陳冰嬬 于淼 石貴山 王江紅 唐玉劼 徐晨 李海青 徐寧 周紫陽 王鼐

（吉林省農(nóng)業(yè)科學院作物資源研究所，130033，吉林長春）

高粱[Sorghumbicolor(L.) Moench]是全球重要的旱糧作物之一，其籽粒被廣泛用作口糧、飼料、釀造和生物燃料的原料。高粱籽粒根據(jù)其胚乳中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量不同可分為粳高粱（non-waxy sorghum）和糯高粱（waxy sorghum）。在粳高粱籽粒中直鏈淀粉含量約占總淀粉含量的20%～30%，支鏈淀粉含量約占總淀粉含量的70%～80%。而糯高粱籽粒中直鏈淀粉含量很低或者幾乎沒有，其淀粉顆?；居芍ф湹矸劢M成[1]。形成糯性胚乳的主要原因是控制淀粉合成過程中的關(guān)鍵酶——顆粒結(jié)合淀粉合成酶（granule-bound starch synthase，GBSS）的基因Waxy發(fā)生了突變，導致GBSS 缺失或者活性降低，胚乳中只有少量甚至沒有直鏈淀粉的合成，同時大量合成支鏈淀粉。目前有研究[2-3]表明，Waxy基因存在wxa、wxb、wxc和wxd4 個等位突變位點。wxa是在第3 外顯子處插入一個4kb 的片段，wxb是第8 外顯子G突變成T，wxc為第8 內(nèi)含子第1 個堿基G 缺失導致不能正常剪切，wxd為第9 內(nèi)含子最后一個堿基G 突變?yōu)镃 導致不能正常剪切。wxa和wxc型是片段插入或單堿基缺失造成的Waxy蛋白功能失活，wxb和wxd型是單堿基變異造成的Waxy功能減弱。糯性胚乳屬于隱性遺傳[4]。

我國生產(chǎn)的高粱籽粒80%用作釀酒和釀醋等釀造原料，10%用于畜禽飼料，5%用于食糧，5%為其他用途[5]。“好酒離不開紅糧”，高粱籽粒作為釀造白酒的原料獨具優(yōu)勢，出酒率高、風味醇厚濃郁、香正甘冽，遠勝于其他釀酒原料[6]。尤其糯高粱支鏈淀粉含量高、吸水率快、易于糊化，有利于釀酒有益微生物生長繁殖[7]，更容易轉(zhuǎn)化為乙醇和多種風味物質(zhì)[8]，糯高粱酒口感綿長、甘甜、柔和[9]。因此，中國名優(yōu)白酒的生產(chǎn)原料通常以優(yōu)質(zhì)糯高粱為主要原料[10]。糯高粱籽粒磨成高粱米口感軟糯，是做粥和米飯的佳品。糯高粱籽粒因其淀粉顆粒與蛋白質(zhì)結(jié)合較為松散，用于飼料也比粳高粱有較高的消化率[11-12]。因此，糯高粱在釀酒、食用和飼用方面具有諸多優(yōu)勢。

