果比較

將酶解文冠果籽粕的兩種方法——水酶法與超聲波輔助酶解法進(jìn)行比較，結(jié)果見表4。利用超聲波輔助酶解法酶解的文冠果籽粕的水解度比水酶法增加了9.36%。利用超聲波輔助酶解蛋白質(zhì)制備酶解液，可以大大提高酶解效率。

表4 兩種酶解方法比較Table 4 Comparison of two enzymatic hydrolysis methods

2.4 文冠果籽粕酶解液抗氧化活性結(jié)果分析

2.4.1 文冠果籽粕酶解液對(duì)羥基自由基的清除率

由圖5 可知，隨著酶解液中酶解物質(zhì)量濃度的升高，文冠果籽粕酶解液對(duì)羥基自由基清除率先升高后趨于平穩(wěn)，但始終弱于同濃度下的VC。當(dāng)文冠果籽粕酶解液質(zhì)量濃度為17.5 mg/mL 時(shí)，其對(duì)羥基自由基清除率為（65.35±0.41）%，IC50值為6.39 mg/mL。雖與同質(zhì)量濃度的VC 相比仍具有一定的差距，但也能表現(xiàn)出一定的羥基自由基清除能力。

圖5 羥基自由基清除能力的測(cè)定Fig.5 Determination of hydroxyl radical scavenging capacity

2.4.2 文冠果籽粕酶解液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率

由圖6 可知，文冠果籽粕酶解液具有清除超氧陰離子自由基的能力。在2.5～17.5 mg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，清除率與酶解液濃度呈劑量依賴關(guān)系，隨著酶解物質(zhì)量濃度的升高，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率顯著增強(qiáng)。當(dāng)文冠果酶解液中酶解物的質(zhì)量濃度為17.5 mg/mL 時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基清除率為（90.90±0.78）%，對(duì)超氧陰離子自由基的IC50值為10.66 mg/mL，同濃度下VC 的清除率為（99.10±0.25）%，在相同質(zhì)量濃度下超氧陰離子自由基清除率與VC 的作用效果相當(dāng)。說明文冠果酶解液中酶解物在一定濃度下有較強(qiáng)的超氧陰離子自由基清除能力。

圖6 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定Fig.6 Determination of the ability of superoxide anionic free radicals to scavenge

2.4.3 文冠果籽粕酶解液對(duì)DPPH 自由基的清除率

由圖7 可知，文冠果籽粕酶解液對(duì)DPPH 自由基存在清除效果，文冠果籽粕酶解液的DPPH 自由基清除能力隨著濃度升高而增大。濃度在2.5～7.5 mg/mL 時(shí)，增大趨勢(shì)較為明顯，在7.5～17.5 mg/mL 時(shí)趨勢(shì)趨于平緩，當(dāng)文冠果酶解液中酶解物質(zhì)量濃度為17.5 mg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH 清除率為（90.65±0.53）%，IC50值為14.36 mg/mL，同種質(zhì)量濃度下VC 的清除率為（99.17±0.97）%，與VC的作用效果基本一致。說明文冠果酶解液中的酶解物具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除作用。

圖7 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定Fig.7 Determination of ABTS free radical scavenging capacity

2.4.4 文冠果籽粕酶解液對(duì)ABTS 自由基的清除率

由圖8 可知，VC 對(duì)照組對(duì)ABTS 的清除率較高，均達(dá)到了95%以上；文冠果籽粕酶解液對(duì)ABTS 的清除率遠(yuǎn)低于VC。但隨著文冠果酶解物質(zhì)量濃度的增加，對(duì)ABTS 自由基的清除率的增大趨勢(shì)較為顯著，表現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)文冠果籽粕酶解液濃度達(dá)到17.5 mg/mL 時(shí)，對(duì)ABTS 自由基清除率可達(dá)（86.90±0.88）%，IC50值為5.21 mg/mL，與VC 的清除水平相當(dāng)，說明文冠果籽粕酶解液也具有較強(qiáng)的ABTS 清除能力。

圖8 ABTS 自由基清除能力的測(cè)定Fig.8 Determination of DPPH free radical scavenging capacity

3 結(jié)論

以文冠果籽粕為原料，選用堿性蛋白酶，采用超聲波輔助酶解技術(shù)制備文冠果籽粕酶解液。通過單因素試驗(yàn)以及三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，在料液比1∶12，酶解時(shí)間6 h，溫度37 ℃，酶解pH 8.5 的條件下，得到酶解液的最佳酶解條件是超聲時(shí)間20 min，酶添加量0.15%，超聲功率300 W，在此條件下得到的水解度為22.57%，與水酶法相比，增加了9.36%。通過響應(yīng)面試驗(yàn)的方差分析得出，超聲功率是影響文冠果籽粕酶解工藝的主要因素，然后依次是酶添加量和超聲波時(shí)間。

自由基清除實(shí)驗(yàn)表明，文冠果酶解液中酶解物對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基、ABTS 自由基、DPPH 自由基均有很好的清除能力，且清除能力隨酶解物的質(zhì)量濃度的增大而增大，酶解液在四種體系中的IC50值分別是6.39、10.66、14.36、5.21 mg/mL，說明文冠果酶解液中酶解物的抗氧化活性較明顯。試驗(yàn)結(jié)果為文冠果副產(chǎn)物的再利用提供理論基礎(chǔ)，為文冠果產(chǎn)品的精細(xì)加工、合理開發(fā)提供理論依據(jù)。