樊漣漪,鄧勝利

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院 骨科麻醉,陜西 西安 710038;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 麻醉醫(yī)學(xué)院,貴州省麻醉與器官重點保護實驗室,貴州 遵義 563099;3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 麻醉科,貴州 遵義 563099)

缺血性心臟病目前是人類死亡的主要原因之一,而心肌梗死(myocardial infarction,MI)尤其急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是缺血性心臟病最常見原因,它發(fā)病驟急,患者預(yù)后極差［1]。

SOX家族蛋白是一組具有高度保守結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子,SOX9的下調(diào)可導(dǎo)致心室心肌細胞減少,影響心肌的正常生長［2],另缺失SOX9的胚胎大多在妊娠中期即死亡,其原因可能是由于心內(nèi)膜墊細胞遷移受阻和凋亡增加［3],導(dǎo)致此類胚胎心內(nèi)膜墊嚴重發(fā)育不良,誘發(fā)充血性心衰。隨后研究發(fā)現(xiàn),SOX9是心肌缺血損傷后導(dǎo)致后期心臟纖維化的主要調(diào)控因子［4]。近來文獻報道缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)過表達時SOX9表達增加,而HIF-1已被證實可通過多種途徑發(fā)揮心肌保護效應(yīng)［5]。還有研究認為,SOX9可調(diào)控與心肌缺血密切相關(guān)的AP-1、Wnt等基因［6-9]。以上研究提示SOX9可能與心肌的缺血損害存在一定相關(guān),明確它們之間關(guān)系可能會對尋找抗心肌缺血損害的治療靶點提供新思路。

目前眾多的研究證實,SOX9與炎性反應(yīng)的調(diào)控有關(guān)［10],但其研究卻表現(xiàn)出不同的觀點與結(jié)果。在肝臟方面研究認為,抑制SOX9可減少白介素6(interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor a,TNF-α)等炎性因子的釋放,進而減輕炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的肝缺血損傷［11];在軟骨細胞炎癥中研究發(fā)現(xiàn),SOX9表達的上調(diào)與血清IL-6等炎性因子的增高呈正比［12],即SOX9的表達與炎性反應(yīng)呈正相關(guān)。然在牙髓炎的研究中,敲除SOX9卻可導(dǎo)致白介素8(interleukin 8,IL-8)表達增加,加速誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［13],呈現(xiàn)負相關(guān)。但在發(fā)生AMI時,心肌SOX9與炎性因子及心肌損害標志物之間的關(guān)系如何尚未見報道。

基于上述原因,本研究通過建立大鼠心肌梗死模型,觀察AMI缺血不同時間對心肌SOX9的表達變化及血清高敏肌鈣蛋白(high-sensitivity cardiac troponin, hs-cTn)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)等心肌損害標志物與IL-6、TNF-α炎性因子的改變;同時測量心肌梗死面積,觀察線粒體超微結(jié)構(gòu),以明確SOX9與急性心肌缺血損害、心肌損害標志物及炎性因子之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 本實驗選用健康SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,實驗時體重250～300 g,周齡為8～9周。按照隨機數(shù)字表法分為兩組,分別建立急性心肌梗死模型與假手術(shù)模型:心肌梗死組(MI組,n=45)與假手術(shù)組(Sham組,n=36)。兩組模型建立成功后又隨機分為0.5、8、24 h進行各項指標的檢測。Sham組各時點大鼠建模各12只,共36只均存活。MI組0.5 h時點建模15只,存活13只;8 h時點建模15只,存活12只;24 h時點建模15只,存活11只;MI組總體死亡9只。

1.2 主要試劑及儀器 2、3、5 氯化三苯基四氮唑(2、3、5-triphenytetrazoliumchloride,TTC)、酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA,北京索萊寶科技有限公司);蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);兔多抗SOX9(艾博抗上海貿(mào)易有限公司);ALC-V8型小動物呼吸機、JEM-1400plus型透射電子顯微鏡、Varioskan Flash型多功能酶標儀、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、垂直電泳儀、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀。

