王潔，畢金峰，吳群軍，茍敏，周潤(rùn)生，陳芹芹*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）（2.旬陽(yáng)縣太極緣生物科技有限公司，陜西安康 725700）

拐棗又稱枳椇（Hoveniadulcis），是一種鼠李科（Rhamnaceae）枳椇屬植物，用于中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)已有上千年歷史，其葉子、種子、果梗、樹皮和根均可入藥，具有消渴、解酒、護(hù)肝等功效[1]。拐棗果實(shí)產(chǎn)量豐富，每畝年產(chǎn)量可達(dá)2 000～3 000 kg。拐棗中含有多種生物活性功能成分，如多糖、黃酮、生物堿等，其中拐棗多糖作為一種天然的高活性物質(zhì)，在拐棗中干重占比高達(dá)10.47%[2]。拐棗果梗多糖具有良好的降糖作用，能夠有效抑制α-葡萄糖苷酶活性[3-5]、使大鼠體重增加[6]、降低空腹血糖[7]。且相比于傳統(tǒng)的藥物治療，多糖具有細(xì)胞毒性低、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，因此成為了治療糖尿病及其并發(fā)癥的理想藥物。多糖的降血糖特性歸因于許多分子機(jī)制，如通過對(duì)氧化應(yīng)激損傷的防御以減少糖尿病及其并發(fā)癥[8]，調(diào)節(jié)和延緩主要消化酶α-葡萄糖苷酶的活性以降低胃腸道中碳水化合物的吸收率，對(duì)PI3K/Akt、MAPK等胰島素信號(hào)通路的激活作用等[9]。

拐棗的果實(shí)包括果梗及種子，其中果梗約占果實(shí)鮮重的90%以上[10]。目前，果梗多用于飲料生產(chǎn)，產(chǎn)品種類較少，大多只是經(jīng)過簡(jiǎn)單粗加工便進(jìn)入市場(chǎng)，產(chǎn)品資源附加值較低[6]。拐棗籽多用于傳統(tǒng)中藥，研究多集中于小分子物質(zhì)如黃酮的提取及活性分析[11]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，從植物不同部位獲得的多糖具有不同的性質(zhì)[12]。辛玥等[13]研究發(fā)現(xiàn)豇豆多糖的全豆多糖與子葉多糖結(jié)構(gòu)相似，與種皮多糖差異性較大，且種皮多糖的抗氧化活性要明顯強(qiáng)于其他多糖。Bai等[14]對(duì)人參不同部位多糖的提取率及結(jié)構(gòu)與活性差異進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，不同部位多糖提取率的大小順序?yàn)楦净ǎ救~，人參花多糖的分子量最低，抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性最佳。然而，目前對(duì)拐棗資源的研究及利用方面多集中在拐棗果梗多糖，但對(duì)于拐棗籽、果梗及全果多糖的提取率、結(jié)構(gòu)、活性的對(duì)比還缺乏系統(tǒng)的研究。因此，本研究對(duì)拐棗不同部位（拐棗籽、果梗及全果）多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性進(jìn)行比較，相關(guān)結(jié)果將為拐棗多糖在降血糖方面的潛在應(yīng)用及拐棗的全果開發(fā)利用提供理論依據(jù)，為提升拐棗資源的附加值提供一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

拐棗，由陜西安康旬陽(yáng)縣太極緣生物科技有限公司提供。

HepG2細(xì)胞，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞資源中心；無水乙醇、丙酮、乙醚，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四硼酸鈉、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-Nitrophenyl-α-D-Glucopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶、胰島素、地塞米松，上海源葉生物科技公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-Amino-Bis(2-Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonic Acid) Ammonium Salt，ABTS），美國(guó)Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶，美國(guó)Gibco公司；葡萄糖含量試劑盒，蘇州格銳思生物科技公司；以上試劑除特別說明外均是分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

CPA-12電子天平，德國(guó)Sartorius公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)箱、DK-S26電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JP-150高速多功能粉碎機(jī)，永康久品工貿(mào)有限公司：3K15離心機(jī)，艾本德中國(guó)有限公司；VORTEX-5旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；S-570掃描電子顯微鏡，日本日立公司；ICS-3000離子色譜儀，美國(guó)戴安公司；DAWN HELEOS-II多角度激光光散射/凝膠色譜聯(lián)用儀，美國(guó)Wyatt公司；TENSOR27傅里葉紅外儀，德國(guó)Bruker公司；雷磁PHS-3C pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Varioskan Flash酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Scientific。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 拐棗多糖的提取

