杜 佳 原, 邢 逸 飛, 趙 慧 敏

(大連理工大學(xué) 環(huán)境學(xué)院 工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116024 )

0 引 言

紫外線、電離輻射等外源因素和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、甲基化劑等內(nèi)源因素[1]均會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激,引起活性氧(ROS)的異常產(chǎn)生與釋放[2].而過量的ROS會(huì)攻擊脫氧核糖核酸(DNA)的化學(xué)結(jié)構(gòu),造成一定程度的DNA氧化損傷.其中,在堿基修飾中研究最為廣泛的是鳥嘌呤(G)損傷,這一過程是將鳥嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)?-氧鳥嘌呤(8-oxoG).如果不對(duì)其進(jìn)行修復(fù),在DNA復(fù)制過程中就無法保證基因組的完整性[3-5].這樣不僅會(huì)引起細(xì)胞衰老和死亡,甚至?xí)斐杉?xì)胞的癌變[6-7].然而,細(xì)胞會(huì)分泌DNA糖基化酶,特異性地識(shí)別并切除特定的受損堿基[8-10].其中,甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶(Fpg)可以特異性識(shí)別并切除8-oxoG堿基.但Fpg活性的失常會(huì)導(dǎo)致8-oxoG堿基切除受阻,因此,對(duì)Fpg的酶活性和濃度進(jìn)行測(cè)定與評(píng)估可以反映鳥嘌呤受損程度,為污染物毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)提供技術(shù)手段.

Fpg的常規(guī)定量檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附法[11]、高效液相色譜法[12]、彗星實(shí)驗(yàn)[13]和凝膠電泳法[14]等.目前已經(jīng)開發(fā)出其他簡(jiǎn)便快捷的方法,例如比色法[15]、電化學(xué)法[16]和熒光法[17-19]等.其中熒光檢測(cè)Fpg的方法具有較強(qiáng)的特異性和選擇性等優(yōu)點(diǎn),已得到廣泛應(yīng)用.但該方法仍存在需要多酶協(xié)同、反應(yīng)較為復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)和背景值高等不足之處.

近幾年來,氧化石墨烯在熒光傳感領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[20-21].單鏈DNA可通過π-π堆積作用及靜電作用固定在氧化石墨烯表面,且兩者相互作用力較強(qiáng).由于氧化石墨烯具有較大的比表面積和較強(qiáng)的熒光淬滅性能,可以提供更多的附著位點(diǎn),從而連接大量單鏈DNA并淬滅單鏈DNA上標(biāo)記的熒光染料(如FAM基團(tuán)),因此本文利用氧化石墨烯固定單鏈DNA作用力強(qiáng)度不同的原理,構(gòu)建簡(jiǎn)單快速靈敏的檢測(cè)Fpg的熒光傳感方法.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

(1)實(shí)驗(yàn)試劑

濃硫酸(H2SO4,>98%)、石墨粉(化學(xué)純)、高錳酸鉀(KMnO4,分析純)、硝酸鈉(NaNO3,≥99%)、過氧化氫(H2O2,30%)購于天津市大茂化學(xué)試劑廠,三(羥甲基)氨基甲烷(Tris,>99%)、氯化鈉(NaCl,≥99%)、六水氯化鎂(MgCl2·6H2O,≥98%)、核糖核酸酶A(RNase A)購于生工生物工程(上海)股份有限公司,甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶、尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、人源脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1(APE 1)、核糖核酸酶Ⅰ(RNase Ⅰ)、10× NEBuffer 1(10 mmol/L雙(2-羥基乙胺基)三(羥甲基)甲烷鹽酸鹽、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L二硫蘇糖醇)、10 mg/mL牛血清蛋白(BSA)均購于New England Biolabs公司.胎牛血清購于美國Gibco公司.實(shí)驗(yàn)所用的Tris-HCl緩沖溶液含有20 mmol/L Tris、200 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2·6H2O(pH=7.0).實(shí)驗(yàn)所用超純水均為科瑞峰實(shí)驗(yàn)超純水系統(tǒng)產(chǎn)生.實(shí)驗(yàn)所用器材與用水均通過蒸汽滅菌鍋滅菌.寡核苷酸鏈購于生工生物工程(上海)股份有限公司,其序列為5′-C*G*A*CCGGCTCGGAGTA/i8oxodG/GA*A*T*G-FAM-3′,并將其命名為T1鏈.

