顧陳怡，董洪燕，郭長明，封琦，謝軍，宋海港，吳植

（ 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300 ）

中國是水禽生產(chǎn)大國，飼養(yǎng)量占世界總量的70%，肉鴨、蛋鴨及肉鵝產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)值均呈穩(wěn)定增加態(tài)勢[1-2]。但隨著飼養(yǎng)規(guī)?；潭炔粩嗵岣撸曫B(yǎng)密度不斷增大，水禽養(yǎng)殖中許多疫病不斷發(fā)生，尤其是細菌感染已成為制約水禽產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的重要影響因素。大腸桿菌病、沙門氏菌病和鴨疫里氏桿菌病是當前危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的主要細菌疾病。在商品代水禽場，大腸桿菌、沙門氏菌和鴨疫里氏桿菌感染所導致的病理變化較相似，以“三炎”即心包炎、肝周炎和氣囊炎為主。在種水禽場，大腸桿菌病導致的危害更大，常導致患病禽類關(guān)節(jié)腫大、產(chǎn)蛋率下降和死淘率上升。有調(diào)查指出，細菌感染嚴重會導致水禽發(fā)病死亡[3-5]。

江蘇是水禽養(yǎng)殖大省，但水禽疫病的控制形勢不容樂觀。當前對水禽細菌性疾病的流行情況、血清型分型、耐藥基因和毒力基因的攜帶情況等均缺乏系統(tǒng)調(diào)查研究，加之部分地區(qū)藥物敏感性監(jiān)測尚不完善，因而造成抗生素藥物的不規(guī)范使用，在生產(chǎn)養(yǎng)殖中給水禽細菌病的預防和控制帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)。基于此，本研究依托江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（水禽）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系，對江蘇全省范圍內(nèi)水禽源常見細菌病開展流行現(xiàn)狀的調(diào)研與分析，以期為江蘇地區(qū)水禽細菌性疾病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2021—2022年共采集江蘇省10個地級市64個水禽養(yǎng)殖場的樣品768份，主要包括肛拭子和組織樣品兩種類型。

肛拭子的采集對象為臨床健康水禽，用滅菌的脫脂棉棒插入肛門2～4 cm處，在肛門口內(nèi)輕輕旋轉(zhuǎn)涂擦。

組織樣品采集對象為剖檢具有典型腹膜炎、心包炎、肝周炎和氣囊炎等病理變化的水禽，無菌采集肝臟、心臟、肺臟等組織。將棉棒或組織分別放入盛有TSB培養(yǎng)基（需氧增菌培養(yǎng)）和TSB+石蠟培養(yǎng)基（厭氧增菌培養(yǎng)）的指形管中保存，依次編號記錄，帶回實驗室。詳細記錄養(yǎng)殖場的性質(zhì)、水禽的日齡、免疫程序、發(fā)病情況和藥物使用等背景資料。

1.2 主要試劑

50×TAE、細菌DNA模板提取試劑盒購自康為世紀生物科技股份有限公司；瓊脂糖、DL2000 DNA Marker、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自大連寶生物公司；胎牛血清購自Gibico公司；DNA凝膠回收試劑盒購自康寧公司；布氏培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、牛肉浸粉等購自青島海博生物技術(shù)有限公司；優(yōu)質(zhì)瓊脂糖購自西班牙Bio-west。

1.3 儀器設(shè)備

SW-CJ-1F凈化工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、IS-RDS3搖床（廣州深華生物技術(shù)有限公司）、TGL-16B臺式冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）、9902 PCR基因擴增儀（賽默飛世爾科技中國有限公司）、DDY-6C電泳儀（北京六一儀器廠）、Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）等。

1.4 PCR引物設(shè)計與合成

參考相關(guān)文獻[6-8]分別合成大腸桿菌fimA、沙門氏菌stn、鴨疫里氏桿菌OmpA特異性引物用于PCR檢測，引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，引物序列信息具體見表1。

