劉 芳，宋笑龍，馬浩波，孟智勇，宗勝杰，王 宏，張 昭，田洪彰

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，河南 許昌 461000；2. 河南省煙草公司洛陽市公司，河南 洛陽 471000；3. 山東臨沂煙草有限公司費(fèi)縣分公司，山東 臨沂 276000）

香氣是評(píng)價(jià)煙葉內(nèi)在質(zhì)量的核心內(nèi)容和重要指標(biāo)。煙葉烤后散發(fā)出來的細(xì)膩清新的香氣大多來源于致香前體物質(zhì)的降解，萜類是其中重要一類。煙草中萜類致香前體物主要有類胡蘿卜素（四萜類化合物）、類西柏烷類和賴百當(dāng)類（二萜類化合物）[1-3]。賴百當(dāng)類化合物一般只存在于香料煙和部分雪茄煙中，西柏烷類[4-6]則是由烤煙表皮腺毛合成并分泌產(chǎn)生，調(diào)制后主要降解為茄酮及其衍生物[7]。類胡蘿卜素屬于四萜化合物，其降解產(chǎn)物是烤煙中性致香物質(zhì)的重要組成成分，并且香味物質(zhì)閾值相對(duì)較低、刺激性較小、香氣質(zhì)較好，能夠使煙葉產(chǎn)生木香、花香、果香和甜香等諸多特色香氣[8-9]。前人大量研究了萜類化合物合成和降解途徑[10-12]，也有部分學(xué)者對(duì)萜類化合物合成關(guān)鍵酶基因[13-14]進(jìn)行分析，但關(guān)于不同成熟階段的烤煙萜類化合物相關(guān)基因表達(dá)與煙葉品質(zhì)綜合分析的報(bào)道較少。成熟度是影響煙葉品質(zhì)的重要因素，采收成熟度偏低或偏高會(huì)導(dǎo)致烤后煙葉表現(xiàn)出青雜氣、刺激性重，香氣不足，口味寡淡等弊端，嚴(yán)重影響煙葉原料的工業(yè)可用性[15-19]。只有深入研究致香物質(zhì)在不同成熟度的差異規(guī)律，才能精準(zhǔn)把握煙草采收最佳成熟度[20-22]。

中煙100 是河南煙區(qū)的主栽品種，本項(xiàng)目針對(duì)中煙100 不同成熟度腺毛特性和葉面分泌物合成關(guān)系進(jìn)行差異性分析，并分析了萜類化合物合成和降解通路中相關(guān)酶基因表達(dá)的差異性，結(jié)合不同成熟度烤后煙葉香氣物質(zhì)含量開展比對(duì)分析，以期探明煙葉的最適采收期，為進(jìn)一步提高烤煙香氣質(zhì)量和工業(yè)可用性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2022 年在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所試驗(yàn)田開展，試驗(yàn)品種為中煙100。試驗(yàn)地塊肥力中等、均勻一致，行株距為1.2 m×0.5 m，其他田間栽培管理及病蟲害防治按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程實(shí)施。試驗(yàn)烤房為密集烤房，符合DB43T 1635—2019 《密集烤房建設(shè)及配套設(shè)備技術(shù)規(guī)范》標(biāo)準(zhǔn)?？痉垦b煙室規(guī)格為：8.0 m×2.7 m×3.5 m。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以16～18 葉位和10～13 葉位分別代表上部葉和中部葉作為研究目標(biāo)，以常規(guī)成熟采收為對(duì)照，根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)，設(shè)置采收成熟度差異梯度試驗(yàn)，成熟度設(shè)置及外觀標(biāo)準(zhǔn)如表1。

表1 不同成熟度標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for different maturity levels