春播早熟區(qū)是我國高粱重要產(chǎn)區(qū)，常年高粱種植面積約40 萬hm2（600 萬畝），年產(chǎn)高粱200萬t，以種植粳高粱雜交種為主。提高高粱籽粒品質(zhì)、提高種植戶效益、滿足市場需要、促進春播早熟區(qū)高粱產(chǎn)業(yè)進一步發(fā)展，培育糯高粱親本、選育糯高粱雜交種是當前重要的育種目標之一。本文旨在介紹吉林省農(nóng)業(yè)科學院新培育的優(yōu)異糯高粱不育系吉5535A 的選育過程、特征特性及其應用，為糯高粱親本改良提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在大力推廣矮稈耐密適宜機械化收獲雜交種的生產(chǎn)背景下，培育矮稈耐密、品質(zhì)優(yōu)良糯高粱不育系要求其株高不高于90cm。一般培育糯高粱親本采用糯質(zhì)高粱種質(zhì)資源與粳高粱骨干親本雜交，在后代中鑒選糯性材料，但是糯質(zhì)種質(zhì)資源株高較高，與粳高粱骨干親本雜交后代很難選出株高適宜的糯性材料。因此，在選擇吉5535A 的糯質(zhì)親本時，選擇了一個株高較矮的糯性中間材料提供糯質(zhì)來源。這個糯質(zhì)供體是在粳高粱保持系406B 與糯高粱保持系ICS-34B[13]的雜交后代中鑒選出來的。406B 和ICS-34B 均是印度親緣材料，具有較強的抗逆性、品質(zhì)優(yōu)良。利用406B 和ICS-34B 雜交培育出配合力高、抗逆性強、品質(zhì)優(yōu)良的吉521AB[14]，選育出優(yōu)良食用型雜交種吉雜305[15]。吉5535A 的另一個親本選用了粳高粱骨干保持系吉2055B 為母本。吉2055B 由2 個粳高粱保持系314B 和V4B 雜交選育而來，株高約70cm，配合力高、高抗高粱絲黑穗病、品質(zhì)優(yōu)良，其籽粒蛋白質(zhì)含量13.28%、單寧含量0.07%[16]。

1.2 試驗設(shè)計

粳高粱保持系406B 與糯高粱保持系ICS-34B的雜交分離后代中鑒選糯質(zhì)保持類型作為父本，以粳型骨干保持系吉2055B 為母本進行人工去雄雜交，在F2分離后代中鑒選糯質(zhì)材料，連續(xù)自交至穩(wěn)定，在每一代中采用0.2%I2-2%KI 試劑鑒選糯性種質(zhì)。為縮短回交轉(zhuǎn)育不育系穩(wěn)定的時間周期，采用吉2055A 為不育源連續(xù)回交至穩(wěn)定，在每一代不育材料中采用0.2%I2-2%KI試劑鑒選糯性不育株。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 田間快速鑒選糯性種質(zhì) 在籽粒灌漿期，用剪刀將籽粒剪開漏出漿液，用移液槍將0.2%I2-2% KI 試劑涂抹在漿液上，若漿液顏色變?yōu)樯钏{色，則該籽粒為粳型，若漿液顏色變?yōu)樽霞t色，則該籽粒為糯型。

1.3.2 糯性種質(zhì)的進一步確定 取3～5g 籽粒粉碎。準確稱取0.1g 粉碎樣品于100mL 容量瓶中，再加入1mL 無水乙醇，充分濕潤樣品，使樣品分散開來，隨后加入9mL 1mol/L NaOH 溶液，在沸水浴中加熱分散10min，迅速冷卻至室溫，用蒸餾水定容。吸取堿分散液5.00mL 于100mL 容量瓶中，加水50mL，隨后加入1mL 1mol/L 乙酸溶液并加入1mL 0.2% I2-2% KI 試劑，用水定容至100mL。顯色10min。溶液顏色變?yōu)樽霞t色的種質(zhì)為糯性，變?yōu)樯钏{的種質(zhì)為粳性。

1.3.3 不育系回交轉(zhuǎn)育過程中糯性不育材料的鑒定 在播種之前，將每份不育材料籽粒在遠離胚芽端切開，選出蠟質(zhì)胚乳的籽粒催芽之后種植，以保證每個穗行種植的材料都是糯質(zhì)材料。

1.3.4 遺傳距離估算和Waxy基因等位突變類型分析 在發(fā)芽盒中播種吉5535B、吉521B、吉2055B 以及5933、吉R105、吉R107、吉R109、吉R117、吉R159、吉R8036、吉R9060、南108、南133、0-30、T180、LR9198、忻粱52 等14 個骨干恢復系種子，生長至3～4 葉。取幼嫩葉片采用CTAB 法提取樣本基因組DNA[17]，在北京諾禾致源科技股份有限公司進行全基因組5×重測序，采用Tassel 5.0 估算遺傳距離。采用DPS 14.10 進行t檢驗。

