殷淑瑛，呂巧怡，王薈，邵啟祥，2（.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 2203；2.江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安 223005）

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是常見(jiàn)的自身免疫性疾病，約影響全球0.5%～1.0%的成年人，RA 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為與環(huán)境因素，DNA 甲基化，免疫耐受被打破，T、B 細(xì)胞功能失調(diào)以及免疫炎癥等密切相關(guān)［1-2］。近年來(lái)有關(guān)程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）／PD-L1 信號(hào)在RA 病程中的作用機(jī)制、臨床檢測(cè)方法和靶向治療方面有了長(zhǎng)足的進(jìn)展，本文就上述研究進(jìn)展作一綜述。

1 RA 患者PD-1／PD-L1 信號(hào)調(diào)節(jié)T 細(xì)胞功能的機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)，PD-1 分子的表達(dá)與RA 疾病進(jìn)程有關(guān)，PD-1在RA 活動(dòng)期的表達(dá)水平顯著高于RA 緩解期，即使在緩解期，PD-1 的表達(dá)水平也明顯高于健康人對(duì)照［3］。盡管PD-1在RA 患者滑膜組織及外周血T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和DCs 等細(xì)胞表面呈高表達(dá)，但相關(guān)研究表明PD-L1 在RA 患者滑膜組織中的表達(dá)降低，且RA 患者血清或滑膜液中存在可溶性PD-1（soluble programmed death 1，sPD-1）、sPD-L1 或PD-1 蛋白自身抗體等干擾PD-1／PD-L1 信號(hào)通路的分子［4-6］，導(dǎo)致PD-1信號(hào)不能發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。另外，參與RA 致病的免疫細(xì)胞的分化、代謝、功能調(diào)控也受到PD-1／PD-L1 通路的調(diào)控［7］。目前，針對(duì)PD-1 的人源化免疫球蛋白G1 單克隆抗體Peresolimab 在RA 患者的Ⅱ期臨床試驗(yàn)已顯示出較好的治療效果［8］。由此可見(jiàn)，明確PD-1／PD-L1 信號(hào)對(duì)RA 病程進(jìn)展的影響機(jī)制至關(guān)重要。

1.1 sPD-1 對(duì)RA 患者T 細(xì)胞PD-1／PD-L1 信號(hào)的調(diào)控sPD-1 由mRNA 的剪接或膜蛋白的裂解產(chǎn)生，是PD-1／PD-L1信號(hào)通路的阻斷劑，當(dāng)sPD-1 與PD-L1 特異性結(jié)合，可阻斷PD-1／PD-L1 通路負(fù)性信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。既往研究表明，sPD-1在慢性感染、抗腫瘤免疫和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。在RA 患者滑膜液和血清中sPD-1 的濃度顯著高于健康人對(duì)照組，且與DAS28 評(píng)分和臨床活動(dòng)期有關(guān)，經(jīng)過(guò)治療后的RA 患者血清sPD-1 的濃度顯著降低［9］。sPD-1 抑制負(fù)向調(diào)控機(jī)制可能是過(guò)多的sPD-1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞表面PD-1配體，使得PD-1 結(jié)合配體相對(duì)減少，抑制PD-1 的負(fù)性調(diào)控作用，加快、加劇關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和關(guān)節(jié)損傷。另外，RA 的發(fā)生、發(fā)展與促炎細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-21 和IL-17A）的產(chǎn)生有關(guān)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，這些炎性因子作用于T細(xì)胞可誘導(dǎo)sPD-1 的產(chǎn)生，經(jīng)腹腔注射PD-1 蛋白至CIA 小鼠模型可使小鼠體內(nèi)TH1／TH17 數(shù)量增加，導(dǎo)致TH1／TH17 比例失衡，關(guān)節(jié)嚴(yán)重受損［10］。綜上所述，sPD-1 通過(guò)阻斷PD-1 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)或使TH1／TH17 比例失衡，加速RA 進(jìn)展。