水提醇沉法制備拐棗多糖[4,15]。將拐棗籽、果梗及全果于60 ℃下烘干，再分別用植物粉碎機(jī)粉碎，過60目篩。取各部位粉末各100 g，加入φ=95%乙醇250 r/min磁力攪拌24 h，期間更換乙醇4次，以除去脂肪、色素等小分子物質(zhì)。抽濾，棄去上清液，將殘?jiān)煤嫦渲?0 ℃干燥。

稱取10 g預(yù)處理的各部位原料，按照1:30的料液比，90 ℃水浴浸提多糖3 h，離心，獲得上清液，殘?jiān)酝瑯拥臈l件處理一次，合并上清液，50 ℃旋蒸濃縮至原體積的1/3。加入3%（m/V）的胰酶，37 ℃震蕩4 h，以除去游離蛋白質(zhì)，酶解完成后，沸水浴10 min滅酶，冷卻至室溫，離心除去沉淀物。向多糖提取液中加入4倍體積無水乙醇，4 ℃靜置過夜，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀。沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，干燥后得到各部位多糖。

1.3.2 多糖成分分析

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖中的總糖含量[16]；糖醛酸含量參照Peng等[17]的方法，采用分光光度法，以半乳糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定；以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定多糖中的蛋白質(zhì)含量[18]；以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林酚法測(cè)定多糖中的酚類含量[19]。

1.3.3 分子量分布測(cè)定

采用高效尺寸排阻色譜（HPSEC）系統(tǒng)分析拐棗多糖的分子量。HPSEC系統(tǒng)配備有TSK凝膠柱（TSK Gel G4000PWxl，300×7.8 mm）、激光散射檢測(cè)器（DAWN HELEOS II，Wyatt Technology）、紫外檢測(cè)器（L-2400，Wyatt Technology）和示差折光儀（RI）（OptilabrEX，Wyatt Technology）。10.0 mg拐棗多糖完全溶解于0.1 mol/L氯化鈉水溶液中，之后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。然后將樣品（200 μL）注入TSK凝膠柱。用0.1 mol/L的NaCl溶液、流速0.5 mL/min洗脫30 min，柱溫為35 ℃。

1.3.4 單糖組成

根據(jù)Zhou等[20]報(bào)道的方法，采用ICS-3000離子色譜系統(tǒng)（Dionex，Sunnyvale，CA，USA）對(duì)拐棗多糖的單糖組成進(jìn)行了分析，并進(jìn)行了適當(dāng)修改。稱取約10 mg多糖于水解管中，準(zhǔn)確記錄多糖質(zhì)量。加入4 mL 2 mol/L的三氟乙酸，充氮1 min排除空氣，于120 ℃烘箱中水解2 h，冷卻后氮吹除去三氟乙酸，蒸餾水溶解定容至5 mL。樣品稀釋一定倍數(shù)，過0.2 μm濾膜后進(jìn)樣。使用Carbo Pac PA20類型的分析柱，選用0.25 mol/L氫氧化鈉及1 mol/L醋酸鈉作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相，檢測(cè)器采用脈沖安培檢測(cè)器。

1.3.5 紅外光譜

將干燥的多糖樣品（2 mg）與KBr粉末混合研磨后壓片，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)，用Vector 33紅外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，以溴化鉀為對(duì)照扣除背景[21]。

1.3.6 抗氧化活性測(cè)定

1.3.6.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Wang等[22]的方法，對(duì)多糖的DPPH自由基除能力進(jìn)行測(cè)定，并稍作修改。用φ=80%甲醇配制濃度為100 μmol/L的DPPH溶液，將HDP溶解在去離子水中以獲得各種濃度梯度的多糖溶液，然后將80 μL DPPH溶液加入到40 μL樣品溶液中?；旌虾笥谑覝叵卤芄夥磻?yīng)，30 min后用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)517 nm下測(cè)量吸光值，每個(gè)樣品做三個(gè)平行。以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)以下公式計(jì)算DPPH自由基清除率：