分別在各部位葉片不同成熟度階段，取5 株代表性煙株的鮮煙葉，沿主脈兩側(cè)截取8片直徑為5 cm的圓形葉片混合用于葉表面分泌物的提取與檢測(cè)，同時(shí)取10 cm 左右的長條狀葉片混合用于腺毛密度觀察、類胡蘿卜素測(cè)定和RNA 的提取，每個(gè)處理重復(fù)3 次。其他葉片按照設(shè)定成熟度采收后，分別以三段式工藝在相同的烘烤條件下進(jìn)行調(diào)制，烤后各處理樣品分別取2 kg 用于常規(guī)化學(xué)成分測(cè)定、香氣成分測(cè)定及感官質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 煙葉腺毛形態(tài)觀察及腺毛密度統(tǒng)計(jì) 用FAA 固定液固定煙葉，每個(gè)樣本做3 次重復(fù)，經(jīng)0.2%羅丹明染料染色30 min 后，用清水去除未結(jié)合的羅丹明B，通風(fēng)條件下自然晾干，沿著葉片中部主脈兩側(cè)1 cm 處剪取1 cm×1 cm 左右的葉片組織，使用超景深顯微鏡觀察并拍照，觀察腺毛形態(tài)并對(duì)腺毛密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.2 類胡蘿卜素含量測(cè)定 采用95%乙醇浸提，分光光度計(jì)法檢測(cè)[23]。

1.3.3 西柏烷二萜醇的測(cè)定 取樣后采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 7890-5977）按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 470—2013 進(jìn)行西柏烷二萜醇含量的測(cè)定與分析，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.4 煙葉總RNA 的提取 采用RNA 提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit）提取參試煙葉的總RNA，將提取的RNA 用適量的DEPC 水（經(jīng)焦碳酸二乙酯處理過并經(jīng)高溫高壓滅菌的超純水）溶解后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 萜類化合物合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量測(cè)定采用One Step RT-PCR 反應(yīng)試劑盒（TaKaRa One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit）在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行RNA 的反轉(zhuǎn)錄和PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。根據(jù)GenBank 發(fā)布的DXR、CYP71D16、PAL、C4H、CHS、4CL和L25（內(nèi)參基因）序列設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增引物（見表2）。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×PCR Buffer 10 μL，TaqHS 0.4 μL，Mix 0.4 μL，正反向引物各0.4 μL，50×ROX 0.4 μL，Total RNA 2 μL，ddH2O 6 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s（前兩步為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，根據(jù)Ct值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表2 熒光定量PCR 引物序列Table 2 Sequences of fluorescence quantitative PCR primers

1.3.6 萜類化合物降解的中性致香物質(zhì)含量測(cè)定以二氯甲烷為萃取溶劑，采用Agilent 7890-5977 氣相-色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀離子掃描內(nèi)標(biāo)（北京微標(biāo)標(biāo)物公司）相對(duì)定量法對(duì)烘烤調(diào)制后煙葉的中性致香物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析[18]，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.7 常規(guī)化學(xué)成分測(cè)定 不同成熟度煙葉采集后通過同一工藝進(jìn)行烘烤處理，利用連續(xù)流動(dòng)分析儀，參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 159—2002 測(cè)定總糖、還原糖，YC/T 160—2002 測(cè)定煙堿，YC/T 161—2002測(cè)定總氮，YC/T 162—2002 測(cè)定氯含量，YC/T 173—2003 測(cè)定鉀含量。

1.3.8 感官質(zhì)量評(píng)價(jià) 各處理烘烤后的煙葉經(jīng)過恒溫恒濕回潮，切絲，卷制成（900±15）mg/支、長度為85 mm/支的單料煙支。由評(píng)吸專家參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 138—1998 對(duì)香氣質(zhì)、香氣量、雜氣、濃度、勁頭、刺激性、余味、燃燒性和灰色9 個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行打分，取其平均值，采用專家咨詢法并借鑒相關(guān)研究方法[24]，對(duì)9 個(gè)指標(biāo)分別賦以25%、15%、12%、10%、10%、13%、10%、2.5%和2.5%的權(quán)重，采用加權(quán)平均法計(jì)算各處理的感官質(zhì)量綜合分值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010、SPSS 19.0 進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同成熟度煙葉腺毛形態(tài)密度分析

