宋士一, 劉 語(yǔ), 任 月, 彭 霞, 楊 明

(1. 沈陽(yáng)師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034;2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院, 太原 030031; 3. 沈陽(yáng)師范大學(xué) 生物系統(tǒng)進(jìn)化與農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 沈陽(yáng) 110034)

褐色脂肪組織(brown adipose tissue, BAT)廣泛存在于小型哺乳動(dòng)物中[1],分布于頸部、肩胛骨和主動(dòng)脈周?chē)?其可減少脂肪堆積,并通過(guò)非顫抖性產(chǎn)熱快速產(chǎn)生熱量,為寒冷環(huán)境的動(dòng)物提供熱量,提高生存率[2-3]。副交感神經(jīng)末梢(parasympathetic nerves)釋放去甲腎上腺素,與其β3受體結(jié)合后,能夠激活解耦聯(lián)蛋白-1(uncoupling protein 1,UCP 1),促進(jìn)BAT產(chǎn)熱[4]。哺乳動(dòng)物中,低溫是調(diào)節(jié)BAT活性的重要因素[5],研究發(fā)現(xiàn)冬季中緬樹(shù)鼩(Tupaiabelangerichinensis)BAT重量和UCP 1表達(dá)顯著高于夏季[6]。BAT最初在冬眠哺乳動(dòng)物冬眠前準(zhǔn)備階段被發(fā)現(xiàn),稱為“冬眠腺”,BAT產(chǎn)熱對(duì)動(dòng)物冬眠期間的體溫恢復(fù)有很重要的作用[1],動(dòng)物覺(jué)醒過(guò)程中亦伴隨著B(niǎo)AT激活[7]。冬眠動(dòng)物通過(guò)增加體內(nèi)非顫抖性產(chǎn)熱來(lái)終止冬眠狀態(tài)[8]。UCP 1活性在動(dòng)物冬眠和休眠過(guò)程中受到調(diào)節(jié)。例如,黃鼠在冬眠前BAT質(zhì)量、線粒體豐度和UCP 1表達(dá)增加[9],使BAT的產(chǎn)熱能力增強(qiáng)[10]。研究發(fā)現(xiàn),北極黃鼠(Urocitellusparryii)[11]、多紋黃鼠(Ictidomystridecemlineatus)[9]和達(dá)烏爾黃鼠(Spermophilusdauricus)[12]冬眠期間BAT中的UCP 1顯著增加。

冬眠指活躍狀態(tài)時(shí)體溫恒定的一些動(dòng)物在冬季(有時(shí)在晚秋或早春)伴隨體溫和代謝降低出現(xiàn)的一種昏睡狀態(tài)?，F(xiàn)存哺乳動(dòng)物很多類(lèi)群,如針鼴、有袋動(dòng)物、食蟲(chóng)動(dòng)物、蝙蝠、嚙齒動(dòng)物和食肉動(dòng)物中普遍存在冬眠的物種。冬眠是一種生理和行為上的適應(yīng),動(dòng)物通過(guò)冬眠前的能量?jī)?chǔ)存與冬眠期間代謝抑制的結(jié)合,確保在食物短缺的季節(jié)生存下來(lái)[13-17]。哺乳動(dòng)物在冬眠期間表現(xiàn)出體溫、代謝率、心率和呼吸頻率的顯著下降。 冬眠期,動(dòng)物體溫接近環(huán)境溫度甚至可以降至0 ℃以下,如多紋黃鼠[18]、北極黃鼠[15]和刺猬(Erinaceuseuropaeus)在冬眠期體溫下降到環(huán)境溫度。冬眠期,動(dòng)物平均代謝率可降低到基礎(chǔ)代謝率的5.1%[19],心率和呼吸頻率可降至3%[20]。研究表明,在深眠階段,黃鼠、倉(cāng)鼠和旱獺的呼吸頻率可降到3～10次·min-1,有的動(dòng)物甚至還會(huì)出現(xiàn)呼吸停歇現(xiàn)象。哺乳動(dòng)物冬眠的最大收益是節(jié)約能量。深冬眠期間每日能量消耗可以降低至常溫狀態(tài)的1.2%[21]。研究表明,野外瑞士黃鼠(Spermophilusrichardsonii)在長(zhǎng)達(dá)8 m的冬眠期會(huì)節(jié)約88%的能量消耗[22],哺乳動(dòng)物冬眠期間消耗的能量來(lái)源于冬眠前貯存的食物或貯存于身體內(nèi)的脂肪,這2類(lèi)動(dòng)物分別稱為貯食類(lèi)冬眠動(dòng)物和貯脂類(lèi)冬眠動(dòng)物[23]。貯脂類(lèi)冬眠動(dòng)物生活史的年周期主要包括繁殖、生長(zhǎng)、育肥和冬眠等過(guò)程[16],其顯著特征是在活躍季節(jié)尤其是冬眠前大量攝食并在體內(nèi)貯存脂肪,這個(gè)階段被稱為動(dòng)物育肥期,冬眠動(dòng)物在秋季冬眠前進(jìn)行體脂貯存可使體重增加1倍[24-26], 進(jìn)入冬眠期會(huì)停止攝食[27]。研究表明,育肥期的東北刺猬體重、肥滿度、消化器官和生殖器官重量顯著增加[28]。冬眠期,動(dòng)物主要以脂質(zhì)代謝供能為主[14],動(dòng)物體重呈下降趨勢(shì)。

