趙 飛，孫 莉，劉雪梅，王曉敏，曲春婷，程延玲，王裴沛，孫傳榮，劉亞琦，張培欣，張晨昊，侯雨婷，李心茹

（1.濰坊科技學(xué)院賈思勰農(nóng)學(xué)院，山東 濰坊 262700；2.山東省設(shè)施園藝生物工程研究中心，山東 濰坊 262700；3.中華全國(guó)供銷合作總社濟(jì)南果品研究所，山東 濟(jì)南 250220）

食用植物酵素含有多種生物活性物質(zhì)，具有抗衰老、抗氧化、解酒護(hù)肝及提高機(jī)體免疫力等功效[1-4]。在酵素制備過(guò)程中起關(guān)鍵作用的是微生物，通過(guò)利用微生物的發(fā)酵作用將原料所含的物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將生成的分解代謝產(chǎn)物釋放于酵素中，使其含有豐富的風(fēng)味成分；發(fā)酵微生物大多為益生菌，在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生有益的生物活性物質(zhì)，從而使酵素具有一定的功能特性[5]。蔣增良等[6]研究了在天然條件下發(fā)酵葡萄酵素的體外抗氧化能力的變化，在發(fā)酵過(guò)程中其抗氧化性能總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；蔡麗琴[7]研究表明發(fā)酵10～20 d 的混菌發(fā)酵獼猴桃酵素具有最佳的抗氧化能力。夏國(guó)燈等[8]以玫瑰花作為原料，采用復(fù)合乳酸菌發(fā)酵，優(yōu)化其發(fā)酵工藝，結(jié)果表明玫瑰酵素液發(fā)酵后的抗氧化能力較強(qiáng)。洪厚勝等[9]以葡萄渣和糖蜜等為發(fā)酵原料，優(yōu)化接種酵母菌、乳酸菌和醋酸菌發(fā)酵的酵素工藝，制作出有機(jī)酸豐富、香氣成分突出和色澤鮮亮、口感、風(fēng)味具佳的酵素產(chǎn)品。利用接種發(fā)酵制備果蔬酵素，研究其發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，從而優(yōu)化產(chǎn)品品質(zhì)，并為發(fā)酵生產(chǎn)提供了技術(shù)指導(dǎo)和理論支持。

黃秋葵（Okra Hibiscus esculentusL.）又名咖啡黃葵、秋葵、洋角豆，是錦葵科秋葵屬（Malvaceae genera）一年生食藥兩用的草本植物，是具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的新型保健蔬菜[10]，起源于非洲和亞洲等熱帶地區(qū)，目前在我國(guó)南方和北方地區(qū)均有種植[11]。黃秋葵含有果膠、多糖、蛋白質(zhì)、可溶性膳食纖維、維生素和微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[10-13]。但黃秋葵蒴果成熟期短，肉質(zhì)易老化、纖維化，食用價(jià)值降低，需及時(shí)采收并進(jìn)行深加工。目前黃秋葵主要被加工為凍干果干、凍干果粉、復(fù)合果蔬汁和保健袋泡茶等初級(jí)產(chǎn)品[10]，而對(duì)黃秋葵酵素方面研究較少。因此，本研究以黃秋葵為原料，采用接種乳酸菌的發(fā)酵技術(shù)，優(yōu)化黃秋葵酵素的發(fā)酵工藝，測(cè)定酵素的總酸、pH值、可溶性固形物含量、色深和色調(diào)、色差、羥基自由基清除能力等，以期為實(shí)現(xiàn)黃秋葵酵素的工業(yè)化生產(chǎn)、綜合性開發(fā)以及品質(zhì)的提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵，購(gòu)自山東濰坊壽光；檸檬，四川安岳；紅心火龍果，市售。乳酸菌，5 菌型：保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌，北京川秀科技有限公司；冰糖，市售。

酚酞，西隴科學(xué)股份有限公司；乙醇，天津富宇精細(xì)化工有限公司；水楊酸，天津永大化學(xué)試劑有限公司；過(guò)氧化氫、氫氧化鈉，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；硫酸亞鐵，天津恒興試劑制造有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