1.5 臨床樣品處理

將無菌采集的肛拭子和組織樣品立即放置于37 ℃、220 r/min的搖床上培養(yǎng)12～24 h。采用煮沸法提取細菌的DNA模板，吸取0.8～1.0 mL菌體培養(yǎng)液于指形管中，12 000 r/min離心3～5 min，棄上清；菌體沉淀重新懸浮于1 mL的ddH2O中，12 000 r/min離心3～5 min，再次棄上清；菌體沉淀重新懸浮于200 μL的ddH2O中，用100 ℃沸水煮沸10 min后，再0 ℃冰浴5 min，之后12 000 r/min離心8～10 min，吸取的上清液即為細菌DNA，轉(zhuǎn)移至新的指形管中并于-20 ℃保存。

1.6 臨床樣品PCR檢測

以分別提取的DNA為模板，分別按照參考文獻建立的PCR的體系和反應(yīng)程序，利用設(shè)計的引物對大腸桿菌fimA、沙門氏菌stn、鴨疫里氏桿菌OmpA引物進行PCR快速檢測。

PCR擴增體系（共20 μL）：細菌DNA模板2 μL、Primer-F 0.5 μL、Primer-R 0.5 μL、Premix Taq 10 μL、無菌水7 μL。

PCR檢測擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃/55 ℃/58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃下延伸10 min，降溫至4 ℃保存。

取5 μL PCR產(chǎn)物進1.2%瓊脂糖凝膠電泳，以DL2000 為DNA Marker，Goldview染色后，在瓊脂糖凝膠電泳成像系統(tǒng)上觀察其擴增情況，出現(xiàn)與預期目的片段大小的計為陽性，依據(jù)陽性樣品數(shù)與樣品檢測總數(shù)分別計算大腸桿菌fimA、沙門氏菌stn、鴨疫里氏桿菌OmpA等基因的檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品來源（見圖1）

圖1 樣品來源Fig.1 Sample source

由圖1可知，本調(diào)查共采集來自江蘇省10個地級市64個水禽養(yǎng)殖場的樣品768份，其中肛拭子樣品510份，組織樣品258份。

2.2 江蘇地區(qū)水禽大腸桿菌F1菌毛基因fimA檢出率（見圖2）

圖2 江蘇地區(qū)水禽大腸桿菌F1菌毛基因fimA檢出率Fig.2 Detection rate of F1 fimA gene of Escherichia coli in waterfowl in Jiangsu Province

由圖2可知，大腸桿菌F1菌毛基因fimA的平均檢出率為74.21%（570/768），其中肛拭子樣品的平均檢出率為70.58%（360/510），組織樣品的平均檢出率為81.40%（210/258）。泰州地區(qū)的肛拭子和組織樣品F1菌毛fimA基因檢出率均為最高，分別為86.05%、86.84%。

2.3 江蘇地區(qū)水禽沙門氏菌stn基因檢出率（見圖3）

圖3 江蘇地區(qū)水禽沙門氏菌stn基因檢出率Fig.3 Detection rate of stn gene of Salmonella in waterfowl in Jiangsu Province

由圖3可知，沙門氏菌stn基因的平均檢出率為5.60%（43/768），其中肛拭子樣品的平均檢出率為2.75%（14/510），組織樣品的平均檢出率11.24%（29/258）。連云港地區(qū)肛拭子和組織樣品中沙門氏菌stn基因檢出率均為最高，分別為5.13%（2/39）、33.33%（6/18）。

2.4 江蘇地區(qū)水禽鴨疫里氏桿菌OmpA基因檢出率（見圖4）

圖4 江蘇地區(qū)水禽鴨疫里氏桿菌OmpA基因檢出率Fig.4 Detection rate of OmpA gene of Riesiella pestipestii in waterfowl in Jiangsu Province

由圖4可知，鴨疫里氏桿菌OmpA基因平均檢出率為2.73%（21/768），其中肛拭子樣品的平均檢出率為9.52%（2/21），組織樣品的平均檢出率7.36%（19/285）。徐州地區(qū)的組織樣品OmpA基因檢出率最高為20.83%；而各地區(qū)肛拭子的檢出率均較低，從0～1.64%不等。