1.2 信號(hào)淋巴細(xì)胞活化分子相關(guān)蛋白［signaling lymphocytic activation molecule（SLAM）-associated protein，SAP］對(duì)RA 患者T 細(xì)胞PD-1／PD-L1 信號(hào)的調(diào)控 T 細(xì)胞是介導(dǎo)自身免疫性疾病的關(guān)鍵細(xì)胞，RA 患者外周血和滑膜組織中CD3+T細(xì)胞中PD-1 的表達(dá)水平顯著高于健康人對(duì)照組，并且與疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)［11］，這表明隨著RA 患者病情的進(jìn)展，疾病活動(dòng)度越高則PD-1+T 細(xì)胞比例越高。PD-1 作為負(fù)向調(diào)控分子在RA 患者T 細(xì)胞中呈高表達(dá)，但并沒(méi)有發(fā)揮其負(fù)向調(diào)控作用。因此，Sandigu 等［12］推斷PD-1 信號(hào)在RA 疾病進(jìn)展中被阻斷，具有阻斷PD-1 信號(hào)的SAP 高表達(dá)于RA 患者T 細(xì)胞，且與疾病活動(dòng)性密切相關(guān)。SAP 作為一種間接的“分子屏障”使PD-1 下游信號(hào)免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序（immuno-receptor tyrosine-based switch motif，ITSM）酪氨酸殘基不受含Src 同源性2 的蛋白酪氨酸磷酸酶2（SH2 domaincontaining protein tyrosine phosphatase-2，SHP2）活性的影響，阻止了SHP2 與PD-1 的相互作用，抑制PD-1 信號(hào)在T 細(xì)胞的負(fù)向調(diào)控功能［13］。這可能是PD-1 在RA 中不能發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用的另一原因。

2 PD-1／PD-L1 對(duì)CD4+T 細(xì)胞功能的影響

2.1 PD-1／PD-L1 對(duì)濾泡輔助性T 細(xì)胞（follicular helper T cells，Tfh）功能的影響 Tfh 是1 個(gè)特化的T 細(xì)胞亞群，其特征是高表達(dá)C-X-C 基序趨化因子受體5（C-X-C motif chemokine receptor type 5，CXCR5）、PD-1、誘導(dǎo)性共刺激分子（inducible costimulatory molecule，ICOS）、CD40L 和IL-21 等分子，這些分子可促進(jìn)Tfh 發(fā)育并遷移到生發(fā)中心，輔助B 細(xì)胞分化發(fā)育，從而產(chǎn)生抗體［14］。在此期間，Tfh 功能缺陷或亢進(jìn)都會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂。Tfh 功能亢進(jìn)對(duì)B 細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)強(qiáng)的輔助信號(hào)，使自身反應(yīng)性B 細(xì)胞活化，分泌大量針對(duì)自身抗原的抗體，導(dǎo)致RA、SLE 等多種自身免疫性疾病的發(fā)生。在Tfh 發(fā)育過(guò)程中PD-1 信號(hào)起著重要的調(diào)控作用，初始T 細(xì)胞（na?ve T cells，Tn）進(jìn)入T-B 細(xì)胞交界區(qū)發(fā)育是由CXCR5-磷酸肌醇3 激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）信號(hào)介導(dǎo)的，而PD-1／PD-L1 相互作用則可抑制該信號(hào)，使高表達(dá)PD-1 的Tn 發(fā)育為T(mén)fh 的數(shù)量下降［15］。另外，ICOS 信號(hào)是調(diào)節(jié)Tfh 功能的另一種重要信號(hào)的分子，ICOS缺陷患者的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（GC）形成受損，且Tfh 和記憶B細(xì)胞數(shù)量減少［16］，而ICOS 的表達(dá)增加會(huì)使Tfh 的比例增加，促進(jìn)B 細(xì)胞向漿細(xì)胞分化，產(chǎn)生大量自身抗體，從而導(dǎo)致自身免疫性疾病［17-18］。另有研究表明，PD-1 可下調(diào)ICOS信號(hào)，從而抑制淋巴濾泡中Tfh 的增殖，避免B 細(xì)胞過(guò)度增殖和抗體產(chǎn)生［19］。因此，PD-1 是Tfh 發(fā)育過(guò)程中有效的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。