二列八孔電熱恒溫水浴鍋，龍口市先科股份有限公司；C21-WT2112T 電磁爐，美的生活電器制造有限公司；YP502N 電子天平，上海精密科學(xué)儀器公司；T6 新悅-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器公司；CS-410 分光色差儀，杭州彩譜科技公司；TD-45 數(shù)顯糖度儀，浙江托普云農(nóng)科技公司；FE28 pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器公司；SJ-CJ-2FDQ 超凈工作臺(tái)，江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 黃秋葵酵素制備

挑選新鮮無(wú)損壞的黃秋葵、火龍果和檸檬，用無(wú)菌水洗凈、晾干、切塊后放入已滅菌的發(fā)酵罐中，添加滅菌冰糖，加入乳酸菌菌液（將乳酸菌菌粉溶于無(wú)菌水中，配置不同濃度菌粉液），進(jìn)行避光靜態(tài)發(fā)酵[14]，以上所有操作均在無(wú)菌室中進(jìn)行。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

（1）不同黃秋葵、火龍果添加比例對(duì)酵素品質(zhì)的影響

控制冰糖添加量140 g/L，菌粉添加量0.75 g/L，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間72 h，分別改變黃秋葵和火龍果的添加比例3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，確定最佳的黃秋葵和火龍果添加比例。

（2）不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵素品質(zhì)的影響

控制黃秋葵和火龍果的添加比例1∶1，冰糖添加量140 g/L，菌粉添加量0.75 g/L，發(fā)酵溫度35 ℃，分別改變發(fā)酵時(shí)間24、36、48、60、72 h。發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，確定最佳的發(fā)酵時(shí)間。

（3）不同發(fā)酵溫度對(duì)酵素品質(zhì)的影響

控制黃秋葵和火龍果的添加比例1∶1，冰糖添加量140 g/L，菌粉添加量0.75 g/L，發(fā)酵時(shí)間72 h，分別改變發(fā)酵溫度25、30、35、40、45 ℃。發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，確定最佳的發(fā)酵溫度。

（4）不同菌粉添加量對(duì)酵素品質(zhì)的影響

控制黃秋葵和火龍果的添加比例1∶1，冰糖添加量140 g/L，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間72 h，分別改變菌粉添加量0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g/L。發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，確定最佳的菌粉添加量。

1.3.3 酵素感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

邀請(qǐng)10 位感官評(píng)價(jià)員進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。以氣味、組織狀態(tài)、口感、色澤為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)黃秋葵-火龍果酵素進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1[14]。

表1 感官評(píng)分表Table 1 Sensory score table

1.3.4 正交試驗(yàn)法

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵時(shí)間、乳酸菌粉添加量、黃秋葵與火龍果添加比例、發(fā)酵溫度四個(gè)因素為自變量，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，用以確定黃秋葵-火龍果酵素配方的最佳發(fā)酵工藝（見表2）。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3.5 理化指標(biāo)測(cè)定

（1）pH

用精密pH 計(jì)測(cè)定。

（2）可溶性固形物含量

采用數(shù)顯糖度儀測(cè)定。

（3）總酸含量

采用酸堿滴定法測(cè)定酵素總酸含量，依據(jù)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》的方法測(cè)定[15]。

（4）羥自由基清除能力測(cè)定

取稀釋后的酵素樣品溶液2 mL，加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、6 mmol/L H2O2溶液2 mL，混勻靜置反應(yīng)10 min，再加入6 mmol/L 水楊酸乙醇溶液2 mL，混勻后置于37 ℃水浴鍋恒溫反應(yīng)30 min，記錄波長(zhǎng)510 nm的吸光值為Ai，用雙蒸水替代水楊酸溶液時(shí)測(cè)得吸光值為Aj，空白對(duì)照組以雙蒸水替代樣品溶液測(cè)得吸光值為A0，由公式（1）計(jì)算酵素對(duì)羥自由基的清除率[16]。

（5）色深、色調(diào)測(cè)定

參照蘭圓圓等[17]的方法稍作修改，進(jìn)行酵素色深、色調(diào)的測(cè)定。取適量酵素移入1 mm 的比色皿中，采用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定酵素在420、520、700 nm 波長(zhǎng)處的吸光值，并按照公式（2）（3）計(jì)算，所有的操作均重復(fù)3 次。

