趙冉，夷崢，陳穎瑋，黃中強(qiáng)，儲(chǔ)呈祥，王雪亮，（上海市臨床檢驗(yàn)中心.質(zhì)控品研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，.臨床細(xì)胞分子遺傳學(xué)研究室／分子病理研究室，上海 200126）

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，核酸檢測(cè)已成為輔助診斷多種感染性疾病的有效手段，如新型冠狀病毒（新冠病毒）核酸檢測(cè)結(jié)果可作為疾病確診的依據(jù)［1］。核酸檢測(cè)包括樣本采集、運(yùn)輸、保存、檢測(cè)和結(jié)果分析等多個(gè)環(huán)節(jié)，其中任一環(huán)節(jié)均會(huì)影響檢測(cè)質(zhì)量。為保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，使用室內(nèi)質(zhì)控品是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理的重要措施之一［2-4］。歷次版本的《新型冠狀病毒肺炎防控方案》均明確要求實(shí)驗(yàn)室使用弱陽(yáng)性質(zhì)控品同批參與檢測(cè)過程。此外，質(zhì)控品還用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)系統(tǒng)性能驗(yàn)證、儀器校準(zhǔn)、測(cè)量程序評(píng)估等［4-5］，核酸檢測(cè)質(zhì)控品應(yīng)能夠監(jiān)測(cè)樣本核酸提取和擴(kuò)增等檢驗(yàn)全過程質(zhì)量。

目前可供選用的商品化新冠病毒核酸檢測(cè)質(zhì)控品種類多樣，不同類型質(zhì)控品性能及適用場(chǎng)景可能存在較大差異［3-5］，選擇性能可靠且適用的質(zhì)控品是保證檢測(cè)質(zhì)量的前提。然而，目前尚無(wú)對(duì)第三方弱陽(yáng)性質(zhì)控品性能比較評(píng)價(jià)的相關(guān)研究。為此，本研究選取多種常見的商品化新冠病毒核酸檢測(cè)弱陽(yáng)性質(zhì)控品進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為實(shí)驗(yàn)室合理選用質(zhì)控品提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)控品樣本 7 種商品化的新冠病毒核酸檢測(cè)弱陽(yáng)性質(zhì)控品分別來(lái)自：鄭州標(biāo)源生物科技有限公司、廣州邦德盛生物科技有限公司、上海之江生物科技股份有限公司、睿豐康生物醫(yī)藥科技（浙江）有限公司、英維譜（浙江）生物科技有限公司、北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司、廣東和信健康科技有限公司，隨機(jī)編號(hào)為品牌A（1×103copies／mL）、品牌B（1.12×103copies／mL）、品牌C（1.03×103copies／mL）、品牌D（1×103copies／mL）、品牌E（1.83×103copies／mL）、品牌F（1×103copies／mL）和品牌G（1×103copies／mL）。

1.2 核酸檢測(cè)方法 使用NP968-C 核酸提取儀（西安天隆科技有限公司）及配套試劑耗材（批號(hào)22081010T324），根據(jù)說(shuō)明書及操作規(guī)程進(jìn)行核酸提取。使用ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)賽默飛世爾公司）進(jìn)行核酸擴(kuò)增。為減少配制試劑等操作引入的誤差，除適用性評(píng)價(jià)外，均使用武漢明德生物科技股份有限公司生產(chǎn)的新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒（明德，批號(hào)220809）進(jìn)行核酸擴(kuò)增。

1.3 評(píng)價(jià)方法

1.3.1 適用性評(píng)價(jià) 各質(zhì)控品分別隨機(jī)選取5 管，提取核酸后使用20 種不同品牌的經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）批準(zhǔn)的新冠病毒核酸檢測(cè)試劑分別進(jìn)行檢測(cè)，分析其靶基因擴(kuò)增Ct 值是否符合陽(yáng)性結(jié)果判斷要求。