2.2 PD-1／PD-L1 對(duì)外周輔助性T 細(xì)胞（peripheral helper T cells，Tph）功能的影響 Tph 是在抗環(huán)瓜氨酸化蛋白抗體陽(yáng)性的RA 患者滑膜中發(fā)現(xiàn)的一種CD4+T 細(xì)胞亞群，該亞群通過(guò)分泌趨化因子C-X-C 基序趨化性細(xì)胞因子配體13（C-X-C motif chemokine ligand 13，CXCL13），促進(jìn)炎癥部位淋巴濾泡和三級(jí)淋巴樣結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structure，TLS）的形成，并輔助B 細(xì)胞的發(fā)育，進(jìn)而加重RA 的病情［20-21］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，促炎因子TNF-α 和IL-6 可上調(diào)CXCL13的表達(dá)，而PD-1／PD-L1 信號(hào)具有負(fù)向調(diào)控CXCL13分泌的作用；當(dāng)使用抗PD-L1 或PD-L2 的單抗阻斷PD-1 信號(hào)后，Tph 增殖加速以及CXCL13 的表達(dá)增加［22］。在RA 患者滑膜中，與PD-1-T 細(xì)胞相比，PD-1hiCXCR5-Tph 中IL-21、CXCL13、IFN-γ和IL-10mRNA 的表達(dá)量顯著增加，說(shuō)明其具有輔助B 細(xì)胞分化的功能。在淋巴聚集體中，PD-1hiCXCR5-T細(xì)胞和PD-1hiCXCR5+T 細(xì)胞均與B 細(xì)胞相鄰；而在淋巴聚集體以外的區(qū)域，與B 細(xì)胞相鄰的大多數(shù)是PD-1hiCXCR5-T 細(xì)胞。以上結(jié)果表明PD-1hiCXCR5-T 細(xì)胞具有獨(dú)特的能力，可以在淋巴聚集體和炎癥滑膜中廣泛與B 細(xì)胞相互作用，促進(jìn)B 細(xì)胞分化為漿細(xì)胞并產(chǎn)生抗體［23］。Tph 的這種作用也存在于SLE 患者中，其頻率與疾病活動(dòng)性相關(guān)，并可促進(jìn)B 細(xì)胞表達(dá)靶向外周組織的遷移受體，由此可見(jiàn)，Tph 在SLE 中也具有病理潛能［24］。

2.3 PD-1／PD-L1 對(duì)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）功能的影響 Treg 是體內(nèi)具有免疫抑制功能的，以表達(dá)叉頭狀／翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3）、CD25hi為特征的CD4+T 細(xì)胞亞群，其缺失或功能異?？蓪?dǎo)致自身免疫病的發(fā)生［25］。研究發(fā)現(xiàn)，PD-1／PD-L1 信號(hào)途徑可調(diào)控Tn 向Treg 的分化。Tn 在PD-L1 包被的磁珠和TGF-β的作用下，可下調(diào)蛋白激酶B（protein kinase B，PKB／Akt）／哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路，同時(shí)上調(diào)磷酸酶和緊張素P 同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）等Treg 發(fā)育的關(guān)鍵信號(hào)分子，從而促使Tn 分化為T(mén)reg［26］。另外，Gotot 等［27］通過(guò)一系列過(guò)繼轉(zhuǎn)移試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)PD-L1 的Treg 通過(guò)PD-1／PD-L1信號(hào)依賴(lài)的方式抑制自身反應(yīng)性PD-1+B 細(xì)胞的活化和自身抗體的產(chǎn)生。在RA 的發(fā)展過(guò)程中，Treg 比例降低，功能受到抑制，經(jīng)過(guò)甲氨蝶呤治療后患者Tn 向Treg 分化比例增加，疾病進(jìn)程得到緩解［28］。因此，通過(guò)PD-1／PD-L1 信號(hào)通路誘導(dǎo)Treg 可能是治療RA 的一種新的策略。