腺毛按其形態(tài)可分為長柄腺毛、短柄腺毛和保護(hù)毛，一般認(rèn)為，腺毛密度大、腺毛分泌物多的烤煙吃味醇和、香氣濃郁[7]。腺毛形態(tài)如圖1 所示，腺毛密度統(tǒng)計(jì)詳見表3。

圖1 不同處理煙葉腺毛形態(tài)Fig. 1 Glandular hair morphology in flue-cured tobacco under different treatments

表3 不同處理烤煙腺毛密度Table 3 Glandular hair density in flue-cured tobacco with different treatments

從圖1 和表3 可以看出，各成熟度煙葉均以長柄腺毛居多（占60%左右），短柄腺毛較少（占25%左右），保護(hù)毛最少（占15%左右）。中部葉和上部葉的腺毛變化規(guī)律一致，隨著成熟度的提高，腺毛密度呈顯著下降趨勢(shì)，煙葉長柄腺毛和短柄腺毛脫落嚴(yán)重，保護(hù)毛變化幅度較小。隨成熟度提高，相鄰成熟度煙葉腺毛總量脫落幅度增大，以T3 與T4處理之間的脫落幅度最大，中、上部葉分別為33.57%、29.50%，T1 與T2 處理之間最小，分別為11.13%、12.33%。

2.2 不同成熟度煙葉類胡蘿卜素含量

類胡蘿卜素是一類重要的四萜類化合物，一般認(rèn)為類胡蘿卜素含量越高，烤后煙葉刺激性較小、香氣質(zhì)較好，能夠產(chǎn)生木香、花香、果香和甜香等特色香氣[8]。由表4 可知，隨著煙葉成熟度的提高，中、上部煙葉中的類胡蘿卜素含量均不斷降低，且各處理間差異達(dá)到顯著水平。降解幅度隨成熟度提高則表現(xiàn)為慢-快-慢的趨勢(shì)，T2 至T3 處理（成熟至完熟階段）降幅最大，中、上部葉分別達(dá)到了40.18%、33.83%，T1 至T2（欠熟至成熟）、T3 至T4（完熟至過熟）處理降解幅度相對(duì)較小。同一成熟度下煙葉類胡蘿卜素含量表現(xiàn)為中部葉>上部葉。

表4 不同處理烤煙類胡蘿卜素含量Table 4 Carotenoid content in flue-cured tobacco under different treatments

2.3 不同成熟度鮮煙葉西柏烷二萜醇含量

西柏三烯二醇是煙草表面腺毛最主要的分泌物，一般認(rèn)為，西柏三烯二醇含量越高，煙葉香氣越醇[11]。從圖2 可知，中部葉α-西柏三烯二醇（α-CBD）隨著成熟度的提高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，T3 處理含量達(dá)到最高，分別較T1、T2、T4高出13.77%、6.91%、2.42%；β-西柏三烯二醇（β-CBD）隨著成熟度的提高呈現(xiàn)不斷降低的趨勢(shì)；(α+β)-西柏三烯二醇含量在T3 處理時(shí)最高，顯著高于其他3 個(gè)處理。上部葉α-CBD、β-CBD、(α+β)-CBD含量變化趨勢(shì)與中部葉一致，α-CBD 含量T3 處理最高，T3 和T4 處理均顯著高于T1、T2，β-CBD含量 T1 處理最高，且不同處理間差異顯著；(α+β)-CBD 含量T3 處理最高，達(dá)到289.89 μg/g。

圖2 不同處理烤煙西柏三烯二醇含量Fig. 2 Content of cetylene glycol in flue-cured tobacco under different treatments

