王燕青, 楊林, 成春鋒, 陳東風(fēng), 冼紹祥, 方紅城

(1. 深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心血管科, 廣東 深圳 518104; 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 廣東 廣州 510006; 3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管科, 廣東 廣州 510405)

硫是一種機體不可缺少的微量元素。機體內(nèi)硫元素主要存在于L-半胱氨酸和L-蛋氨酸這兩種氨基酸中,兩者完全來源于膳食蛋白質(zhì)。其中,半胱氨酸是蛋白質(zhì)中含量最少且高度保守的氨基酸殘基,具有調(diào)節(jié)催化、氧化還原敏感性和金屬離子轉(zhuǎn)運等多種功能[1]。人類蛋白質(zhì)組有214 000個半胱氨酸殘基以硫醇、二硫化物和鋅指的形式存在[2]。在人體細(xì)胞質(zhì)內(nèi),最豐富的硫醇形式是谷胱甘肽[3],它參與保護蛋白質(zhì)硫醇免受氧化和交聯(lián)、降解蛋白質(zhì)的二硫鍵等細(xì)胞過程[4]。硫醇-二硫化物蛋白質(zhì)組可分為兩組,一組是氧化還原信號硫醇組,在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中起作用;另一組是氧化還原感應(yīng)硫醇組,在氧化還原狀態(tài)下起作用[5]。硫醇是活性氧的靶標(biāo),其氧化主要產(chǎn)生二硫化物和二硫鍵[6]。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)二硫鍵的積累可破壞細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的平衡,進而誘導(dǎo)雙硫應(yīng)激和細(xì)胞毒性[7]。

2023年2月甘波誼教授團隊[7]在NatureCellBiology雜志首次報道了一種新的細(xì)胞死亡方式,即在葡萄糖饑餓狀態(tài)下,NADPH供應(yīng)不足,癌細(xì)胞高表達胱氨酸轉(zhuǎn)運體溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11;也稱為xCT)誘發(fā)二硫化物(如胱氨酸等)在細(xì)胞內(nèi)異常積累,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此種細(xì)胞死亡方式具有二硫化物應(yīng)激的特點,故命名為“雙硫死亡”(disulfidptosis)。在該研究中,敲除調(diào)控細(xì)胞凋亡與鐵死亡的關(guān)鍵基因后,該種細(xì)胞死亡過程仍發(fā)生,但使用硫醇類還原性試劑三(2-羧乙基)膦[tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP]可以抑制細(xì)胞的死亡。從機制而言,由于葡萄糖饑餓導(dǎo)致NADPH供應(yīng)不足,細(xì)胞將胱氨酸還原為半胱氨酸的過程受阻,肌動蛋白分子間產(chǎn)生大量二硫鍵,誘導(dǎo)雙硫應(yīng)激,從而激活Rac/WAVE調(diào)節(jié)復(fù)合物(WRC)-7亞基肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3(Arp2/3)信號通路造成細(xì)胞骨架的紊亂,最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生雙硫死亡[7]。目前,關(guān)于雙硫死亡的研究多集中于SLC7A11高表達且處于葡萄糖饑餓狀態(tài)的癌細(xì)胞株[8-9]。因此,本文針對硫在機體的代謝、二硫鍵依賴性細(xì)胞死亡方式及在腫瘤中的調(diào)控作用作一綜述。

1 硫在機體內(nèi)代謝過程和生理功能

人類和其他動物體內(nèi)所有硫的主要來源為膳食蛋白質(zhì)。與其他營養(yǎng)素一樣,經(jīng)胃腸消化后的硫通過門靜脈循環(huán)直接進入肝臟,肝臟將含硫分子排泄至外周循環(huán)。在人體內(nèi),硫主要存在于半胱氨酸和蛋氨酸這兩種氨基酸中。硫在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)或在抗氧化防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[10]。硫的化學(xué)性質(zhì),特別是其可逆地采用多種價態(tài)的能力,是其在許多生物分子中具有獨特功能的基礎(chǔ)[11],這種性質(zhì)允許硫殘基在一些蛋白質(zhì)內(nèi)部或蛋白質(zhì)之間形成可逆的二硫鍵[10]。硫在生物學(xué)電子轉(zhuǎn)移渠道中的應(yīng)用廣泛,密切參與氧化還原反應(yīng)。因此,硫可能最常用來直接改變細(xì)胞內(nèi)氧原子氧化狀態(tài)[10]。在用于蛋白質(zhì)合成的半胱氨酸和蛋氨酸的活性形式中,硫處于完全還原狀態(tài)。硫在半胱氨酸中以硫醇形式存在,在蛋氨酸中以硫醚形式存在。蛋氨酸經(jīng)由機體從食物中獲得的含硫營養(yǎng)素合成,半胱氨酸可以通過轉(zhuǎn)硫途徑由蛋氨酸合成。與蛋氨酸相比,半胱氨酸更易于與過氧化氫反應(yīng)而具有調(diào)節(jié)氧化還原的特性。同時,半胱氨酸也是細(xì)胞中谷胱甘肽、硫化氫和鐵硫簇等生物合成的前體。