3 PD-1 信號(hào)調(diào)節(jié)CD8 記憶T 細(xì)胞的產(chǎn)生和代謝

組織駐留記憶T 細(xì)胞（tissue-resident memory T cells，Trm）是以CD103 和CD69 為表型的第三類(lèi)記憶T 細(xì)胞亞群，被認(rèn)為是RA 復(fù)發(fā)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。在RA 患者的滑膜組織中高表達(dá)PD-1 的CD8+Trm 比例增加。研究表明，PD-1信號(hào)調(diào)節(jié)CD8+T 細(xì)胞記憶的形成和維持，與野生型小鼠相比，PD-1 缺失的小鼠在CD8+T 細(xì)胞記憶維持階段數(shù)量減少，使得淋巴區(qū)和非淋巴區(qū)CD8+Tm 顯著減少［29］。另外，TCR 信號(hào)強(qiáng)度與Tm 細(xì)胞的形成呈負(fù)相關(guān)，PD-1 信號(hào)的丟失會(huì)增強(qiáng)TCR 信號(hào)，使Tm 數(shù)量和功能受損［30］。在代謝方面，PD1 信號(hào)軸通過(guò)調(diào)節(jié)mTOR 依賴(lài)的糖酵解和脂肪酸氧化途徑，滿(mǎn)足靜息CD8+Tm 的能量需求，促進(jìn)CD8+Tm 的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持。上述結(jié)果表明，PD-1 是Tm 形成和代謝維持的調(diào)節(jié)劑［29］。

4 RA 患者PD-1／PD-L1 信號(hào)調(diào)節(jié)B 細(xì)胞功能的機(jī)制

約2／3 的RA 患者產(chǎn)生抗環(huán)瓜氨酸蛋白和／或變性免疫球蛋白（類(lèi)風(fēng)濕因子）的抗體。高水平和持續(xù)產(chǎn)生自身抗體表明B 細(xì)胞在RA 發(fā)病機(jī)制中起重要作用［31］。CXCR3 是記憶B 細(xì)胞遷移到滑膜炎癥部位重要的趨化因子受體。大多數(shù)表達(dá)CXCR3 的B 細(xì)胞在體外激活后可表達(dá)PD-1。與PD-1-B 細(xì)胞相比，PD-1+B 細(xì)胞具有更高的T 細(xì)胞共刺激能力和促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生能力［32］。PD-1+B 細(xì)胞參與糖酵解的基因顯著上調(diào)，Akt／mTOR 通路顯著激活，葡萄糖攝取顯著增加，在阻斷糖酵解途徑后PD-1+B 細(xì)胞消失，但目前其具體機(jī)制尚不清楚［33］。另有研究表明，在缺乏PD-1 信號(hào)的情況下（如PD-1 和PD-1 配體缺乏）導(dǎo)致長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞生成不足，數(shù)量減少，由于漿細(xì)胞分化本身不受PD-1 信號(hào)的影響，晚期生發(fā)中心更側(cè)重于產(chǎn)生長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞［34］。長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞可以在骨髓中存活數(shù)個(gè)月至數(shù)年，即使在缺乏自身反應(yīng)性T 和B 淋巴細(xì)胞慢性激活的情況下，長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞也可繼續(xù)分泌自身抗體［35］。消除自身抗原特異性的長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞對(duì)開(kāi)發(fā)新的免疫治療策略可能是一種新的方向。

5 PD-1／PD-L1 檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

傳統(tǒng)的PD-1／PD-L1 檢測(cè)方法包括免疫組織化學(xué)技術(shù)（IHC）、Western blot、ELISA 和流式細(xì)胞術(shù)（FCM）等。傳統(tǒng)方法均存在一定的局限性，例如IHC 是有創(chuàng)性檢查，重復(fù)性差，其結(jié)果判讀具有一定的主觀性，易誤診為假陰性結(jié)果［36］，Western blot 需要較高濃度的蛋白質(zhì)，在實(shí)際應(yīng)用中并不敏感［37］；ELISA 法需要昂貴的抗體來(lái)捕獲和標(biāo)記靶標(biāo)，且抗體的質(zhì)量存在差異［38］；FCM 檢測(cè)主要應(yīng)用于外周血檢測(cè)，對(duì)于組織檢測(cè)在臨床應(yīng)用中有一定的限制性；此外由于個(gè)體差異較大，正常參考值的確定比較困難。PD-1／PD-L1表達(dá)水平在臨床自身免疫病和腫瘤等疾病診斷和治療中具有重要價(jià)值，有望為疾病的靶向治療提供參考。因此，開(kāi)發(fā)高靈敏度、高精度，適合臨床的檢測(cè)方法具有十分重要的意義。目前，除了經(jīng)典方法以外，RNAscope 技術(shù)、正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography，PET）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS／MS）等多種方法已應(yīng)用于PD-1／PD-L1 的檢測(cè)。