2.4 不同成熟度煙葉萜類化合物代謝基因表達(dá)量

基因CYP71D16和DXR共同參與了西柏烷類化合物的合成，基因PAL、C4H、4CL及CHS是類胡蘿卜素降解與轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因。由圖3 可知，隨著成熟度的增加，烤煙上部葉CYP71D16和DXR基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，均在T3 處理達(dá)到最高；類胡蘿卜素降解的關(guān)鍵基因PAL及4CL的表達(dá)量隨著成熟度的增加逐漸升高，C4H、CHS基因的表達(dá)量均表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)，在T3 處理達(dá)到最高且顯著高于其他3 個(gè)處理。烤煙中部葉CYP71D16和DXR基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，其中CYP71D16的表達(dá)量以T2 處理最高，且各處理間存在顯著差異，而DXR的表達(dá)量以T3 處理最高；類胡蘿卜素降解的關(guān)鍵基因PAL的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，C4H、4CL及CHS的基因表達(dá)量逐漸上升，在T3 處理達(dá)到最高后開始呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。

圖3 不同處理萜類化合物合成與降解關(guān)鍵基因表達(dá)量Fig. 3 Expression levels of key genes for synthesis and degradation of terpene compounds under different treatments

2.5 不同成熟度煙葉萜類化合物降解的中性致香物質(zhì)含量

從表5 可知，隨著成熟度的提高，類胡蘿卜素降解類中性致香成分總量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，與2.2 中類胡蘿卜素的研究結(jié)果一致。

表5 不同處理烤后煙葉萜類化合物降解的中性致香物質(zhì)含量Table 5 Contents of neutral aroma components degraded by terpenes in flue-cured tobacco leaves with different treatments μg/g

西柏烷類降解的中性致香成分總量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，中、上部葉均以T3 處理達(dá)到最高。中部葉T3 處理分別較T1、T2、T4 高出9.54%、4.44%、6.15%，上部葉T3 處理分別較T1、T2、T4高出37.50%、21.22%、12.73%。同一成熟度，中部葉>上部葉，與2.3 中西柏烷二萜醇的研究結(jié)果相一致。

2.6 不同成熟度烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分差異

從表6 可知，隨著成熟度的增加，上部葉總糖、還原糖呈先升高后降低的趨勢(shì)，以T3 處理最高，且顯著高于其他3 個(gè)處理。總氮含量逐漸降低，各處理的鉀離子、氯離子和煙堿含量差異不顯著，其中煙堿含量（3.55%～3.96%）偏高。中部葉總糖、還原糖呈先升高后降低的趨勢(shì)，以T2 處理最高，各處理的總氮、煙堿、氯離子含量差異不顯著，鉀離子含量T3 處理顯著高于T1、T2、T4，分別高出16.84%、17.89%、15.79%。從化學(xué)成分協(xié)調(diào)性[25]來看，上部葉T3 處理的糖堿比、鉀氯比均最高，各處理的氮堿比差異不大；中部葉糖堿比、氮堿比、鉀氯比均以T3 處理最高。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，成熟度的增加有利于總糖和還原糖含量及糖堿比和鉀氯比的提升，使烤后煙葉化學(xué)成分更協(xié)調(diào)。

表6 不同處理烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分Table 6 Conventional chemical components of flue-cured tobacco leaves with different treatments

2.7 不同成熟度烤后煙葉感官質(zhì)量

由表7 可知，中、上部煙葉不同成熟度的感官質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果均以T3 處理表現(xiàn)最佳。上部葉T3 處理的香氣質(zhì)好、勁頭足、刺激性小、余味綿長，吸食口感表現(xiàn)為細(xì)膩柔和，有回甜香，T1 處理燃燒性稍差，香氣透發(fā)性不佳，香氣量略顯不足，而T4處理煙氣口感較差，刺激性明顯，濃度稍低。中部葉T3 處理表現(xiàn)為香氣質(zhì)好、香氣量大，煙氣狀態(tài)較好，抽吸時(shí)滿足感強(qiáng)，相比于T3 處理，T2 處理香氣量、煙氣濃度較好，稍有雜氣，余味稍殘留，T4 處理香氣量略欠缺，濃度偏低，勁頭、燃燒性較差，而T1 處理煙氣質(zhì)量略粗糙，香氣質(zhì)欠佳，雜氣重，余味平淡，綜合表現(xiàn)最差。中部葉感官質(zhì)量綜合得分表現(xiàn)為：T3>T2>T4>T1。