式中：

A2——樣品組的吸光度；

A1——對(duì)照組吸光度，包括80 μL 80%甲醇溶液和40 μL樣品；

A0——空白組的吸光度，包括80 μL DPPH和40 μL去離子水。

1.3.6.2 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)

使用去離子水制備樣品溶液（0～10 mg/mL）。用移液器吸取0.1 mL待測(cè)液，加入3.6 mL ABTS溶液完全混合，室溫靜置1 min，然后測(cè)量波長(zhǎng)為734 nm的反應(yīng)溶液的吸光度值[23]。ABTS自由基清除率計(jì)算如下：

式中：

A2——樣品組的吸光度；

A1——對(duì)照組吸光度，包括3.6 mL的80%甲醇溶液和0.1 mL多糖樣品；

A0——空白組的吸光度包括3.6 mL的ABTS和0.1 mL去離子水。

1.3.7α-葡萄糖苷酶抑制活性實(shí)驗(yàn)

參考Jia等[24]的方法測(cè)定多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力，并稍作修改。將40 μL的α-葡萄糖苷酶溶液與40 μL多糖溶液混合均勻，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育15 min，然后向混合溶液中加入20 μL PNPG溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，混勻后于37 ℃孵育15 min，最后向反應(yīng)液中加入150 μL碳酸鈉溶液停止反應(yīng)后，于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。HDP對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率計(jì)算如下：

式中：

A2——樣品組的吸光度，反應(yīng)物包括40 μL多糖、40 μL酶和20 μL PNPG的混合液；

A1——對(duì)照組的吸光度，是緩沖溶液代替酶溶液后混合物的吸光度值；

A0——空白組的吸光度，是緩沖溶液代替樣品溶液的吸光度值。

1.3.8 拐棗多糖樣品對(duì)HepG2胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖攝取的測(cè)定

1.3.8.1 拐棗多糖樣品對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

接種200 μL HepG2細(xì)胞于96孔板中，使細(xì)胞密度為每孔2×104個(gè)，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，至細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，吸出培養(yǎng)基，每孔加入200 μL含有多糖樣品的培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置空白組、對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后用PBS洗滌1次，每孔加入200 μL的培養(yǎng)基及20 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去除MTT溶液后，在每孔中加入150 μL二甲亞砜，震蕩10 min后在490 nm處測(cè)定各孔的吸光值[25]。

式中：

A樣品——添加多糖及細(xì)胞；

A對(duì)照——添加細(xì)胞未添加多糖；

A空白——未添加多糖和細(xì)胞。

1.3.8.2 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型葡萄糖攝取的建立

將200 μL HepG2細(xì)胞以每孔2×104個(gè)的密度接種于96孔板上，培養(yǎng)過夜后，移去培養(yǎng)基。PBS洗滌，分別以終濃度為5×10-7mol/L的胰島素DMEM培養(yǎng)液[25]、終質(zhì)量濃度為10 μg/mL的胰島素和0.5 mmol/L的油酸的DMEM培養(yǎng)液[6]、含有3 μmol/L地塞米松[26]的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法，根據(jù)葡萄糖試劑盒步驟測(cè)定上清液葡萄糖含量，并按公式（5）計(jì)算葡萄糖消耗率，選擇葡萄糖消耗能力最弱組為胰島素抵抗模型。

式中：

R——葡萄糖消耗率，%；

C空白——未添加細(xì)胞組的葡萄糖含量，mg/mL；

C模型——添加細(xì)胞及多糖組的葡萄糖含量，mg/mL。

1.3.8.3 葡萄糖消耗率測(cè)定

胰島素抵抗細(xì)胞模型建立之后，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗滌后，吸去各孔培養(yǎng)液，加入含有不同濃度多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，結(jié)束后吸取上清液采用葡萄糖試劑盒測(cè)定葡萄糖含量，并計(jì)算葡萄糖消耗率。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26軟件進(jìn)行單因素方差分析和鄧肯多重比較，P＜0.05表示差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；使用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取率及化學(xué)組成分析