（6）色差測(cè)定

利用色差儀對(duì)酵素溶液進(jìn)行測(cè)定[18]，色差值以L*（明度）、a*（紅綠值）、b*（黃藍(lán)值）、和ΔE*（總色差）表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Origin 8.5 繪制圖表，SPSS 23.0 軟件執(zhí)行Duncan 方差顯著性分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同黃秋葵與火龍果比例對(duì)酵素品質(zhì)的影響

由圖1 可知，黃秋葵與火龍果添加比例不同，酵素的感官品質(zhì)出現(xiàn)明顯差異。當(dāng)火龍果的添加比例較大時(shí)，酵素口感甜膩、不順滑；當(dāng)黃秋葵添加量較大時(shí)，酵素黏稠度較大，顏色不透亮，發(fā)酵氣味濃郁，有少量沉淀等；當(dāng)黃秋葵與火龍果添加比例為1∶1 時(shí)，酵素清淡爽口，口感較好，感官評(píng)分最高（95 分）。因此，初步確定黃秋葵和火龍果最佳添加比例為1∶1。

圖1 不同黃秋葵與火龍果添加比例對(duì)酵素品質(zhì)的影響Fig.1 Effects of addition quantitie of okra and dragon fruit on the quality of Jiaosu

2.1.2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵素品質(zhì)的影響

由圖2 可知，發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，酵素感官評(píng)分越高；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間低于48 h，酵素口感微澀；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，酵素口感順滑，色澤透亮，狀態(tài)均勻；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間高于72 h 時(shí)，發(fā)酵液感官評(píng)分略微下降，主要是因?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，代謝產(chǎn)物不斷增加，導(dǎo)致乳酸菌的代謝能力降低，從而使酵素品質(zhì)發(fā)生變化。發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物，如有機(jī)酸，與其他產(chǎn)物在適宜條件下相互轉(zhuǎn)化，如花青素與有機(jī)酸發(fā)生酰基化、乳酸菌將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸和CO2等[19]，導(dǎo)致酵素感官評(píng)分略有下降。在發(fā)酵時(shí)間72 h 后，酵素口感差異不大，因此，黃秋葵-火龍果酵素的發(fā)酵時(shí)間應(yīng)為72 h。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵素品質(zhì)的影響Fig.2 Effects of fermentation time on the quality of Jiaosu

2.1.3 不同發(fā)酵溫度對(duì)酵素品質(zhì)的影響

由圖3 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，酵素感官評(píng)分先升高后較低。在不同的發(fā)酵溫度條件下，酵素感官評(píng)分有較大差異性。在35 ℃條件下時(shí)，酵素感官評(píng)分最高，口感最好。因?yàn)橹参锶闂U菌最適生長(zhǎng)溫度范圍為30～37℃，溫度過(guò)高或過(guò)低，其生長(zhǎng)代謝速度則會(huì)降低，導(dǎo)致酵素發(fā)酵不完全，口感較差[20-22]。因此，在黃秋葵-火龍果酵素發(fā)酵過(guò)程中，應(yīng)選擇35 ℃作為最佳發(fā)酵溫度。

圖3 不同發(fā)酵溫度對(duì)酵素品質(zhì)的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on the quality of Jiaosu

2.1.4 不同菌粉添加量對(duì)酵素品質(zhì)的影響

由圖4 可知，隨著菌粉添加量的增加，酵素的感官評(píng)分不斷提高。當(dāng)菌粉添加量大于0.75 g/L，感官評(píng)分逐漸降低，主要是因?yàn)榫蹪舛冗^(guò)高時(shí)，發(fā)酵液渾濁度增加，且酵素口感變差。當(dāng)菌粉添加量為0.25 g/L 時(shí)，酵素口感偏甜；接種量為0.75 g/L 時(shí)，感官評(píng)分最高，口感最好。因此，以0.75 g/L 的菌粉添加量最合適。