5.1 RNAscope 技術(shù)在PD-1／PD-L1 檢測(cè)中的應(yīng)用 RNAscope 技術(shù)由美國(guó)ACD 公司開(kāi)發(fā)，用于檢測(cè)目的RNA 原位定量雜交的新技術(shù)。它克服了IHC 因抗體質(zhì)量、抗體來(lái)源及檢測(cè)條件等因素不同造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性的探針，幾乎可實(shí)現(xiàn)對(duì)所有基因的檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、信噪比高等優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，RNAscope技術(shù)在PD-1／PD-L1 檢測(cè)中與IHC［39］、PCR 和二代測(cè)序［40］等檢測(cè)方法具有較好的一致性。

5.2 PET 技術(shù)在PD-1／PD-L1 檢測(cè)中的應(yīng)用 PET 是一種無(wú)創(chuàng)、精準(zhǔn)、實(shí)時(shí)、可重復(fù)的成像技術(shù)，其檢測(cè)體內(nèi)PD-1 分子的原理是利用放射性核素標(biāo)記抗PD-1 抗體或抗體片段制成分子探針，引入活體后，探針靶向識(shí)別體內(nèi)的PD-1 分子，然后利用PET 對(duì)體內(nèi)的放射性攝取進(jìn)行測(cè)量，實(shí)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)PD-1 分子的定量檢測(cè)［41］。PET 探針是PET 影像學(xué)研究的先決條件，當(dāng)核素標(biāo)記抗PD-1 單克隆抗體作為探針顯像時(shí)，其識(shí)別PD-1 分子的親和力強(qiáng)，制備方法簡(jiǎn)單，但不易被機(jī)體迅速代謝，且穿透能力差限制了其臨床應(yīng)用。核素標(biāo)記低分子量PD-1 抗體片段、納米抗體顯像時(shí)，其穿透性強(qiáng)，半衰期短可被機(jī)體快速清除，已展現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿Γ欢?，核素?biāo)記低分子量PD-1 抗體片段、納米抗體也存在制備復(fù)雜、穩(wěn)定性較差、開(kāi)發(fā)成本較高等短板［42］。

5.3 LC-MS／MS 技術(shù)在PD-1／PD-L1 檢測(cè)中的應(yīng)用LC-MS／MS作為一種靈敏度高、準(zhǔn)確性好的蛋白質(zhì)定量技術(shù)，可獨(dú)立進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量分析，已被廣泛應(yīng)用于臨床。在PD-1 和 PD-L1 的檢測(cè)過(guò)程中，Zheng 等［43］利 用LC-MS／MS檢測(cè)方法首次使用自動(dòng)抗肽抗體測(cè)定福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixed and paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）組織中PD-1 和PD-L1 的含量，該方法提高了對(duì)FFPE 組織檢測(cè)的靈敏度和特異性。在另一項(xiàng)研究中［44］，研究人員開(kāi)發(fā)了一種完全自動(dòng)化、超靶向的雙向液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry，2D-LC-MS／MS）分析血清中的PD-L1 蛋白含量，其靈敏度比傳統(tǒng)LC-MS／MS 高出100 倍。由于該方法靈敏度高，可對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測(cè)。

6 小結(jié)及展望

PD-1／PD-L1 是機(jī)體免疫系統(tǒng)的強(qiáng)大調(diào)節(jié)分子信號(hào)，RA患者外周血、滑膜腔中的T、B 細(xì)胞直接或間接受sPD-1、PI3K／Akt／mTOR、ICOS 等PD-1／PD-L1 上、下游多種信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，從而影響RA 的臨床表現(xiàn)。目前，在臨床Ⅱ試驗(yàn)中，PD-1 抗體治療RA 已顯示出較好的療效。因此，通過(guò)有效的PD-1 抗體藥物治療，聯(lián)合先進(jìn)的檢測(cè)方法評(píng)估PD-1／PD-L1 的表達(dá)，有望為臨床治療RA 帶來(lái)新的希望和路徑。