拐棗不同部位水提多糖（HoveniadulcisPolysaccharide，HDP）的得率與化學(xué)組成如表1所示。全果多糖（Whole Fruit Polysaccharide ofH.dulcis，HDPW）、籽多糖（H.dulcisSeed Polysaccharide，HDPS）和果梗多糖（H.dulcisPeduncles Polysaccharide，HDPP）的得率分別為3.83%、2.69%、3.00%，三個(gè)部位的得率沒有顯著性差異。三種多糖的總糖、糖醛酸、蛋白和總酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別為30.98%～33.46%、3.72%～13.75%、9.21%～27.39%、8.02%～14.87%，其中糖醛酸含量，蛋白含量及總酚含量存在顯著性差異（P＜0.05）。HDPP的總糖含量及總酚含量最高，分別占比33.46%和14.87%，總糖含量與Liu等[27]報(bào)道的33.34%含量近似，總酚含量低于Liu等報(bào)道的27.76%，這可能與拐棗的產(chǎn)地及采收期的不同有關(guān)。HDP中存在蛋白及酚，可能是由于氫鍵和疏水相互作用以及疏水腔和裂縫的存在會(huì)介導(dǎo)多糖與蛋白及酚形成偶聯(lián)物[28]，拐棗多糖傾向于以結(jié)合物的形式存在，是由拐棗的原料特性所決定，茶葉、洋甘菊、紫錐花、加拿大飛蓬等植物的多糖存在相似的情況[29]。

表1 拐棗不同部位多糖的提取率及化學(xué)組成Table 1 Yield and chemical composition of polysaccharides from different sources of H.dulcis

2.2 分子量及單糖組成

采用高效凝膠排阻色譜測(cè)定了不同部位多糖的分子量，如表1所示。三種多糖分子量的色譜峰均出現(xiàn)三個(gè)尖峰，三個(gè)分子峰的分布范圍分別為476.90×104～865.25×104u、12.53×104～165.75×104u、0.34×104～45.72×104u。HDPS的中、低分子量值（45.72×104～165.75×104u）要高于HDPW（0.34×104～12.53×104u）和HDPP（0.51×104～21.26×104u）。

Mw/Mn，為多分散性指數(shù)，反映了聚合物摩爾質(zhì)量分布的寬度。單分散聚合物的多分散性指數(shù)值為1，較高的Mw/Mn值表示較寬的摩爾質(zhì)量分布[30]。其中HDPW、HDPS、HDPP峰1～3的Mw/Mn范圍分布分別為1.43～2.08、1.23～3.42和1.46～2.33。多分散性指數(shù)均高于1，但其數(shù)值較小，說明拐棗多糖由多分散雜多糖組成，分子質(zhì)量分布廣泛。

根據(jù)離子色譜分析，三種多糖均為非均一性多糖，它們主要由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸組成，但是單糖組成摩爾比存在顯著性差異（P＜0.05）。HDPS的主要單糖成分為半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖，而HDPW和HDPP的優(yōu)勢(shì)單糖為葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖，但二者摩爾比不同，分別為51.66:22.85:14.03和30.77:35.32:19.90。在糖醛酸摩爾比方面，三種多糖中HDPS的半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸所占摩爾比值總和最高，這與糖醛酸指示劑的測(cè)定結(jié)果趨勢(shì)相同。

2.3 紅外光譜

多糖的紅外光譜如圖1所示，三種多糖的圖譜未出現(xiàn)較多的個(gè)數(shù)變化及明顯的位置偏移，三種多糖均在3 390、2 931、1 618、1 230 cm-1等處出現(xiàn)吸收峰。3 390 cm-1處的強(qiáng)吸收峰，為多糖羥基的O-H伸縮震動(dòng)，2 931 cm-1處的吸收峰，為多糖C-H伸縮振動(dòng)引起，1 230 cm-1處是硫酸基中S=O的伸縮振動(dòng)吸收[31]。1 618 cm-1處的強(qiáng)峰為羧基（COO-）的特征峰，表明含有糖醛酸[3]，這與糖醛酸測(cè)定結(jié)果及單糖分析結(jié)果相一致。1 200～1 000 cm-1波數(shù)之間的強(qiáng)吸收峰處的譜帶顯示了C-O-C和C-O-H鍵的存在，表明多糖內(nèi)含有吡喃糖環(huán)[32]。1 399 cm-1處吸收峰是-CH2的變形吸收峰[33]。在880 cm-1和840 cm-1位置處的吸收峰出現(xiàn)了區(qū)別。880 cm-1處的吸收峰表明HDPS含有β-糖苷鍵連接的吡喃糖，840 cm-1處的特征吸收峰表明HDPP和HDPW含有α-糖苷鍵連接的吡喃糖[34]。