圖4 不同菌粉添加量對(duì)酵素品質(zhì)的影響Fig.4 Effects of inoculation amount on the quality of Jiaosu

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)使用Design 設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，以感官評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，由極差分析可知（表3），影響黃秋葵-火龍果酵素感官得分的主次順序?yàn)辄S秋葵與火龍果比例（A）＞發(fā)酵時(shí)間（B）＞發(fā)酵溫度（C）＞菌粉添加量（D）；由感觀分析方法得出黃秋葵-火龍果混合果蔬酵素的最佳工藝為A2B2C2D2，即黃秋葵和火龍果添加比例為1∶1、發(fā)酵時(shí)間72 h、發(fā)酵溫度35 ℃、菌粉接種量0.75 g/L時(shí)。在最佳工藝條件（A2B2C2D2）下進(jìn)行發(fā)酵制作的黃秋葵-火龍果酵素為玫紅色，色澤明亮，口感協(xié)調(diào)，酸甜適中，無(wú)雜質(zhì)，且?guī)в悬S秋葵和火龍果特有的香氣和滋味。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and result of orthogonal experiment

2.3 不同配比下的酵素性質(zhì)分析

選取三個(gè)無(wú)雜質(zhì)和沉淀、口感清甜且色澤明亮的酵素產(chǎn)品進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定，各產(chǎn)品的發(fā)酵條件如下：產(chǎn)品1 的黃秋葵火龍果添加比例1∶2，菌粉添加量0.25 g/L，冰糖添加量100 g/L，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間24 h；產(chǎn)品2 的黃秋葵火龍果添加比例2∶1，菌粉添加量0.50 g/L，冰糖添加量120 g/L，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h；產(chǎn)品3 的黃秋葵火龍果添加比例1∶1，菌粉添加量0.75 g/L，冰糖添加量140 g/L，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間72 h；其中產(chǎn)品3 是在最佳發(fā)酵工藝條件下制作的酵素產(chǎn)品。

2.3.1 理化指標(biāo)

酵素發(fā)酵過(guò)程實(shí)際上是酸化過(guò)程，酵素發(fā)酵成功的重要參考指標(biāo)是pH 值，一般值在3.0～4.0。《酵素產(chǎn)品分類導(dǎo)則》（QB/T 5324—2018）中規(guī)定，食用植物酵素一般理化指標(biāo)中，液態(tài)酵素pH≤4.5；半固態(tài)酵素pH≤4.5，以《分類導(dǎo)則》規(guī)定液態(tài)酵素pH≤4.5 的細(xì)則。由表4 可知，三種酵素產(chǎn)品的pH 值在3.55～4.07 之間，均符合食用植物酵素要求。在低pH 值的環(huán)境可以抑制有害菌的產(chǎn)生。植物乳桿菌為兼性異型乳酸菌，利用碳源代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸和酯類等代謝產(chǎn)物。在黃秋葵-火龍果酵素發(fā)酵過(guò)程中，植物乳桿菌利用火龍果、黃秋葵及冰糖中含有的碳源代謝產(chǎn)生乳酸和乙酸等有機(jī)酸，從而使酵素pH值降低[21-22]。唐敏等[14]利用乳酸菌發(fā)酵桑椹制備的酵素pH 值也在3.0～4.0 之間。

表4 不同酵素理化指標(biāo)Table 4 Physics and chemistry index of Jiaosu products

總酸度是評(píng)價(jià)產(chǎn)品風(fēng)味的一項(xiàng)指標(biāo)，酸性條件可以抑制細(xì)菌的產(chǎn)生和生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期。由表4 可知，酵素的平均總酸含量為1.05%～1.88%。總酸可以對(duì)酵素的風(fēng)味起緩沖和平衡作用。當(dāng)酵素的總酸量較少時(shí)，產(chǎn)品寡淡，無(wú)后味；當(dāng)總酸含量較多時(shí)，酵素口味刺激；當(dāng)總酸含量適中時(shí)，酵素口味適中，綿甜醇滑。產(chǎn)品2和產(chǎn)品3 酵素香醇可口，適合制作酵素飲品。