適用性評(píng)價(jià)試劑生產(chǎn)商包括：明德（批號(hào)220809）、鄭州安圖生物工程股份有限公司（安圖，批號(hào)20220516）、上海伯杰醫(yī)療科技股份有限公司（伯杰，批號(hào)20220516G）、廣州達(dá)安基因股份有限公司［達(dá)安（快速法），批號(hào)2022536 及達(dá)安（普通法），批號(hào)20220086］，浙江東方基因生物制品有限公司（東方基因，批號(hào)AA220707）、復(fù)星診斷科技（上海）有限公司（復(fù)星，批號(hào)C20220430）、華大生物科技（武漢）有限公司（華大，批號(hào)60202010065）、上海捷諾生物科技有限公司（捷諾，批號(hào)COV20221006）、杭州迪安生物技術(shù)有限公司（金迪安，批號(hào)2208086）、卡尤迪生物科技宜興有限公司（卡尤迪，批號(hào)202209072）、潮州凱普生物化學(xué)有限公司（凱普，批號(hào)20220919A）、邁克生物股份有限公司（邁克，批號(hào)1020531）、北京納捷診斷試劑有限公司（納捷，批號(hào)DJ202201）、圣湘生物科技股份有限公司（圣湘，批號(hào)2022191-1）、江蘇碩世生物科技股份有限公司（碩世，批號(hào)20220705）、上海思路迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司（思路迪，批號(hào)QP07220724）、上海之江生物科技股份有限公司（之江，批號(hào)P20220140）、中元匯吉生物技術(shù)股份有限公司（中元，批號(hào)5207039）及北京卓誠(chéng)惠生生物科技有限公司（卓誠(chéng)惠生，批號(hào)C20220430）。

1.3.2 穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 對(duì)品牌A～G 質(zhì)控品的短期穩(wěn)定性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性、反復(fù)凍融后穩(wěn)定性分別進(jìn)行評(píng)價(jià)，步驟：（1）短期穩(wěn)定性：包括37 ℃儲(chǔ)存2 h、4 h，25 ℃儲(chǔ)存2 h、4 h、6 h、8 h、1 d，4 ℃儲(chǔ)存4 h、8 h、1 d、2 d、3 d，-20 ℃儲(chǔ)存2 d。（2）長(zhǎng)期穩(wěn)定性：包括-20 ℃儲(chǔ)存2 周、1 個(gè)月、3 個(gè)月及6 個(gè)月。（3）反復(fù)凍融測(cè)試：將-80 ℃凍存的各品牌質(zhì)控品樣本取出后25 ℃靜置1 h 至完全融化，再置于-80 ℃凍存12 h 以上為1 次凍融，分別進(jìn)行凍融1 次、2 次、3 次。經(jīng)相應(yīng)條件處理后的樣本分別提取核酸并進(jìn)行檢測(cè)，與-80 ℃保存的樣本檢測(cè)Ct 值進(jìn)行比較。

1.3.3 量值準(zhǔn)確性評(píng)價(jià) 使用新型冠狀病毒核糖核酸基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，編號(hào)GBW（E）091099］作為標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行10-1、10-2、10-3倍稀釋后檢測(cè)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)各品牌質(zhì)控品進(jìn)行定量。根據(jù)Ct 值計(jì)算各質(zhì)控品中ORF1ab基因、N 基因濃度，與各質(zhì)控品產(chǎn)品說(shuō)明書中所標(biāo)示濃度進(jìn)行比較。

1.3.4 核酸殘留檢測(cè) 各品牌質(zhì)控品分別隨機(jī)選取3 管，以不提取核酸的樣本直接作為模板進(jìn)行檢測(cè)，并與提取核酸后檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 除適用性評(píng)價(jià)外，其他每次試驗(yàn)為3 個(gè)重復(fù)樣本，計(jì)算Ct 值的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）。采用GraphPad Prism 5 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 適用性驗(yàn)證 7 種品牌弱陽(yáng)性質(zhì)控品適用性評(píng)估結(jié)果見表1。在不考慮內(nèi)參基因的情況下，僅品牌A 質(zhì)控品使用邁克試劑不能有效檢出ORF1ab基因，其余各質(zhì)控品均適用于各檢測(cè)試劑。因此，7種品牌質(zhì)控品均可滿足多種檢測(cè)試劑對(duì)陽(yáng)性質(zhì)控品的需求。