采用表1 引物進行PCR 擴增及Waxy基因等位突變分析，其中Wx-F2 和Wx-R2 引物由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院分子育種團隊設(shè)計。選用LR9198 粳型種質(zhì)為Wx-WT 對照，糯性種質(zhì)0-01 為Wxa對照。

表1 Waxy 基因等位突變分析采用的引物Table 1 The primers of allelic variation of Waxy

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 記錄并整理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 吉5535A 的選育過程

2010 年夏季以吉2055B 為母本、以406B 與ICS-34B 雜交分離的后代中鑒選的糯質(zhì)材料為父本進行人工去雄雜交，獲得F1代種子。2010 年冬在海南種植F1代，自交獲得F2代種子。2011 年在吉林省農(nóng)業(yè)科學院公主嶺試驗地種植F2代，在籽粒灌漿期采用0.2%I2-2%KI試劑染色法在分離群體中鑒選糯性種質(zhì)。2011 年冬季在海南種植F3代，將糯性種質(zhì)單獨種植，在灌漿期復鑒。2012年將鑒選的F4代糯性種質(zhì)種植在公主嶺試驗地，在開花期選擇株高較矮的材料為父本，以吉2055A為不育源進行雜交，2012 年冬至2015 年夏連續(xù)回交至BC5代，回交過程中采用切粒法鑒定，確保種植的每一粒種子都是糯質(zhì)材料，2015 年遺傳性狀穩(wěn)定一致的糯質(zhì)不育系，定名為吉5535A/B。其選育過程見圖1。

圖1 吉5535A 選育過程Fig.1 The breeding process of Ji 5535A

2.2 吉5535A 特征特性

2.2.1 植物學特性 吉5535A 芽鞘綠色、幼苗綠色，臘質(zhì)葉脈；株高85cm，葉片數(shù)18 片左右，倒2 葉夾角34.35°、倒3 葉夾角34.85°，葉片較上沖；莖節(jié)數(shù)10；穗中緊，紡錘形，穗長23～25cm，平均單穗粒重47.8g；紅殼白粒，粒大，平均千粒重27.2g；籽粒容重723.7g/L。

2.2.2 生物學特性 吉5535A 生育期118d，為中早熟不育系。不育性穩(wěn)定，不育率100%，雌蕊柱頭呈羽毛狀，白色、外露、發(fā)達。柱頭生活力強，接受異交授粉時間可達10d。

2.2.3 籽粒品質(zhì)特性 經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（哈爾濱）檢測，結(jié)果顯示，吉5535A 籽粒含粗淀粉69.53%、支鏈淀粉99.17%、直鏈淀粉0.83%、粗蛋白14.29%、單寧0.01%、賴氨酸0.33%。

2.2.4 抗逆性 經(jīng)遼寧省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所鑒定，吉5535A 高抗高粱絲黑穗病，抗炭疽病，中抗莖基腐病，抗靶斑病。

2.2.5 吉5535A 與骨干恢復系的遺傳距離分析 采用Tassel 5.0 分別估算吉5535A、吉2055A、吉521A 與14 個骨干恢復系的遺傳距離（圖2），吉5535A 與14 個恢復系的遺傳距離變幅為0.6336～0.7057，吉2055A 與14 個恢復系的遺傳距離變幅為0.6473～0.7253，吉521A 與14 個恢復系的遺傳距離變幅為0.6660～0.7093。t檢驗結(jié)果顯示，吉5535A 和14 個恢復系的遺傳距離與吉521A 和14個骨干恢復系的遺傳距離相比差異不明顯，相比吉2055A 與14 個恢復系遺傳距離差異明顯。