圖1 HDPW、HDPS和HDPP的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of HDPW, HDPS and HDPP

2.4 抗氧化活性分析

氧化反應(yīng)與許多疾病密切相關(guān)，如糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生，氧化應(yīng)激能夠啟動(dòng)一系列導(dǎo)致胰島素抵抗和糖尿病的有害通路，因此通過抗氧化治療以減輕氧化應(yīng)激對(duì)人體的損傷，已成為防治糖尿病的有效途徑之一。

三種多糖和Vc的DPPH自由基清除率如圖2a所示。HDP均對(duì)DPPH具有良好的清除能力，且清除效果與多糖的質(zhì)量濃度呈劑量依賴關(guān)系。HDPW、HDPS、HDPP對(duì)DPPH自由基的IC50值分別為0.016、0.043和0.015 mg/mL（P＜0.05），3種拐棗多糖和Vc對(duì)DPPH自由基的清除能力由大到小依次為Vc＞HDPP＞HDPW＞HDPS。圖2b為三種多糖對(duì)ABTS+自由基的清除效果。HDPW、HDPS、HDPP均具有良好的ABTS+自由基清除能力，隨著拐棗多糖質(zhì)量濃度增加，ABTS+自由基清除能力均呈上升趨勢(shì)。HDPW、HDPS、HDPP和Vc對(duì)ABTS+自由基的IC50值分別為0.47、1.21、0.49和0.10 mg/mL（P＜0.05），其中HDPW的清除能力最強(qiáng)，但HDP都弱于Vc的清除能力。

圖2 HDPW、HDPS和HDPP對(duì)DPPH自由基（a）和ABTS+自由基（b）的清除能力Fig.2 Scavenging activity of DPPH free radical (a) and ABTS+free radical (b) of HDPW, HDPS and HDPP

植物多糖的抗氧化活性在很大程度上取決于化學(xué)組成、分子量以及分支的程度和大小[35,36]。多糖的分子量與其生物活性密切相關(guān)[33]，低分子量的多糖由于其末端具有較強(qiáng)的還原羥基，往往具有較強(qiáng)的抗氧化活性。從表2所示，HDPW、HDPP的中低分子量低于HDPS，這意味著分子量可能是影響HDP還原能力的因素之一。分子量大的高聚物結(jié)構(gòu)緊湊，分子內(nèi)氫鍵的作用更強(qiáng)。分子內(nèi)氫鍵的強(qiáng)烈作用削弱了羥基的活性，可能限制了其羥基暴露的機(jī)會(huì)，這可能是其自由基清除活性降低的原因[37]。

表2 拐棗不同部位多糖的分子量（Mw）、多分散性（Mw/Mn）和單糖組成（%）Table 2 Monosaccharide composition and molar ratio of polysaccharides from different sources of H.dulcis (%)

2.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性

α-葡萄糖苷酶位于小腸中，可以將攝入的淀粉分解為葡萄糖使餐后血糖水平升高，因此，通過抑制α-葡萄糖苷酶活性調(diào)節(jié)飲食后的血糖峰值是一個(gè)很好的策略。目前，α-葡萄糖苷酶抑制模型已被廣泛用于評(píng)價(jià)藥物體外降糖活性[21]。圖3為不同質(zhì)量濃度的HDP對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。HDP在體外條件下對(duì)α-葡萄糖苷酶具有的劑量依賴性抑制作用。多糖質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL時(shí)，HDPW、HDPS、HDPP對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，分別為91.77%、51.36%和89.02%，IC50值分別為0.14、9.99和0.13 mg/mL，抑制能力從大到小為HDPP＞HDPW＞HDPS，這可能是由于HDPP和HDPW的中低分子量較低。Xu等[38]用H2O2對(duì)黑加侖多糖進(jìn)行了降解，獲得了兩種更低分子量的多糖，降解后的多糖比原多糖具有更佳的抗氧化、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，且分子量越低，活性越高。此外，紅外光譜顯示HDPP和HDPW中含有α-糖苷鍵而HDPS中含有β-糖苷鍵，前人研究表明，含有α-糖苷鍵的多糖會(huì)顯示出更好的生物活性，如南方紅豆杉的抗腫瘤活性[39]，桑黃菌絲體的抗氧化及腫瘤抑制活性[40]。