表1 品牌A～G 質(zhì)控品對(duì)不同檢測(cè)試劑的適用性

2.2 穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 不同保存條件（-20 ℃，2～8 ℃或室溫）下的各質(zhì)控品穩(wěn)定性結(jié)果以O(shè)RF1ab 基因?yàn)槔M(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。與-80 ℃相比，7 種質(zhì)控品在37 ℃保存4 h、25 ℃保存1 d、4 ℃保存3 d、-20 ℃保存6 個(gè)月時(shí)其Ct 值均無(wú)明顯變化。N 基因檢測(cè)結(jié)果與ORF1ab 基因檢測(cè)結(jié)果類似。表明7種質(zhì)控品穩(wěn)定性良好，臨床實(shí)驗(yàn)室在實(shí)際應(yīng)用中將質(zhì)控品暫存于2～8 ℃或室溫條件下不會(huì)顯著影響其檢測(cè)效果。

圖1 品牌A～G 質(zhì)控品ORF1ab 基因在不同條件下的穩(wěn)定性

此外，7 種質(zhì)控品反復(fù)凍融后與凍融前（0 次）檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，顯示ORF1ab 和N 基因檢測(cè)Ct值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2），表明反復(fù)凍融3 次后不影響其穩(wěn)定性，在實(shí)際使用中質(zhì)控品開瓶后多次使用不影響其檢測(cè)效果。

圖2 品牌A～G 質(zhì)控品反復(fù)凍融不同次數(shù)后檢測(cè)Ct 值比較

2.3 量值準(zhǔn)確性評(píng)價(jià) 7 種不同品牌質(zhì)控品定量結(jié)果及其與產(chǎn)品說(shuō)明書中的標(biāo)示濃度比較結(jié)果見表2。除1 種弱陽(yáng)性質(zhì)控品定量結(jié)果與其標(biāo)示濃度值接近以外，其余6 種弱陽(yáng)性質(zhì)控品的實(shí)際定量結(jié)果與標(biāo)示濃度值均存在較大差距，個(gè)別品牌的濃度差異高達(dá)220 倍，明顯不符合相關(guān)法規(guī)文件中對(duì)新冠病毒弱陽(yáng)性質(zhì)控品濃度要求。

表2 品牌A～G 質(zhì)控品使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量結(jié)果

2.4 核酸殘留檢測(cè) 7 種品牌質(zhì)控品進(jìn)行核酸提取后檢測(cè)或不提取直接檢測(cè)Ct 值結(jié)果見表3。部分質(zhì)控品核酸殘留處理較好，在不提取核酸情況下完全無(wú)核酸擴(kuò)增反應(yīng)，如品牌B、E 和F。但部分品牌質(zhì)控品仍存在殘留核酸，不提取核酸直接擴(kuò)增即可產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。如品牌A 質(zhì)控品僅對(duì)ORF1ab基因靶標(biāo)進(jìn)行了處理，其N 基因在提取核酸后擴(kuò)增Ct 值與未提取核酸直接擴(kuò)增Ct 值僅相差1 左右；品牌C 質(zhì)控品不提取核酸與提取核酸后檢測(cè)其檢測(cè)靶基因Ct 值僅相差2 左右，證明該產(chǎn)品中仍有大量的核酸殘留。而品牌G 和品牌D 質(zhì)控品雖然在未提取核酸情況下也有部分?jǐn)U增，但與提取后擴(kuò)增的Ct 值差異較大，說(shuō)明該質(zhì)控品雖然進(jìn)行了處理，但仍有少量核酸殘留。

表3 不同品牌質(zhì)控品核酸殘留檢測(cè)結(jié)果

3 討論

合理設(shè)置質(zhì)控品是保障核酸檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的重要手段［4］。目前新冠病毒核酸檢測(cè)可供選擇的質(zhì)控品有多種類型，例如假病毒顆粒和滅活病毒等，其在生物安全風(fēng)險(xiǎn)、保存運(yùn)輸條件等方面特性不同［4-7］。選擇合適的質(zhì)控品是保障檢驗(yàn)項(xiàng)目質(zhì)量的前提，但目前缺少對(duì)相應(yīng)質(zhì)控品性能的比較評(píng)價(jià)研究。為此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)7 種品牌質(zhì)控品進(jìn)行性能評(píng)估，以期為臨床實(shí)驗(yàn)室合理選用質(zhì)控品提供參考。