圖2 吉5535A、吉2055A、吉521A 與骨干恢復系遺傳距離比較Fig.2 Comparison of genetic distance between Ji 5535A,Ji 2055A,Ji 521A and backbone restorer lines

2.2.6Waxy基因突變類型分析 由圖3a 可見，吉2055A、吉521A 和吉5535A 擴增片段大小均為523bp，確定不是Wxa突變類型。利用Wx-F2 和Wx-R2 引物PCR 擴增后再測序，測序結(jié)果如圖3b所示。序列比對顯示，吉2055A 和吉521A 發(fā)生了2 處單堿基突變，但均為同義突變，未造成氨基酸的改變。吉5535A 經(jīng)序列比對后CDS 區(qū)804 位G突變成T，是Wxb突變類型。

圖3 吉5535A、吉2055A 和吉521A 的Waxy 基因測序結(jié)果Fig.3 The results of Waxy sequencing of Ji 5535A,Ji 2055A and Ji 521A

2.3 吉5535A 的比較優(yōu)勢與應用

2.3.1 品質(zhì)優(yōu)異 吉5535A 含支鏈淀粉99.17%，粗蛋白14.29%，單寧0.01%，賴氨酸0.33%。與45A[20]和13163A[21]等當前骨干糯高粱不育系比較，其支鏈淀粉含量較高。利用吉5535A 與高單寧恢復系可配制出優(yōu)質(zhì)釀酒高粱雜交種，與低單寧恢復系可配制出優(yōu)質(zhì)飼用、食用高粱雜交種。

2.3.2 抗病性強 2020-2021 年連續(xù)2 年經(jīng)遼寧省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所鑒定，吉5535A 的2 年平均發(fā)病率為3.3%，表現(xiàn)為高抗高粱絲黑穗病。

2.3.3 籽粒大、千粒重高 吉5535A 的另一個突出特點是千粒重達到了27.2g，由表2 可知，45A千粒重24.1g，13163A 千粒重25.3g。吉5535A 與45A 等其他糯質(zhì)不育系比較，千粒重比較大。

表2 吉5535A 與其他骨干糯質(zhì)不育系品質(zhì)性狀的比較Table 2 Comparison of quality traits between Ji 5535A and other backbone waxy sterile lines

2.3.4 吉5535A 的應用 目前吉林省農(nóng)業(yè)科學院利用吉5535A 登記了糯高粱雜交種吉雜238 和吉糯雜3 號，籽粒飼用高粱雜交種吉雜240。正在登記的糯高粱雜交種有吉糯雜5、吉糯雜7、吉糯雜9 和吉糯雜10。吉雜238 總淀粉含量75.47%、支鏈淀粉含量99.37%，吉糯雜3 號總淀粉含量76.25%、支鏈淀粉含量98.10%，與目前各個生態(tài)區(qū)主推的糯高粱雜交種比較，總淀粉和支鏈淀粉含量占有一定優(yōu)勢（表3）。同時利用吉5535B作為重要種質(zhì)改良了大量骨干親本，進而選育優(yōu)良不育系。

表3 吉5535A 組配的糯高粱雜交種與各生態(tài)區(qū)主推糯質(zhì)雜交種品質(zhì)性狀比較Table 3 Comparison of quality traits between waxy sorghum hybrids bred by Ji 5535A and main waxy hybrids from different ecological regions

3 討論

高粱籽粒的糯性胚乳多出現(xiàn)在地方品種。為獲得糯高粱保持系，在育種中常采用粳型骨干親本與糯性種質(zhì)資源做人工去雄雜交，在F2代中鑒選糯質(zhì)材料，但是采用這種方法選育的糯質(zhì)材料，株高較高、株型披散、豐產(chǎn)性較差，在育種中難以利用。吉林省農(nóng)業(yè)科學院作物資源研究所高粱研究團隊采用粳型骨干保持系與矮稈糯質(zhì)中間材料雜交選育糯高粱不育系的方法有效提升了育種效率，選育出的適宜春播早熟生態(tài)區(qū)種植的糯高粱不育系吉5535A，對推進高粱早熟區(qū)糯高粱產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