1.3 方法

1.3.1 心梗模型的建立 建立MI模型:參照文獻［14]建立。MI模型:采用2%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)對大鼠進行腹腔內(nèi)注射麻醉。行氣管插管成功后連接呼吸機,呼吸機參數(shù)設(shè)置為呼吸頻率:80次/min,潮氣量為15 mL/kg,吸呼比為1∶1,吸入95%氧氣與5%二氧化碳混合氣體;消毒鋪巾,于大鼠左側(cè)胸壁3～4肋間下橫向開胸,逐層暴露心臟,在冠狀動脈左側(cè)主干處、左心耳下方2～3 mm處位置,將冠狀動脈左前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)用6.0帶線縫合針穿過并結(jié)扎(進針深度1～1.5 mm,寬約2.0 mm)。結(jié)扎后即刻可見:結(jié)扎區(qū)域及左室前壁心肌組織變白,心電圖顯示ST段抬高,此為心梗建模成功的標志;而假手術(shù)對照組則只對LAD血管穿線不結(jié)扎。術(shù)畢用青霉素10萬U肌肉注射預(yù)防感染。

1.3.2 TTC染色法檢測大鼠心肌梗死面積 稱取0.1 g TTC 37 ℃恒溫孵育約25 min;將剪取的心臟置于-80 ℃冰箱中冷凍7～8 min;均勻橫切至5～7片,于37 ℃1%TTC染液中恒溫染色15～20 min;置于4%多聚甲醛中固定,24 h后相機拍照備用;使用Image-J軟件對照片進行測量分析,計算心肌梗死面積。其梗死面積(%)=心肌切片白色梗死面積/心肌切片左室總面積×100%。

1.3.3 透射電鏡觀察大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu) 切取左室前壁中線靠近結(jié)扎區(qū)心肌組織,將標本切至1 mm×1 mm×1 mm大小,并置于4%的戊二醛ep管中固定,于透射電鏡下進行心肌超微結(jié)構(gòu)的檢測。按Flameng標準進行評分。

1.3.4 ELISA法檢測血清中hs-cTn、CK-MB、肌紅蛋白(myoglobin,Mb)及IL-6、TNF-α的含量 按相關(guān)試劑盒說明書,通過ELISA法對血清中hs-cTn、CK-MB、Mb及IL-6、TNF-α等指標進行檢測。

1.3.5 Western-blot法檢測SOX9蛋白的相對表達量 根據(jù)試劑說明書提取心肌組織總蛋白,同時按步驟進行BCA法測蛋白濃度,將提取的蛋白變性后于-20 ℃保存,制備好電泳裝置后,進行電泳、電轉(zhuǎn)、封閉、抗體孵育后,最后曝光,應(yīng)用ImageJ軟件進行條帶分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積的變化 Sham組各時間點未發(fā)生心肌梗死現(xiàn)象;MI組與Sham組相比,各時點兩組之間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),MI組出現(xiàn)不同程度的心肌梗死灶;MI組內(nèi)心肌梗死面積24 h時點大于8 h時點,8 h時點大于0.5 h時點,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其心肌梗死面積呈現(xiàn)逐漸增加(圖1、表1)。

圖1 各組大鼠心肌梗死TTC染色結(jié)果

表1 各組大鼠心肌梗死面積結(jié)果

2.2 大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變及心肌線粒體Flameng評分

2.2.1 心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化 透射電鏡下Sham組各時點線粒體數(shù)目較多,結(jié)構(gòu)完整清晰、排列整齊,基質(zhì)內(nèi)電子密度高,肌纖維排列整齊;0.5 h時點MI組除線粒體基質(zhì)內(nèi)電子密度稍有降低外,余未見明顯改變;8 h時點MI組線粒體數(shù)量減少,部分線粒體腫脹、膜結(jié)構(gòu)消失,線粒體嵴變短變淺、斷裂,基質(zhì)內(nèi)電子密度明顯降低,肌纖維少部分溶解斷裂;24 h時點MI組線粒體大部分溶解消失,所殘存線粒體結(jié)構(gòu)不清,內(nèi)呈空泡狀,肌纖維溶解斷裂成團(圖2)。

標尺分別為2 μm和1 μm。圖2 各組大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)

2.2.2 心肌線粒體Flameng評分結(jié)果 Sham組各時點線粒體評分無統(tǒng)計學(xué)差異;MI組與Sham組相比,0.5 h時點線粒體評分無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),8 h及24 h時點線粒體評分明顯增加(P<0.05);MI組內(nèi)情況:與0.5 h時點相比,8 h及24 h時點線粒體評分增加,且24 h時點線粒體評分高于8 h時點(P<0.05,圖3、表2)。