半胱氨酸作為組成蛋白質(zhì)或谷胱甘肽結(jié)構(gòu)的一類氨基酸,有助于維持氧化還原穩(wěn)態(tài)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)[12]。此外,半胱氨酸作為“代謝樞紐”參與細(xì)胞中其他含硫小分子生物合成[13-14]。大多數(shù)半胱氨酸作為氧化還原感應(yīng)硫醇以響應(yīng)氧化還原變化。從結(jié)構(gòu)來看,半胱氨酸的功能大多源于其反應(yīng)性巰基。半胱氨酸在細(xì)胞外不穩(wěn)定,易被氧化為胱氨酸[15],同時細(xì)胞外半胱氨酸濃度通常較胱氨酸低。因此,大多數(shù)細(xì)胞在很大程度上依賴胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白來獲得細(xì)胞外胱氨酸,再通過在胞質(zhì)中利用二硫鍵還原生成兩個半胱氨酸分子。半胱氨酸隨后被用于合成谷胱甘肽以及其他生物分子[16]。

硫代謝穩(wěn)態(tài)對細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的維持至關(guān)重要。在機體生理活動中,細(xì)胞主要以胱氨酸形式從細(xì)胞外環(huán)境獲取半胱氨酸,小部分半胱氨酸由蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生。在一些細(xì)胞和組織中,從頭生物合成細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸(其中同型半胱氨酸可以通過轉(zhuǎn)硫途徑轉(zhuǎn)化為半胱氨酸)[17-18]。負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運胱氨酸的轉(zhuǎn)運蛋白是一種異二聚體,由二硫鍵連接的輕鏈亞基SLC7A11和重鏈亞基溶質(zhì)載體家族3成員2(SLC3A2,也稱為4F2hc或CD98)組成[19]。SLC3A2是一種單一跨膜蛋白的伴侶,可維持SLC7A11蛋白的穩(wěn)定性和適當(dāng)?shù)哪ざㄎ?該轉(zhuǎn)運蛋白以1 ∶1的比例輸入細(xì)胞外胱氨酸和輸出細(xì)胞內(nèi)谷氨酸[20]。半胱氨酸作為硫代謝中主要參與的氨基酸,其在細(xì)胞中的合成轉(zhuǎn)化也極其重要。

分泌蛋白或膜蛋白中半胱氨酸的獲得或缺失以及胞質(zhì)蛋白硫醇S-亞硝基化修飾導(dǎo)致硫代謝失調(diào),與色盲[21]、血管性血友病[22]等遺傳性疾病以及帕金森病[23]、阿爾茨海默病[24]等獲得性疾病有關(guān)。

2 雙硫死亡的發(fā)現(xiàn)及機制

雙硫死亡與凋亡[25]、鐵死亡[26]、焦亡[27]、壞死性凋亡[28]和銅死亡[29]等細(xì)胞程序性死亡有不同的誘因和檢測指標(biāo)(表1)。甘波誼團隊發(fā)現(xiàn)分別敲除鐵死亡蛋白ACSL4和凋亡關(guān)鍵誘導(dǎo)蛋白BAX/BAK并不能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞死亡,給予細(xì)胞活性氧清除劑也不能抑制雙硫死亡[7]。此外,通過透射電子顯微鏡分析SLC7A11高表達細(xì)胞死亡并非由于胱氨酸晶體毒性導(dǎo)致[7]。再者,SLC7A11高表達癌細(xì)胞ATP水平較對照組升高,排除了細(xì)胞死于ATP耗竭的可能性[7]。最終,甘波誼團隊確定該種細(xì)胞死亡方式是雙硫死亡。在癌細(xì)胞胞質(zhì)中,有害的二硫鍵形成是雙硫死亡的基礎(chǔ),雙硫應(yīng)激是誘發(fā)雙硫死亡的關(guān)鍵過程。

表1 不同細(xì)胞死亡方式的誘發(fā)因素及關(guān)鍵檢測指標(biāo)