吉5535A 具有配合力高的優(yōu)點。吉5535A 與高單寧恢復系糯878R 組配的糯高粱雜交種吉雜238產(chǎn)量高，新品種區(qū)域試驗產(chǎn)量達到9385.5kg/hm2，比對照吉雜210 平均增產(chǎn)6.25%。吉5535A 與高單寧糯高粱恢復系K1781 組配出釀酒糯高粱雜交種吉糯雜3 號產(chǎn)量9146.1kg/hm2，比對照吉雜210 平均增產(chǎn)4.40%，株高較矮、宜機收，具有較好的推廣應用潛力。吉5535A 與低單寧恢復系0-30 組配出籽粒飼用雜交種吉雜240 產(chǎn)量高，新品種區(qū)域試驗產(chǎn)量達到9743.9kg/hm2，比對照吉雜210 平均增產(chǎn)9.43%。

吉5535A 同時具備品質(zhì)優(yōu)良、籽粒大、高抗絲黑穗病等特性，利用其組配的雜交種均品質(zhì)優(yōu)良。吉5535A 籽粒含蛋白質(zhì)14.29%、賴氨酸0.33%，是選育食用高粱雜交種的優(yōu)良親本。吉5535A 千粒重27.2g，為培育高產(chǎn)糯高粱雜交種和大粒類型[22]糯高粱雜交種提供優(yōu)異親本。高粱絲黑穗病在糯性種質(zhì)中發(fā)病率較高，但是吉5535A 經(jīng)接種鑒定表現(xiàn)為高抗，為培育高抗絲黑穗病糯性種質(zhì)提供了重要種質(zhì)。組配的糯高粱雜交種吉雜238 粗淀粉含量75.47%、支鏈淀粉含量99.37%、蛋白質(zhì)含量9.91%、單寧含量1.10%。不僅是優(yōu)質(zhì)的釀酒原料，作為高粱米具有軟糯香甜的特點。吉糯雜3 號粗淀粉含量76.25%、支鏈淀粉含量98.10%、蛋白質(zhì)含量9.23%、單寧含量1.02%。吉雜240 粗淀粉含量78.76%、蛋白質(zhì)含量9.5%、單寧含量0.13%，是優(yōu)質(zhì)的籽粒飼用雜交種。

雖然吉5535A 與14 個骨干恢復系的遺傳距離相對于吉2055A、吉521A 與14 個骨干恢復系的遺傳距離稍小，但具有少量南非親緣的恢復系吉R105、吉R109、0-30 的遺傳距離大于吉521A 與之的遺傳距離，因此在組配雜交種時要重點選擇帶有南非血緣的恢復系與之組配雜交組合，以期獲得雜種優(yōu)勢強的雜交組合。吉5535AWaxy基因的等位突變?yōu)閃xb類型，在CDS 區(qū)域的804 位置堿基G 突變成T，有利于開發(fā)高通量分子標記在雜交后代中鑒選Wxb類型的糯性種質(zhì)。

4 結(jié)論

糯高粱不育系吉5535A 的成功創(chuàng)制，拓寬了糯高粱不育系的遺傳基礎(chǔ)，為我國糯高粱不育系改良提供優(yōu)異種質(zhì)，提升了春播早熟區(qū)糯高粱雜交種的產(chǎn)量和品質(zhì)，促進了釀酒、籽粒飼用、食用雜交種的培育。有助于進一步改良春播早熟區(qū)糯高粱的種植結(jié)構(gòu)，促進糯高粱雜交種的品種更替，增加國內(nèi)外糯高粱供給需求，將創(chuàng)造出更大的經(jīng)濟效益和社會效益。