(2)實(shí)驗(yàn)儀器

通過掃描電子顯微鏡(SEM,Hitachi,S-4800)對(duì)氧化石墨烯的表面微觀形貌進(jìn)行表征;通過傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR,ThermoFisher 6700)對(duì)材料的官能團(tuán)進(jìn)行表征;采用熒光光譜儀(Hitachi,F7000)檢測(cè)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度;采用CBS可調(diào)式單/雙面垂直電泳槽(美國C.B.S.公司)對(duì)核酸進(jìn)行凝膠電泳,并通過多功能激光成像儀(Amersham Typhoon)進(jìn)行凝膠成像.

1.2 氧化石墨烯的制備

本實(shí)驗(yàn)采用Hummers法制備氧化石墨烯,主要過程如下:將23 mL濃硫酸置于錐形瓶中并攪拌,將1 g石墨粉與0.5 g NaNO3混合后加入錐形瓶中,再將3 g KMnO4分多次加入錐形瓶中,在低于20 ℃下反應(yīng)2 h,升溫至35 ℃反應(yīng)30 min;向錐形瓶中加入46 mL H2O,升溫至98 ℃,反應(yīng)20 min,溶液變?yōu)樽攸S色,再向錐形瓶中加入5 mL H2O2,溶液呈亮黃色,室溫下攪拌30 min,最后用水離心洗滌數(shù)次,直至上清液呈中性且不含硫酸根.

1.3 Fpg的檢測(cè)

具體的實(shí)驗(yàn)方案如下:將T1鏈(50 nmol/L)加入不同濃度的Fpg在37 ℃下恒溫反應(yīng)100 min,反應(yīng)結(jié)束后加入氧化石墨烯的水溶液(15 μg/mL),振蕩混勻,室溫下混合10 min,反應(yīng)總體積為100 μL.將反應(yīng)后溶液與Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行混合,轉(zhuǎn)入石英比色皿中,測(cè)量其熒光強(qiáng)度.設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為494 nm,記錄發(fā)射光譜在504～600 nm的數(shù)據(jù),將激發(fā)和發(fā)射的狹縫設(shè)置為10 nm.所有熒光實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,并計(jì)算誤差棒.具體實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示.

圖1 Fpg熒光傳感原理示意圖

1.4 凝膠電泳分析

為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)原理的可行性,將4 μL 1 μmol/L的T1鏈與不同濃度梯度的Fpg(20、40、60、80、100 U/mL)、5 μL 10× NEBuffer 1、5 μL 1 mg/mL BSA進(jìn)行混合,37 ℃反應(yīng)1.5 h,反應(yīng)總體積為50 μL.反應(yīng)結(jié)束后,取10 μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行15%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,在預(yù)先配制的1× TBE緩沖溶液(9 mmol/L Tris-HCl,9 mmol/L H3BO3,1 mmol/L EDTA,pH 8.0)中以及在恒電流36 mA條件下電泳90 min.電泳結(jié)束后,采用Amersham Typhoon凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行成像,觀察酶切產(chǎn)物的條帶.

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化石墨烯形貌表征

(a) 所選區(qū)域的SEM圖

圖4 氧化石墨烯的EDS譜圖

圖5 氧化石墨烯的FTIR譜圖

2.2 檢測(cè)原理分析

將帶有8-oxoG堿基的單鏈DNA與Fpg進(jìn)行反應(yīng).Fpg能夠特異性識(shí)別并切除8-oxoG堿基,從而產(chǎn)生兩條酶切產(chǎn)物鏈,其中一條連接了FAM染料且堿基數(shù)目較少.反應(yīng)結(jié)束后加入氧化石墨烯.由于短鏈DNA(5個(gè)堿基)對(duì)氧化石墨烯的連接能力較弱,攜帶熒光基團(tuán)的短鏈DNA將被釋放出來,且不能被氧化石墨烯淬滅,從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光信號(hào).

