馬蓮菊, 趙海彤, 任苓姝, 劉伊凝, 王 澤

(沈陽(yáng)師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034)

隨著工業(yè)的發(fā)展,重金屬污染越來(lái)越嚴(yán)重。鎘(Cd)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主要污染重金屬,其毒性僅次于汞。鎘不是植物生長(zhǎng)的必需元素,過量的鎘對(duì)植物有很大毒害作用[1]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于鎘對(duì)植物生理生化影響方面的研究有很多,但從遺傳毒理方面所做的研究較少。

蠶豆是一種廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物,是進(jìn)行遺傳學(xué)及毒理學(xué)研究的理想材料[2]。1982年由Francesca等[3]建立的蠶豆根尖細(xì)胞微核技術(shù)深受人們重視,在細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。

植物內(nèi)生菌作為一種新的微生物資源,在農(nóng)業(yè)上極具應(yīng)用潛力。內(nèi)生菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成成分,能提高農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育,增強(qiáng)農(nóng)作物的抗重金屬、抗鹽堿、耐干旱、耐寒和抗病蟲害發(fā)生能力等,進(jìn)而提高宿主植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性,從而保持植物生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定[4]。

在前期的研究中,課題組從野大豆中分離純化出一株內(nèi)生菌YD25,發(fā)現(xiàn)其具有吸附重金屬的作用。因此,選用內(nèi)生菌YD25侵染蠶豆根尖,研究其對(duì)Cd脅迫蠶豆根尖細(xì)胞遺傳毒理的影響效應(yīng),以期探明內(nèi)生菌對(duì)植物根尖細(xì)胞的誘抗活性,為內(nèi)生菌的研究開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料為日本青蠶豆種子;內(nèi)生菌YD25由沈陽(yáng)師范大學(xué)微生物遺傳實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生菌培養(yǎng)

將保存于PDA固體培養(yǎng)基中的內(nèi)生菌YD25轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中,并在24 ℃和120 rpm的恒溫?fù)u床中培養(yǎng),10 d后待用。

1.2.2 蠶豆培養(yǎng)及處理

在盛有蒸餾水的燒杯中放入洗干凈的蠶豆種子,然后將其置于25 ℃的溫箱內(nèi)浸泡12～24 h,此期間換水次數(shù)至少2次。將吸漲后的種子放入鋪有薄層濕潤(rùn)脫脂棉的平皿內(nèi),溫箱溫度調(diào)節(jié)為25 ℃,將平皿放入其中,催芽36～48 h,期間換水2～3次至大部分種子初生根長(zhǎng)為1～2 cm。

將已完成催芽的蠶豆種子分為2組,侵染組(E+)將30 mL 1%菌懸液加入蠶豆種子培養(yǎng)液中,進(jìn)行內(nèi)生菌侵染;未侵染組(E-)則不加入菌懸液,直接加入等量蒸餾水培養(yǎng)。2組同時(shí)用不同濃度CdCl2溶液(0, 4和8 mg·L-1)處理8 h,再進(jìn)行鎘脅迫處理,共6組,然后將處理好的種子用蒸餾水浸洗3次,每次2～3 min,洗凈后在25 ℃下恢復(fù)培養(yǎng)22～24 h。

恢復(fù)培養(yǎng)后,在根尖細(xì)胞分裂高峰期,切取1 cm左右根尖,使用Carnoy固定液固定2～24 h。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 解離

用蒸餾水浸洗固定好的根尖2次,每次5 min,吸凈蒸餾水。用1 M HCl在60 ℃下解離11 min左右,再用冷1 M HCl洗1次。吸去HCl,用蒸餾水浸沒根尖3次,每次1～2 min。

1.3.2 染色

在10 ℃左右的黑暗條件下,用Schiff試劑染色1 h。

1.3.3 漂洗

用漂洗液漂洗3次,每次3～5 min。

1.3.4 水洗、壓片、鏡檢

水洗5～10 min,滴一滴45%醋酸壓片。將制片置于低倍鏡下找到分生組織區(qū)中細(xì)胞分散均勻和分裂相較多的部位,再轉(zhuǎn)換到高倍鏡下觀察。每組觀察根尖數(shù)為10個(gè),每個(gè)根尖約1 000個(gè)細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

進(jìn)行根尖細(xì)胞微核千分率(MCN‰)、抑制率(%)、有絲分裂指數(shù)及染色體畸變率測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌對(duì)鎘脅迫下蠶豆根尖細(xì)胞微核的影響

由表1可見,在無(wú)鎘脅迫下,陰性對(duì)照微核率最低(5.92±0.35‰),內(nèi)生菌侵染后微核率明顯降低,抑制率達(dá)到21.11%;在鎘脅迫下,隨著鎘溶液濃度的增加,E-組與E+組的蠶豆根尖細(xì)胞微核率均增大,微核率與鎘溶液濃度之間表現(xiàn)為明顯的正相關(guān)。內(nèi)生菌對(duì)微核的產(chǎn)生表現(xiàn)出明顯的抑制作用,抑制率達(dá)到20%以上,但隨著鎘溶液濃度上升,抑制率呈現(xiàn)下降趨勢(shì),說明高濃度的鎘對(duì)內(nèi)生菌作用有一定阻礙;在鎘溶液濃度相同的情況下,E+組蠶豆根尖細(xì)胞微核率均明顯低于E-組(p<0.01或p<0.05)。