新冠病毒核酸檢測(cè)質(zhì)控品通常存放于-20 ℃，使用時(shí)于2～8 ℃或室溫解凍，且常需要開瓶后多次使用。本研究結(jié)果顯示7 種質(zhì)控品在不同保存條件下或反復(fù)凍融后穩(wěn)定性良好，均能滿足實(shí)驗(yàn)室日常使用要求。適用性評(píng)價(jià)結(jié)果表明絕大多數(shù)質(zhì)控品均可滿足不同檢測(cè)試劑需求，但仍有少數(shù)質(zhì)控品未能覆蓋個(gè)別檢測(cè)試劑靶基因。因部分檢測(cè)試劑為外源性內(nèi)標(biāo)，此次評(píng)價(jià)中未考慮質(zhì)控品中內(nèi)參基因檢出情況。但筆者也發(fā)現(xiàn)部分質(zhì)控品用于個(gè)別檢測(cè)試劑時(shí)確實(shí)存在不能有效檢出內(nèi)參基因的問題。因此，如何確保核酸檢測(cè)質(zhì)控品覆蓋所有檢測(cè)試劑靶基因，且能包括各類內(nèi)參基因，是未來(lái)質(zhì)控品進(jìn)一步優(yōu)化提升的方向。

為降低檢測(cè)假陰性結(jié)果風(fēng)險(xiǎn)［8］，新冠病毒核酸檢測(cè)建議使用弱陽(yáng)性質(zhì)控品。然而，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室在使用弱陽(yáng)性質(zhì)控品時(shí)僅關(guān)注其擴(kuò)增曲線，未對(duì)質(zhì)控品實(shí)際濃度進(jìn)行有效驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)品牌弱陽(yáng)性質(zhì)控品實(shí)際濃度遠(yuǎn)高于產(chǎn)品說(shuō)明書中的標(biāo)示濃度值，這并不符合弱陽(yáng)性質(zhì)控品的濃度要求，可能會(huì)無(wú)法有效監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)假陰性結(jié)果。此外，高濃度陽(yáng)性質(zhì)控品在使用過程中還存在引發(fā)實(shí)驗(yàn)室污染的風(fēng)險(xiǎn)［9］。因此，建議臨床實(shí)驗(yàn)室在選用弱陽(yáng)性質(zhì)控品時(shí)除關(guān)注擴(kuò)增曲線外，還需關(guān)注所用質(zhì)控品的實(shí)際濃度。

此外，為更好地監(jiān)測(cè)RNA 病毒核酸提取及反轉(zhuǎn)錄效率，質(zhì)控品應(yīng)完全去除生產(chǎn)過程中的核酸殘留。目前商品化質(zhì)控品制備較多采用RNA 體外轉(zhuǎn)錄、噬菌體病毒樣顆粒、慢病毒顆粒等技術(shù)，其生產(chǎn)過程均涉及質(zhì)粒DNA 的使用，易導(dǎo)致質(zhì)粒DNA 殘留［9］。本研究結(jié)果表明部分質(zhì)控品不提取核酸完全不能進(jìn)行擴(kuò)增，說(shuō)明其質(zhì)控品核酸殘留處理較好。當(dāng)然，也不能排除部分產(chǎn)品有添加核酸擴(kuò)增抑制劑的情況。殘留的質(zhì)粒DNA 會(huì)導(dǎo)致其無(wú)法有效模擬真實(shí)病毒的核酸提取和逆轉(zhuǎn)錄過程。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)部分質(zhì)控品未能完全去除核酸殘留，這說(shuō)明其生產(chǎn)工藝尚存在問題，不能有效監(jiān)控檢測(cè)全過程質(zhì)量。因此，臨床實(shí)驗(yàn)室在選用核酸檢測(cè)質(zhì)控品時(shí)應(yīng)評(píng)價(jià)其產(chǎn)品中的核酸殘留情況，以確保能夠監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)全過程質(zhì)量。

綜上所述，本研究所評(píng)價(jià)的7 種質(zhì)控品基本能滿足各檢測(cè)試劑的適用性需求，且穩(wěn)定性良好。但部分質(zhì)控品量值準(zhǔn)確性和核酸殘留方面尚存在一定問題。雖然目前新冠病毒核酸檢測(cè)已大大減少，但類似問題也很可能出現(xiàn)在其他RNA 病毒核酸檢測(cè)質(zhì)控品中，如多重呼吸道病毒檢測(cè)。因此，質(zhì)控品生產(chǎn)商應(yīng)持續(xù)優(yōu)化提升相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)合理選用并規(guī)范設(shè)置質(zhì)控品，以有效保證相關(guān)病原體檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，從而更好地服務(wù)于臨床。