3 討論

禽致病性大腸桿菌（avian pathogenicE. coli）是導致水禽感染或繼發(fā)感染死亡率最高的一類細菌病，可垂直傳播[6-8]。水禽因感染禽致病性大腸桿菌死亡常見的臨床特征有：大腸桿菌蜂窩織炎、傳染性腹膜炎、敗血癥、心包炎、纖維蛋白性肝周炎、氣囊炎、腸道盲腸炎、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、大腸桿菌性肉芽腫、大腸桿菌臍炎等[9-10]。禽致病性大腸桿菌分離株血清型種類呈現(xiàn)多樣化，如郭長明等[11]從國內(nèi)20個地區(qū)的水禽中分離得到24株腸道外致病性大腸桿菌，主要的血清型有O1、O2、O18等。徐亞亞等[12]臨床分離鑒定出120株禽致病性大腸桿菌，主要血清型包括O78、O18、O24和O88等。

鴨疫里氏桿菌（Riemrella anatipestifer）主要感染2～3周齡的雛鴨，以纖維素性心包炎、氣囊炎、肝周炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎為主要臨床特征[13-14]。鴨疫里氏桿菌傳染性強、致死率高，目前已成為危害鴨場最重要的傳染病之一[15]。鴨疫里氏桿菌血清型眾多且復雜，國際公認已分離鑒定出21個血清型，且仍有新的血清型不斷被發(fā)現(xiàn)。目前不同血清型之間缺乏交叉保護，對鴨疫里氏桿菌的臨床診斷和疫苗防控造成極大的困難[16-17]。

沙門氏菌病又稱副傷寒，是由致病性沙門氏菌感染引起的一類細菌性傳染性疾病。近年來，隨著鴨、鵝養(yǎng)殖數(shù)量和養(yǎng)殖規(guī)模不斷提高，沙門氏菌病發(fā)病率也呈逐年升高趨勢，對水禽養(yǎng)殖業(yè)造成的危害和帶來經(jīng)濟損失也越來越大[18]。由于沙門氏菌的感染途徑多樣化，若養(yǎng)殖管理不當，會造成沙門氏菌在整個養(yǎng)殖領(lǐng)域快速傳播，進而導致群體凈化處理耗時延長。

大腸桿菌、沙門氏菌和鴨疫里氏桿菌感染是危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的主要細菌病。本試驗在PCR快速檢測的過程中，均選取了參考菌株作為對照，保證了檢測結(jié)果的特異性和準確性。大腸桿菌F1菌毛fimA基因的平均檢出率分為74.21%（570/768）；沙門氏菌stn基因平均檢出率為5.60%（43/768）；鴨疫里氏桿菌OmpA基因平均檢出率為2.73%（21/768），表明江蘇地區(qū)水禽細菌性疾病中大腸桿菌的檢出率最高。在商品代水禽養(yǎng)殖場，這3種細菌病引起的臨床癥狀和病理變化較相似，需進一步通過細菌的分離鑒定及PCR檢測進行鑒別診斷。在種鴨場、種鵝場，大腸桿菌的發(fā)病率更高，通常可引起卵黃性腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腳蹼炎癥等，這與本試驗中PCR檢測的結(jié)果相符。本研究結(jié)果，由于水禽養(yǎng)殖規(guī)?；潭炔粩嗟靥岣撸竽c桿菌、沙門氏菌及鴨疫里氏桿菌感染無明顯的季節(jié)性。

4 結(jié)論

近年來，水禽疫病呈現(xiàn)多種病原混合感染或繼發(fā)感染的現(xiàn)象，使大腸桿菌、沙門氏菌及鴨疫里氏桿菌感染等細菌病的情況更加復雜。本研究初步分析了江蘇地區(qū)水禽源細菌病主要流行情況，可為今后水禽細菌病的綜合防控提供參考。