為證明上述檢測(cè)原理,首先對(duì)DNA+GO、DNA+Fpg+GO與空白緩沖溶液進(jìn)行熒光檢測(cè).各樣品的熒光強(qiáng)度F如圖6所示.其中DNA+GO熒光強(qiáng)度較低,DNA+Fpg+GO熒光強(qiáng)度較高,而空白緩沖溶液基本沒有熒光信號(hào).熒光強(qiáng)度測(cè)試結(jié)果表明,Fpg可以切除8-oxoG堿基,使得T1鏈斷裂為兩部分,帶有FAM基團(tuán)的短鏈片段對(duì)氧化石墨烯的連接能力較弱,不能將其熒光淬滅.

圖6 不同反應(yīng)體系的熒光光譜圖

隨后,對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析,其電泳結(jié)果如圖7所示.結(jié)果表明隨著Fpg濃度(A(Fpg))的逐漸增大(由20 U/mL增大到100 U/mL),T1鏈(圖中第一行條帶)的濃度逐漸減小,酶切反應(yīng)后釋放的帶FAM基團(tuán)短鏈片段(圖中最后一行條帶)濃度逐漸增大.而第一列只含有T1鏈的條帶,均表明Fpg能夠特異性識(shí)別并切除8-oxoG堿基,產(chǎn)生帶FAM基團(tuán)的短鏈片段.電泳結(jié)果與熒光檢測(cè)結(jié)果保持一致,進(jìn)一步證實(shí)了熒光基團(tuán)通過DNA橋接氧化石墨烯實(shí)現(xiàn)Fpg定量檢測(cè)的機(jī)理.

圖7 不同F(xiàn)pg濃度下酶切產(chǎn)物的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化

為達(dá)到更好的檢測(cè)效果,本文對(duì)氧化石墨烯的濃度和酶切反應(yīng)時(shí)間等關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化.

因?yàn)閷?shí)驗(yàn)利用了氧化石墨烯高效淬滅FAM熒光基團(tuán)的能力,所以優(yōu)化氧化石墨烯的濃度(ρ(GO))至關(guān)重要.首先對(duì)氧化石墨烯濃度進(jìn)行優(yōu)化,將不同濃度(5～30 μg/mL)的氧化石墨烯加入總體積為100 μL的反應(yīng)體系中,測(cè)量混合物的熒光強(qiáng)度.如圖8(a)所示,在氧化石墨烯濃度為5～15 μg/mL內(nèi),熒光淬滅效率(F0-F1)/F0隨著氧化石墨烯濃度的增大而增高.當(dāng)氧化石墨烯濃度為15 μg/mL時(shí),熒光淬滅效率達(dá)到0.85以上,隨后基本保持不變,因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將氧化石墨烯濃度設(shè)定為15 μg/mL.

(a) 氧化石墨烯濃度

由于酶切反應(yīng)直接影響熒光響應(yīng),而酶切反應(yīng)時(shí)間為關(guān)鍵因素,因此對(duì)酶切反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,測(cè)量不同酶切反應(yīng)時(shí)間下混合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度Fr,如圖8(b)所示.結(jié)果表明隨著酶切反應(yīng)時(shí)間的增加(20～100 min),樣品的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng).考慮到快速檢測(cè)的需求,將酶切反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為100 min.