表1 內(nèi)生菌對(duì)鎘脅迫下蠶豆根尖細(xì)胞微核率、有絲分裂指數(shù)、染色體畸變率的影響

2.2 內(nèi)生菌對(duì)鎘脅迫下蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的影響

在無(wú)鎘脅迫下,E+和E-組相比,E+的有絲分裂指數(shù)明顯更高,且差異顯著(p<0.05);在鎘脅迫條件下,蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)隨鎘溶液濃度增加而呈下降趨勢(shì),具有濃度效應(yīng)。在同樣濃度的鎘脅迫下,蠶豆根尖經(jīng)內(nèi)生菌侵染處理后有絲分裂指數(shù)明顯升高(表1)。由此說明,內(nèi)生菌對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂存在著顯著的促進(jìn)作用。

2.3 內(nèi)生菌對(duì)鎘脅迫下蠶豆根尖細(xì)胞染色體畸變率的影響

由表1可見,鎘脅迫的根尖細(xì)胞染色體畸變率均大于未加鎘培養(yǎng)的根尖,說明鎘脅迫導(dǎo)致蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂過程中染色體發(fā)生畸變。內(nèi)生菌具有顯著的降低蠶豆根尖細(xì)胞染色體畸變的功能。在無(wú)鎘脅迫下,E+組蠶豆根尖細(xì)胞染色體畸變率明顯低于E-組(p<0.05)。在同濃度的鎘溶液處理時(shí),E+組較E-組的染色體畸變率明顯降低。

3 討 論

3.1 內(nèi)生菌對(duì)鎘脅迫下蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂的影響

重金屬對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞分裂的抑制作用主要體現(xiàn)在延長(zhǎng)分裂間期使分化的細(xì)胞數(shù)量下降[5]。當(dāng)植物抵抗重金屬脅迫時(shí),代謝系統(tǒng)被激活,加速了重金屬離子的進(jìn)入,使植物的代謝活動(dòng)受到抑制,從而對(duì)植物產(chǎn)生了毒害作用[6]。在重金屬離子濃度高時(shí),毒害作用超過了植物自身的保護(hù)作用,核酸酶活性降低,使DNA合成速率減慢,分裂間期延長(zhǎng),或與DNA結(jié)合,造成DNA的交聯(lián),阻礙DNA復(fù)制的順利進(jìn)行[7]。本研究發(fā)現(xiàn),在一定的濃度范圍內(nèi),有絲分裂指數(shù)隨鎘離子濃度升高而逐漸降低,表明鎘縮短了細(xì)胞分裂期,延長(zhǎng)了細(xì)胞分裂間期。內(nèi)生菌對(duì)促進(jìn)蠶豆根尖細(xì)胞分裂具有顯著作用,同時(shí)能有效地削弱鎘對(duì)蠶豆根尖的毒害作用。這表明內(nèi)生菌可以誘導(dǎo)蠶豆根尖細(xì)胞周期發(fā)生變化,即縮短細(xì)胞分裂間期,促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂態(tài)。有學(xué)者指出,內(nèi)生菌具有合適的降解途徑或重金屬整合系統(tǒng),能夠提高宿主植物對(duì)重金屬的耐受能力,從而有助于宿主植物在重金屬脅迫條件下生存[8]。

3.2 內(nèi)生菌對(duì)鎘脅迫下蠶豆根尖細(xì)胞染色體畸變的影響

染色體畸變是微核形成的主要原因。染色體或染色單體斷裂會(huì)導(dǎo)致染色體或染色單體缺失,或者引起各種重排,從而出現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)異常。鎘直接作用于DNA使DNA和蛋白質(zhì)的合成及RNA轉(zhuǎn)錄受到干擾,使與染色體運(yùn)動(dòng)有關(guān)的物質(zhì)(如紡錘體蛋白等)不能合成,或合成減少,造成染色體損傷后不能正常修復(fù)[9]。在本研究中,鎘脅迫作用于蠶豆根尖,導(dǎo)致不同程度的染色體畸變,染色體的畸變率與鎘的濃度呈正相關(guān)。被鎘染毒處理后的蠶豆根尖細(xì)胞內(nèi)存在著多種染色體畸變類型,如染色體斷片、染色體滯后、染色體橋、多極分裂等。有研究指出,內(nèi)生菌能夠提高植物對(duì)非生物脅迫的抗逆性,具有很強(qiáng)的耐重金屬性能[10-11]。通過本研究的數(shù)據(jù)也可以證明這一點(diǎn),E+組染色體畸變率明顯低于E-組。

3.3 內(nèi)生菌對(duì)鎘脅迫下蠶豆幼苗根尖細(xì)胞微核的影響

微核是指位于細(xì)胞質(zhì)中完全與主核分開的圓形或橢圓形的小核[12]。微核產(chǎn)生與具有損壞性質(zhì)的理化因子的作用有關(guān), 這些因子使染色體發(fā)生斷裂,成為斷片,斷片不能進(jìn)入子細(xì)胞而形成微核。因此, 微核率的高低可反映遺傳損傷的程度[13]。目前, 微核檢測(cè)技術(shù)已成為評(píng)價(jià)包括重金屬在內(nèi)的環(huán)境污染物毒性的有效方法[14]。本研究結(jié)果表明,蠶豆根尖細(xì)胞微核率隨鎘濃度的增加而增加,且與染色體畸變率呈正相關(guān)。施加內(nèi)生菌YD25后能有效地減少染色體畸變的產(chǎn)生,從而抑制蠶豆根尖細(xì)胞中微核的形成。因此,內(nèi)生菌YD25可用來(lái)緩解鎘毒害,促進(jìn)作物生長(zhǎng)。

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