3 討 論

本研究通過測(cè)定6 個(gè)與對(duì)萜類化合物合成與降解相關(guān)基因表達(dá)量，結(jié)合成熟過程中煙葉表面腺毛變化情況及烤后煙葉品質(zhì)，證實(shí)煙葉成熟度是影響烤煙香氣成分的重要因素，與烤后煙葉香氣含量及感官評(píng)吸質(zhì)量密切相關(guān)。隨著葉片逐漸成熟，長柄腺毛的腺頭逐漸脫落，腺毛密度降低，與前人研究一致[7]。在完熟葉片中基因CYP71D16和DXR的表達(dá)量最高，對(duì)應(yīng)烤后完熟煙葉中性致香成分總量最多、感官評(píng)價(jià)得分最高，表明煙草中二萜類物質(zhì)的降解物無論是在提升煙香、改善煙氣余味還是在降低煙氣刺激性、增進(jìn)吸味等方面都發(fā)揮了重要的作用，與彭國崗等[11]、張思琦等[13]研究結(jié)果一致。隨著成熟度的增加，基因PAL的表達(dá)量上調(diào)，C4H、CHS基因在完熟葉片中表達(dá)量最高，表明類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化、降解過程關(guān)鍵基因表達(dá)量與煙葉品質(zhì)密切相關(guān)，與文利超[14]等研究結(jié)果中類胡蘿卜素降解基因PAL表達(dá)下調(diào)趨勢(shì)相反。該文獻(xiàn)中煙葉樣品主要集中在大田旺長期，煙葉中的類胡蘿卜素處于積累階段，而本文煙葉采集于成熟衰老后期，類胡蘿卜素以降解為主，這可能是類胡蘿卜素降解酶基因表達(dá)量存在差異的重要原因。

本研究表明，在一定程度上，成熟度越高的煙葉物質(zhì)轉(zhuǎn)化越充分，化學(xué)成分越協(xié)調(diào)，香氣越飽滿，但過熟煙葉會(huì)導(dǎo)致內(nèi)含物質(zhì)降解過度，煙氣平淡無味，滿足感降低，整體質(zhì)量下降，與前人研究結(jié)果一致。由于烘烤工藝也是影響煙葉色素降解幅度及香味物質(zhì)含量的重要因素，不同成熟度煙葉自身生理生化變化不同，導(dǎo)致失水、變黃過程對(duì)烘烤條件的需求可能存在差異，但本文通過對(duì)烤前煙葉的萜類物質(zhì)及相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行差異分析，避免了烘烤工藝對(duì)煙葉質(zhì)量的影響，為選擇適宜成熟度提供了更有效的數(shù)據(jù)支撐。本文涉及的西柏烷類只是腺毛分泌物中的一類，其他腺毛分泌物含量及對(duì)煙葉質(zhì)量的影響有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究觀測(cè)了不同成熟度中煙100 腺毛形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及主要萜類化合物含量的差異，利用qRT-PCR 技術(shù)初步探索了烤煙萜類化合物合成與降解相關(guān)酶基因表達(dá)量，結(jié)合煙葉內(nèi)在品質(zhì)綜合分析表明，在當(dāng)前煙葉生產(chǎn)中煙100 成熟采收基礎(chǔ)上推遲采收5～7 d，使煙葉達(dá)到完熟程度，可提高煙葉的香氣物質(zhì)生成量，減輕烤后煙葉煙氣雜氣、刺激性，提高中上部煙葉質(zhì)量及工業(yè)可用性。