2.4 Fpg定量分析

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,對(duì)該傳感器的檢測(cè)性能進(jìn)行測(cè)試.向體系中加入不同濃度的Fpg,并檢測(cè)其熒光強(qiáng)度.如圖9所示,在Fpg濃度為0～20 U/mL時(shí),體系中的熒光強(qiáng)度隨著Fpg濃度的增大而增高.這是由于Fpg的濃度越大,在一定時(shí)間內(nèi)被切割的T1鏈越多,釋放出的T1鏈的3′端攜帶FAM基團(tuán)的片段就越多.因?yàn)槎替溒螌?duì)氧化石墨烯的連接能力非常弱,這些片段上的FAM基團(tuán)就不會(huì)被氧化石墨烯所淬滅,只有未被切割的T1鏈能夠被氧化石墨烯所淬滅,所以造成體系的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng).實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)Fpg的加入量在0～0.4 U/mL時(shí),Fpg的濃度與熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系(圖9插圖).經(jīng)擬合后得到的線性回歸方程為y=1 181x+703.4,相關(guān)系數(shù)R2為0.988,其中y代表熒光強(qiáng)度,x代表Fpg的濃度(U/mL).經(jīng)計(jì)算,該熒光傳感方法的檢出限(LOD)為0.014 U/mL.與已有的Fpg檢測(cè)文獻(xiàn)相比(表1),本文構(gòu)建的傳感器的LOD低于滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)和磁性納米探針協(xié)同熒光法[18]、DNAzyme循環(huán)切割分子信標(biāo)(MB)級(jí)聯(lián)放大熒光法[23]、含有8-oxoG:PdC堿基對(duì)的雙鏈探針熒光法[24]和精胺釕為探針的電化學(xué)發(fā)光法[25].

表1 DNA橋連氧化石墨烯基熒光傳感器與其他檢測(cè)方法的性能對(duì)比

圖9 熒光強(qiáng)度與Fpg濃度的關(guān)系

2.5 特異性分析

選用RNase A、UDG、APE 1、RNase Ⅰ來評(píng)價(jià)該方法對(duì)檢測(cè)Fpg的特異性,RNase A能催化降解RNA,UDG能水解單鏈或雙鏈上的尿嘧啶,APE 1能夠水解斷裂AP位點(diǎn),RNase Ⅰ可以去除DNA中的腺嘌呤核糖核苷酸(rA).在體系中加入相同濃度(60 U/mL)的上述各種酶,測(cè)量混合體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度.由圖10可知,僅加入Fpg時(shí),熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),其他對(duì)照組的熒光信號(hào)均較低.這表明僅有Fpg可以識(shí)別并切除8-oxoG堿基,由于T1鏈3′端攜帶FAM基團(tuán)的短鏈片段對(duì)氧化石墨烯的連接能力弱,從而使得這些短鏈片段游離在溶液中,造成溶液的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng),從而實(shí)現(xiàn)Fpg的定量檢測(cè).結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)對(duì)Fpg的定量檢測(cè)具有良好的選擇性和可靠性.

圖10 不同干擾物質(zhì)對(duì)Fpg檢測(cè)的影響

2.6 實(shí)際樣品中Fpg檢測(cè)

采用加標(biāo)回收法對(duì)稀釋后胎牛血清中Fpg進(jìn)行檢測(cè),將不同濃度的Fpg加入稀釋的胎牛血清體系中.如表2所列,在線性檢測(cè)范圍內(nèi)Fpg的回收率為93.5%～111%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～2.5%,表明該方法能夠較為可靠地檢測(cè)Fpg活性.

表2 稀釋胎牛血清中Fpg活性的檢測(cè)

3 結(jié) 語

本文基于不同長(zhǎng)度單鏈DNA橋連氧化石墨烯能力不同的原理構(gòu)建了一種快速、簡(jiǎn)便的Fpg熒光傳感方法.利用SEM、EDS和FTIR等技術(shù)對(duì)Hummers法合成的氧化石墨烯進(jìn)行表征,熒光法和電泳法證明反應(yīng)機(jī)理.隨后對(duì)氧化石墨烯的濃度和酶切反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化.在最佳反應(yīng)條件下對(duì)Fpg進(jìn)行定量檢測(cè),該傳感器檢測(cè)的線性范圍為0～0.4 U/mL,檢出限為0.014 U/mL,且具有較高靈敏度.采用加標(biāo)回收法對(duì)稀釋后胎牛血清中的Fpg進(jìn)行檢測(cè),回收率為93.5%～111%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～2.5%.該方法的建立為Fpg的簡(jiǎn)便靈敏檢測(cè)提供了新方法,為評(píng)價(jià)DNA氧化損傷、污染物毒性提供了技術(shù)支持.