*:P<0.05。圖3 各組大鼠心肌線粒體評分結(jié)果

2.3 各組大鼠血清中hs-cTn、CK-MB、Mb及IL-6、TNF-α的變化 Sham組各時點血清hs-cTn、CK-MB、Mb心肌損傷標志物與IL-6、TNF-α炎性因子檢測量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。MI組與Sham組相比:8 h及24 h時點hs-cTn、CK-MB、Mb與IL-6、TNF-α均增加(P<0.05),但在0.5 h時點IL-6、TNF-α檢測量增加(P<0.05),而hs-cTn、CK-MB、Mb無差異(P>0.05);MI組內(nèi)情況:8 h及24 h時點所有心肌損傷標志物與炎性因子較0.5 h時點增加,且24 h時點較8 h時點高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表3～7、圖4)。

表2 各組大鼠心肌線粒體Flameng評分情況

表3 各組大鼠血清hs-cTn變化情況

表4 各組大鼠血清CK-MB變化情況

表5 各組大鼠血清Mb變化情況

表7 各組大鼠血清TNF-α變化情況

A、B、C:分別為心肌損傷標志物hs-cTn、Mb、CK-MB結(jié)果;D、E:分別為炎癥指標IL-6、TNF-α結(jié)果;圖4 各組大鼠血清中心肌損傷標志物及炎癥指標檢測結(jié)果

2.4 各組大鼠心肌組織中SOX9蛋白表達量的變化 Sham組各時間點大鼠心肌組織中SOX9 蛋白表達量無明顯變化(P>0.05)。MI組與Sham組相比,在24 h時點心肌組織SOX9 蛋白表達量出現(xiàn)明顯下降(P<0.05),在0.5 h及8 h時點無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);MI組內(nèi)情況:與0.5 h時點相比,24 h時點大鼠心肌組織SOX9蛋白表達量明顯下降(P<0.05),而8 h時點與0.5 h時點及24 h時點與8 h時點相比,蛋白下降差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,表8、圖5)。

A:SOX9蛋白的免疫印跡圖;B:SOX9蛋白表達量化結(jié)果;圖5 各組大鼠心肌組織中SOX9蛋白表達量結(jié)果

2.5 大鼠心肌組織SOX9蛋白表達變化與血清炎癥因子及心肌損傷標志物變化的相關(guān)性分析 AMI后24 h內(nèi),缺血心肌SOX9蛋白表達量隨著缺血時間的延長而逐漸下降,血清炎性因子及心肌損傷標志物逐漸升高。SOX9蛋白水平的下降與血清炎性因子及心肌損傷標志物含量的上升呈負相關(guān)性(相關(guān)值分別為:hs-cTn,r=-0.641;CK-MB,r=-0.707;TNF-α,r=-0.722;IL-6,r=-0.684)(P<0.05,表9、圖6)。

表9 24 h內(nèi)AMI大鼠心肌SOX9蛋白表達量與血清炎癥因子及心肌損傷標志物水平的相關(guān)性

圖6 24 h內(nèi)AMI大鼠心肌SOX9蛋白表達量與血清炎癥因子及心肌損傷標志物變化的相關(guān)性分析

3 討論

急性心梗后24 h內(nèi)早期予以治療可明顯減少患者死亡率及遠期并發(fā)癥［15-18];同時對AMI的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),心肌因缺血和缺氧,可迅速引發(fā)炎性因子風(fēng)暴,影響患者預(yù)后。故深入研究AMI的病理生理改變及機制,可為治療AMI尋求新的靶點。SOX9作為心臟發(fā)育基因,目前在AMI時的變化及相關(guān)作用不清。故本研究圍繞大鼠24 h內(nèi)AMI展開SOX9的相關(guān)研究。

目前關(guān)于大鼠MI模型的建立有冠脈結(jié)扎法［14],藥物誘導(dǎo)法［19],冰烙法［20]等。冠脈血管結(jié)扎法更加明確可靠,與臨床心梗更相符合,且模型相對穩(wěn)定［14],故本實驗選擇冠脈結(jié)扎法進行MI的造模。而本研究的結(jié)果示血清心肌損傷標志物及心肌梗死面積等的增加與出現(xiàn)均證實MI模型的建立成功。