2.1 細(xì)胞質(zhì)二硫鍵形成是雙硫死亡的基礎(chǔ)

二硫鍵是通過半胱氨酸或其他物質(zhì)的兩個巰基殘基氧化形成的共價鍵,在蛋白質(zhì)折疊和增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用[30]。這種二硫鍵的形成主要發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體膜間隙等特殊的隔室中[31],而細(xì)胞質(zhì)中的二硫鍵形成是在應(yīng)激條件下和一些病毒感染的超嗜熱細(xì)胞中[32]。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基中的巰基酸度系數(shù)(pKa)>8.0,并且在細(xì)胞質(zhì)的還原環(huán)境中和在生理pH下保持質(zhì)子化。因此,細(xì)胞質(zhì)蛋白通常不含二硫鍵[33]。當(dāng)還原性半胱氨酸硫醇遇到活性氧、氮或氯物種時,會形成亞磺酸,繼而迅速與附近的半胱氨酸相互作用,形成分子間或分子內(nèi)二硫鍵[34-35]。細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵的堆積容易誘發(fā)雙硫應(yīng)激進而導(dǎo)致雙硫死亡。這種有害的二硫鍵可通過胞質(zhì)硫氧還蛋白系統(tǒng)[硫氧還蛋白還原酶-1(TRXR1)]和谷胱甘肽系統(tǒng)[谷胱甘肽還原酶(GSR)]兩種不同的還原途徑清除[36-37]。這兩種還原途徑以NADPH作為其還原能力的原料控制二硫鍵的形成。因此,在SLC7A11高表達的癌細(xì)胞中,切斷葡萄糖供應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中形成大量的二硫鍵是雙硫死亡的基礎(chǔ)。

2.2 雙硫應(yīng)激促進細(xì)胞雙硫死亡

盡管2023年首次提出“雙硫死亡”的命名,但關(guān)于雙硫應(yīng)激的相關(guān)研究卻始于更早。硫醇特異性氧化還原系統(tǒng)在保護細(xì)胞免受有毒氧的侵害,維持細(xì)胞內(nèi)硫醇-二硫化物平衡以及為關(guān)鍵還原酶(如核糖核苷酸還原酶)提供還原能力等方面發(fā)揮著重要作用[38]。H2O2將硫醇氧化為亞磺,然后氧化為亞磺酸或磺酸,并促進亞磺和硫醇之間形成二硫化物;而二酰胺特異性觸發(fā)硫醇之間的二硫化物產(chǎn)生氧化應(yīng)激,也稱為雙硫應(yīng)激[39]。近期研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)二硫化物(如胱氨酸)的異常積累會誘導(dǎo)二硫化物應(yīng)激,并對細(xì)胞產(chǎn)生高度毒性[8]。在雙硫死亡中,由于細(xì)胞內(nèi)大量二硫分子積聚,造成雙硫應(yīng)激,從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

3 雙硫死亡與腫瘤的關(guān)系

代謝重編程是癌癥的重要特征之一,它通常導(dǎo)致癌細(xì)胞對生物合成和能量代謝中重要營養(yǎng)素的攝取增加,如葡萄糖和谷氨酰胺等[40],主要通過上調(diào)葡萄糖和氨基酸攝取的轉(zhuǎn)運蛋白的表達水平來實現(xiàn)。相應(yīng)地,當(dāng)葡萄糖或氨基酸來源受限時,一些癌細(xì)胞會發(fā)生細(xì)胞死亡,但正常細(xì)胞卻能夠存活。這種營養(yǎng)依賴性為癌癥的靶向治療提供了潛在的代謝脆弱性[41]。甘波誼團隊的研究表明,SLC7A11高表達促進癌細(xì)胞代謝脆弱性導(dǎo)致的雙硫死亡可能是治療腫瘤的有效策略[7]。

3.1 SLC7A11高表達促進腫瘤細(xì)胞代謝脆弱性導(dǎo)致雙硫死亡

由于癌細(xì)胞處于高水平氧化應(yīng)激狀態(tài)[42],通過從頭合成或蛋白質(zhì)分解代謝提供半胱氨酸通常無法滿足癌細(xì)胞對抗氧化防御的高需求,因此癌細(xì)胞主要依賴于高表達SLC7A11從細(xì)胞外環(huán)境中獲得胱氨酸。此外,高表達SLC7A11可增加抗氧化劑谷胱甘肽的生物合成[41]。多項研究表明,在胱氨酸充足狀態(tài)下,SLC7A11高表達的癌細(xì)胞通過攝取胞外胱氨酸,促進谷胱甘肽合成從而抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物堆積,最終抑制細(xì)胞鐵死亡促進腫瘤生長[43-45]。相反,將細(xì)胞培養(yǎng)基中胱氨酸去除或通過基因消融或藥物抑制使SLC7A11失活可在多種癌細(xì)胞中誘導(dǎo)強有力的細(xì)胞死亡[43,46]。由此可知,應(yīng)激誘導(dǎo)的SLC7A11高表達可通過抑制癌細(xì)胞鐵死亡促進腫瘤生長[47]。