由表4 可知，酵素產(chǎn)品的可溶性固形物含量為18.37%～23.5%。當(dāng)酵素中可溶性固形物含量較低時(shí)，其口感寡薄，無(wú)層次感；而可溶性固形物含量較高時(shí)，其口感過(guò)甜，食用后胃部會(huì)產(chǎn)生不適感。經(jīng)感官評(píng)價(jià)得出酵素產(chǎn)品3 的可溶性固形物含量最為合適，適合做酵素產(chǎn)品。

2.3.2 羥基自由基清除率

羥基自由基在人體內(nèi)主要是由過(guò)氧化物負(fù)離子與過(guò)氧化氫反應(yīng)生成，過(guò)量的自由基會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷。通過(guò)測(cè)定酵素的羥自由基清除率，探究黃秋葵-火龍果酵素的抗氧化能力，結(jié)果如表5所示。三種酵素產(chǎn)品對(duì)羥基自由基均具有清除能力，產(chǎn)品3 羥基自由基的清除率最高（74.04%）。因此，黃秋葵-火龍果酵素對(duì)羥基自由基清除能力具有高效性。

表5 不同酵素的羥基自由基清除率Table 5 Hydroxyl radical scavenging of Jiaosu products

2.3.3 色深、色調(diào)

由表6 可知，酵素產(chǎn)品3 的色深值最大，色調(diào)值最低，主要是因?yàn)槠浒l(fā)酵溫度最高，發(fā)酵時(shí)間最長(zhǎng)。曾光[23]研究發(fā)現(xiàn)影響酵素色深值變化的重要因素是溫度，溫度越高，色深上升的幅度也就越大，同時(shí)色調(diào)下降的幅度也增大。酵素的色深值和色調(diào)值主要與其發(fā)酵條件有關(guān)系，不同的果蔬比例、菌粉添加量、發(fā)酵時(shí)間等因素也影響黃秋葵-火龍果酵素液的色澤。

表6 不同酵素的色深值和色調(diào)值Table 6 Color depth and hue of Jiaosu products

2.3.4 色差

酵素產(chǎn)品的顏色變化主要與其色素物質(zhì)的含量有關(guān)[24]。由表7所示，三種酵素產(chǎn)品的L*、a*和b*值不同，產(chǎn)品1 的L*值最大，說(shuō)明其色澤最明亮，原因主要是酵素原料中火龍果的添加比例較大；酵素產(chǎn)品的a*值均為正值，說(shuō)明其色澤均呈現(xiàn)亮紅色，而b*值均為負(fù)值，則說(shuō)明在發(fā)酵過(guò)程中酵素的黃色在逐漸降低，藍(lán)色在不斷加深。ΔE代表顏色變化，值越大代表顏色變化越大，三個(gè)酵素產(chǎn)品的顏色變化都較大。由表7 的結(jié)果可知，發(fā)酵結(jié)束后，黃秋葵-火龍果酵素呈現(xiàn)亮紅色，賦予了酵素飲品獨(dú)特的顏色特征。

表7 不同酵素的色差Table 7 Color parameters of Jiaosu products

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到黃秋葵-火龍果混合果蔬酵素的最佳發(fā)酵工藝，即黃秋葵、火龍果添加比例為1∶1、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間72 h、菌粉接種量為0.75 g/L。這些因素對(duì)黃秋葵-火龍果混合果蔬酵素品質(zhì)的影響由大到小依次排列為黃秋葵、火龍果的添加比量＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞菌粉接種量。

依上述比例制成的黃秋葵-火龍果混合果蔬酵素產(chǎn)品，其總酸含量為1.88%，糖度值為23.5%，pH 值為4.07，羥基自由基清除率高達(dá)74.04%以上；不同發(fā)酵條件所得的酵素的色差、色調(diào)和色深存在差異性。通過(guò)對(duì)黃秋葵-火龍果酵素工藝的優(yōu)化研究，可為黃秋葵酵素的工業(yè)化生產(chǎn)、綜合性開發(fā)以及品質(zhì)的優(yōu)化提供理論依據(jù)和技術(shù)參考，豐富了酵素產(chǎn)品種類，提高了黃秋葵的附加值。