圖3 HDPW、HDPS和HDPP對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig.3 Inhibitory effects of HDPW, HDPS and HDPP on α-glucosidase

2.6 拐棗多糖樣品對(duì)HepG2胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖攝取的測(cè)定

2.6.1 拐棗多糖樣品對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

采用MTT法檢測(cè)多糖及鹽酸二甲雙胍對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖4所示。0.05～1 mg/mL濃度下的多糖樣品及二甲雙胍均無細(xì)胞毒性，當(dāng)HDPW和HDPP的質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，HepG2存活率顯著降低，分別為18.57%和20.96%。而二甲雙胍組質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率83.88%，細(xì)胞存活率顯著降低。因此分別選取0.05、0.10、0.50 mg/mL作為低、中、高劑量組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 HDP對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effects of HDP on the survival rate of HepG2 cells

2.6.2 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型（IR-HepG2）的建立

在胰島素、胰島素聯(lián)合油酸、地塞米松的作用下，HepG2的葡萄糖消耗率較空白組均發(fā)生顯著降低，葡萄糖消耗率分別減少了10.42%、7.64%及14.41%（圖5）。其中地塞米松作為誘導(dǎo)劑時(shí)其葡萄糖消耗率降低效果最明顯，因此選用地塞米松作為后續(xù)IR-HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)劑。

圖5 不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)構(gòu)建IR-HepG2Fig.5 Construction of IR-HepG2 induced by different inducers

2.6.3 葡萄糖消耗量測(cè)定

胰島素抵抗是引發(fā)Ⅱ型糖尿病的主要原因，肝細(xì)胞作為胰島素作用的主要靶細(xì)胞，發(fā)生胰島素抵抗后主要表現(xiàn)為葡萄糖利用率降低，由此引發(fā)空腹高血糖癥狀。HepG2細(xì)胞具有與正常肝細(xì)胞相同的糖代謝功能，且更易培養(yǎng)，被廣泛用于篩選糖尿病治療藥物。圖6為多糖對(duì)胰島素抵抗的治療效果。加入多糖后，IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收率較模型組有所提高。其中HDPS的胰島素抵抗改善效果弱于HDPW和HDPP，中高劑量組的HDPW和HDPP可顯著提高IR-HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗率。在多糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，HDPW、HDPP較模型組的葡萄糖吸收率可提高7.52%、7.66%，但是HDPS較模型組沒有顯著的提高作用。各劑量組內(nèi)的HDPW和HDPP的葡萄糖消耗促進(jìn)能力沒有顯著性差異。這種降糖活性與它們的結(jié)構(gòu)特征有關(guān)，低分子量的HDPP和HDPW具有較好的胰島素抵抗改善能力，這可能是低分子量的多糖更容易進(jìn)入細(xì)胞，更容易修復(fù)IR-HepG2細(xì)胞的表面損傷。

圖6 HDP對(duì)IR-HepG2葡萄糖消耗率影響Fig.6 Effect of HDP on glucose consumption rate of IR-HepG2

3 結(jié)論

本研究采用水提醇沉法制備了拐棗全果、籽及果梗三種部位的多糖，HDPW、HDPS、HDPP得率分別為3.83%、2.69%、3.00%。其中，HDPW及HDPP具有α-糖苷鍵結(jié)構(gòu)，而HDPS具有β-糖苷鍵結(jié)構(gòu)。HDPP和HDPW的抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性及胰島素抵抗改善能力明顯高于HDPS。HDPW具有最佳的ABTS清除活性，而在DPPH清除、α-葡萄糖苷酶抑制及胰島素抵抗改善能力方面，HDPW和HDPP之間沒有顯著性差異。由于果梗與籽的分離較為繁瑣，所以在工業(yè)上可以考慮進(jìn)行全果綜合利用。