根據(jù)上述結(jié)論,研究人員最初假設(shè)SLC7A11高表達可能保護細(xì)胞免受葡萄糖饑餓引發(fā)的死亡。令人驚訝的是,研究結(jié)果表明,SLC7A11過表達顯著促進葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,而SLC7A11失活顯著抑制葡萄糖饑餓下的細(xì)胞死亡[48-49]。甘波誼教授團隊探究其機制發(fā)現(xiàn),葡萄糖可通過磷酸戊糖途徑提供NADPH以還原有毒的胱氨酸[8]。在葡萄糖饑餓條件下,給予細(xì)胞補充2-脫氧葡萄糖以提供NADPH可以顯著阻止SLC7A11高表達癌細(xì)胞雙硫死亡和氧化還原缺陷[8]。因此,癌細(xì)胞SLC7A11高表達增強自身對葡萄糖的依賴性[50],并使癌細(xì)胞對葡萄糖缺乏誘導(dǎo)的雙硫死亡更敏感。同時,SLC7A11過表達也增強癌細(xì)胞對谷氨酰胺的依賴性。谷氨酰胺是一種重要氨基酸,參與細(xì)胞能量和生物合成過程,并維持癌細(xì)胞的氧化還原平衡[51]。SLC7A11高表達促進谷氨酸輸出,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)谷氨酸的部分耗竭,然后通過解除反饋抑制并激活谷氨酰胺酶驅(qū)動細(xì)胞攝取更多的谷氨酰胺以補充谷氨酸。Timmerman等[52]研究表明,乳腺癌基底細(xì)胞和claudin-low三陰性乳腺癌細(xì)胞對谷氨酰胺缺乏的敏感性與SLC7A11表達水平和胱氨酸消耗率相關(guān),此研究支持SLC7A11高表達癌細(xì)胞對谷氨酰胺依賴這一觀點。

雙硫死亡的發(fā)現(xiàn)顛覆了SLC7A11高表達促進腫瘤生長這一傳統(tǒng)觀點,即SLC7A11在促進雙硫死亡過程中起著重要作用。SLC7A11在癌細(xì)胞中的高表達在降低細(xì)胞發(fā)生鐵死亡風(fēng)險的同時,又增加細(xì)胞發(fā)生雙硫死亡的風(fēng)險,它在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的氧化還原平衡和營養(yǎng)依賴性方面起著雙刃劍的作用[41]。另外,谷胱甘肽生物合成減少是細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的關(guān)鍵因素,同時也在雙硫死亡中發(fā)生。由此推斷,由于SLC7A11和谷胱甘肽的共同參與,雙硫死亡與鐵死亡間存在相關(guān)串?dāng)_,具體機制見圖1。

:上升;:下降;:中斷;SLC7A11:溶質(zhì)載體家族7成員11;NADP+:氧化型輔酶Ⅱ;NADPH:還原型輔酶Ⅱ;GPX4:谷胱甘肽過氧化物酶4圖1 SLC7A11高表達癌細(xì)胞中鐵死亡與雙硫死亡機制示意圖

3.2 靶向雙硫死亡及SLC7A11/SLC7A11相關(guān)代謝脆弱性的癌癥治療策略

多項研究表明,SLC7A11是多種癌細(xì)胞系中葡萄糖缺乏導(dǎo)致細(xì)胞死亡的關(guān)鍵決定因素[48-49,53]。SLC7A11在惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[53]、腎細(xì)胞癌[54]、肺癌[55]、肝癌[56]和胰腺癌[57]等癌癥中呈高表達,其高表達通常與患者預(yù)后不良相關(guān)。研究表明,Slc7a11敲除鼠是可存活的,Slc7a11敲除在主要器官中未出現(xiàn)明顯的表型[58]。因此,SLC7A11有望成為癌癥治療中一個有前景的治療靶點。