MI后出現(xiàn)不同程度的心梗面積,且心梗面積呈逐漸增加趨勢,明確說明MI模型建立成功。同時發(fā)現(xiàn)MI后8 h及24 h線粒體發(fā)生明顯破壞,且24 h較8 h破壞程度嚴重,說明缺血到達一定時間可導(dǎo)致線粒體損傷,并隨缺血時間延長而逐漸加重。而本實驗發(fā)現(xiàn)單純開胸及心肌缺血0.5 h不會引起線粒體明顯損害,這與既往報道一致［21]。關(guān)于在0.5 h時點,MI組出現(xiàn)通過TTC染色顯示發(fā)生心梗,而線粒體超微結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯損傷這一“矛盾”現(xiàn)象。我們分析考慮可能主要與TTC染色判斷心梗的原理有關(guān),即TTC染色是通過組織中脫氫酶將氧化型TTC還原為還原型TTC使心肌表現(xiàn)為磚紅色;一旦脫氫酶減少則TTC不能被還原而呈現(xiàn)白色。而有研究認為［22],心肌缺血30 min在線粒體結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化時琥珀酸脫氫酶含量則明顯下降,也即在組織結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變時某些酶的活性或含量已經(jīng)發(fā)生變化有關(guān)。是否還有其它原因目前不清。

臨床常把心肌損傷標志物及炎性因子用于AMI的診斷與預(yù)后判斷［23-24];有研究認為,它們還與心肌的缺血損害程度有關(guān)［25]。本實驗結(jié)果表明伴隨缺血時間的延長心肌損害逐漸加重,而心肌損傷標志物及炎性因子也呈逐漸上升趨勢,該結(jié)果也表明AMI的心肌損害程度與上述指標變化存在密切相關(guān),可用這些指標的變化來反映心肌的損害程度［25-26]。而關(guān)于本研究結(jié)果提示,IL-6、TNF-α炎性因子對AMI的缺血損害反應(yīng)早于心肌損傷標志物。理論上可采用前述炎性因子來盡早反映心肌損害的發(fā)生,但因其特異性低,檢測結(jié)果受影響因素較多［19, 27],故仍需采用心肌損傷標志物來對心肌損害的早期診斷與損傷程度進行判斷。鑒于SOX9參與缺血后心肌細胞的肥大與纖維化調(diào)控,還通過上調(diào)HIF-1對抗高糖誘導(dǎo)的心肌細胞損害。那么SOX9是否直接涉及AMI后心肌的缺血損傷目前不清,我們構(gòu)建MI模型,擬探討SOX9與急性心肌缺血損害的關(guān)系。

本實驗對心肌SOX9蛋白的檢測結(jié)果顯示,MI組在0.5 h與8 h時點蛋白水平雖有量的持續(xù)下降,但無統(tǒng)計學(xué)差異,直至缺血24 h時點才出現(xiàn)明顯降低。盡管如此,我們?nèi)园l(fā)現(xiàn)SOX9的下降與心肌的缺血損傷有關(guān)。關(guān)于AMI后SOX9的表達水平下降其機制本研究暫未涉及。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn),在人椎間盤細胞炎性反應(yīng)中,炎癥因子的增加可通過抑制NF-κB信號通路的激活進而下調(diào)SOX9表達［28],而本研究炎性因子的結(jié)果示心肌梗死后IL-6及TNF-α的含量呈進行性的升高,這可能同樣是導(dǎo)致AMI時其心肌SOX9表達水平下降的原因之一。當(dāng)然明確這一機制需進一步通過抑制炎性反應(yīng)的實驗來予以直接證明。

為了明確AMI時,心肌SOX9蛋白的變化與血清心肌損傷標志物及炎性因子的關(guān)系,我們作了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示,24 h內(nèi)MI組各時間點hs-cTn、CK-MB及IL-6、TNF-α的變化與SOX9蛋白水平的改變呈負相關(guān)性。說明心肌SOX9表達的下調(diào)與血清心肌損傷標志物及炎性因子的升高在AMI中存在某種內(nèi)在關(guān)聯(lián),如前面推測的炎性因子可能是導(dǎo)致AMI時SOX9表達水平下降的原因等。但它們之間的具體內(nèi)在關(guān)聯(lián)為何目前不清。但既往研究證實心肌損傷標志物及炎性因子的變化與心肌的損害程度存在正相關(guān)［25-26],我們的研究結(jié)果也得到相同結(jié)論。故通過它們之間的相關(guān)性分析,一方面提示血清心肌損傷標志物及炎性因子的變化可間接反映心肌的SOX9受損情況;另一方面進一步佐證了SOX9與急性心肌的缺血損害有關(guān)。

綜上所述,AMI時心肌缺血可導(dǎo)致SOX9表達量下降,其改變可能與心肌的損害程度有關(guān);24 h內(nèi)血清hs-cTn、CK-MB、Mb心肌損傷標志物與IL-6、TNF-α炎性因子的變化可以反映AMI時SOX9蛋白下降及心肌損害情況。