既往研究多聚焦于直接抑制SLC7A11轉(zhuǎn)運體活性誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。目前,Erastin、Erastin咪唑酮衍生物、柳氮磺胺吡啶、索拉非尼和HG106已被鑒定或表征為SLC7A11抑制劑[59-60]。然而,由于Erastin代謝穩(wěn)定性差和在體內(nèi)溶解度低,其不能用于動物研究[59];Erastin咪唑酮衍生物可用于動物實驗[61],但未進入臨床試驗階段;雖然索拉非尼和柳氮磺胺吡啶已經(jīng)獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn),但索拉非尼在腫瘤治療中作為多激酶抑制劑發(fā)揮抗癌作用,而柳氮磺胺吡啶可以阻止前列腺素合成,均不能確認(rèn)二者在任何特定環(huán)境下的抗癌作用確實是由SLC7A11抑制和鐵死亡誘導(dǎo)引起的;盡管HG106最近被鑒定為SLC7A11抑制劑[60],但其具體機制還有待進一步研究?？傊?盡管臨床前研究已確定抑制SLC7A11活性的治療策略,但仍需進一步確定有效且特異的SLC7A11抑制劑,研究其作用機制,進行臨床試驗,并最終應(yīng)用于臨床。

最近,研究人員提出靶向癌癥中SLC7A11相關(guān)代謝脆弱性(葡萄糖或谷氨酰胺依賴性)誘導(dǎo)雙硫死亡來制定癌癥的治療策略[19]。Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn),與SLC7A11低表達癌細(xì)胞相比,葡萄糖轉(zhuǎn)運體(glucose transporter,GLUT)抑制劑更容易誘導(dǎo)SLC7A11高表達癌細(xì)胞發(fā)生雙硫死亡。在細(xì)胞系異種移植物和肺癌患者來源的異種移植物中使用KL-11743(強效的泛GLUT1和GLUT3抑制劑),可以選擇性地抑制SLC7A11高表達腫瘤生長[44]。與此同時,SLC7A11高表達癌細(xì)胞也表現(xiàn)出谷氨酰胺依賴性。出現(xiàn)Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(Kelch-like ECH associated protein 1,KEAP1)基因突變的癌癥表現(xiàn)為核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)過度激活和SLC7A11高表達[62]。與KEAP1野生型細(xì)胞系相比,谷氨酰胺酶抑制劑CB-839對KEAP1突變細(xì)胞系或患者來源的異種移植物腫瘤生長的抑制作用更強[63-64]。此外,SLC7A11高表達可作為生物標(biāo)志,用于選擇癌癥患者進行谷氨酰胺酶或GLUT抑制劑治療。雙硫死亡的發(fā)現(xiàn)有望針對癌癥代謝的弱點,為癌癥的代謝治療提供一種新的途徑。

然而,并非所有腫瘤都呈SLC7A11高表達,一些腫瘤(如ARID1A缺陷型腫瘤或具有p53功能獲得突變的腫瘤)甚至呈SLC7A11低表達[65-66]。值得注意的是,甘波誼團隊在葡萄糖饑餓條件下,向SLC7A11低表達的人腎透明細(xì)胞腺癌786-O細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加額外的胱氨酸可耗盡細(xì)胞內(nèi)NADPH,誘導(dǎo)肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白中的二硫鍵形成和F-肌動蛋白收縮,并引發(fā)細(xì)胞死亡[7]。由此可見,SLC7A11低表達細(xì)胞誘導(dǎo)雙硫死亡相關(guān)機制仍需要深入研究,同時,非癌細(xì)胞中是否發(fā)生雙硫死亡也有待進一步研究。

4 總結(jié)與展望

綜上所述,硫、含硫的半胱氨酸及硫醇有助于維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞氧化還原狀態(tài)失衡時,胞質(zhì)內(nèi)硫醇氧化易形成有害的二硫鍵。細(xì)胞質(zhì)中的二硫鍵在NADPH供應(yīng)不足時無法被清除,繼而誘發(fā)雙硫應(yīng)激導(dǎo)致雙硫死亡。

已證明SLC7A11高表達可抑制癌細(xì)胞鐵死亡。雙硫死亡是一種在葡萄糖饑餓的狀態(tài)下,由SLC7A11高表達的癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)二硫鍵大量生成誘導(dǎo)雙硫應(yīng)激介導(dǎo)的硫依賴性細(xì)胞死亡,這一新發(fā)現(xiàn)表明鐵死亡與雙硫死亡之間有一定的相關(guān)性。因此,后續(xù)有必要研究通過干擾SLC7A11促進鐵死亡的治療是否也會抑制雙硫死亡的發(fā)生;同時,研究如何在癌癥的靶向治療中避免該現(xiàn)象。