達(dá)烏爾黃鼠是一種典型的貯脂類(lèi)冬眠動(dòng)物, 大約冬眠5～6 m,由于分布廣、數(shù)量多、好采集等特點(diǎn)而成為典型的研究冬眠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[28]。該物種主要分布在中國(guó)北方、蒙古及俄羅斯等地。本組已有的研究結(jié)果表明,達(dá)烏爾黃鼠在冬眠前通過(guò)增加攝食量來(lái)增加體重,并且在冬眠期間體重緩慢降低[28-29]。其活動(dòng)行為、代謝率、體溫、攝食量、血清中甲狀腺激素和BAT中UCP 1表達(dá)亦產(chǎn)生年周期性變化[28]。本研究在之前研究的基礎(chǔ)上,采集不同時(shí)期的達(dá)烏爾黃鼠,分別檢測(cè)其體重、攝食量、肩胛骨褐色脂肪重量和褐色脂肪中UCP 1的表達(dá),探究達(dá)烏爾黃鼠年周期褐色脂肪變化,來(lái)闡明冬眠動(dòng)物褐色脂肪年周期的適應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究使用的達(dá)烏爾黃鼠于2015年5月和2016年5月在內(nèi)蒙古通遼市(122.16°E,43.37°N)捕獲。帶回至沈陽(yáng)師范大學(xué)動(dòng)物房,單籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)籠大小為48 cm×35 cm×20 cm,用碎刨花做巢材,喂飼以充足的標(biāo)準(zhǔn)鼠糧(沈陽(yáng)前民飼料廠)及飲水。育肥期動(dòng)物房溫度為(23±2) ℃,光照∶黑暗=12∶12,冬眠期動(dòng)物房溫度為(5±2) ℃,全黑。每周測(cè)量動(dòng)物體重一次,以確定其增肥狀況。

1.2 動(dòng)物分組(animal grouping)

動(dòng)物體重的變化被用來(lái)估計(jì)育肥期間的3個(gè)不同階段。 包括: 1)起始育肥期(early-fattening, EF,n=8), 此時(shí)動(dòng)物的體重開(kāi)始增加; 2)快速育肥期(mid-fattening, MF,n=8), 動(dòng)物體重較EF期顯著增加; 3)育肥完成期(post-fattening, PF,n=7), 即冬眠前動(dòng)物體重下降時(shí)期。 PF期結(jié)束后立即將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物轉(zhuǎn)移到全黑暗、環(huán)境溫度為(5±2) ℃的寒冷房間, 水食自取。 使用冬眠時(shí)間的長(zhǎng)度來(lái)估計(jì)冬眠期間的3個(gè)不同階段, 包括: 1)冬眠早期(early-hibernating, EH,n=8), 動(dòng)物進(jìn)入冬眠后1 m; 2)冬眠晚期(late-hibernating, LH,n=8), 動(dòng)物進(jìn)入冬眠后4 m; 3)出眠期(arousal, AR,n=8), 動(dòng)物結(jié)束冬眠后1 w。

1.3 體重、攝食量、BAT重量測(cè)定

采用電子天平(上表電子儀器廠,SB10001)測(cè)量達(dá)烏爾黃鼠體重,1 w 1次,連續(xù)測(cè)量,并記錄。以第1 d稱食物重量為A(g),喂食3 d后,回收食物,稱重為B(g)。每天攝食量(g)=(A-B)/3。采用電子天平測(cè)量達(dá)烏爾黃鼠BAT重量,并記錄。

1.4 UCP1表達(dá)檢測(cè)

具體步驟如下:

1) 蛋白樣品制備; 2)安裝設(shè)備,測(cè)漏,配制分離膠和濃縮膠; 3)蛋白Marker和待測(cè)樣品上樣; 4)電泳,58 mV下電泳上樣樣品,3～5 h; 5)轉(zhuǎn)膜,150 mA下轉(zhuǎn)膜,2 h; 6)封閉液孵育4 ℃,3 h; 7)一抗孵育,4 ℃,過(guò)夜; 8)回收一抗,1×TBST緩沖液清洗3次,每次5～10 min; 9)二抗孵育,室溫,2 h; 10)回收二抗,1×TBST緩沖液清洗,4次,每次5～10 min; 11)曝光,顯影; 12)灰度檢測(cè)分析,用Image-J軟件對(duì)所得條帶灰度測(cè)量分析,并記錄。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 20.0系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,各時(shí)期體重、攝食量、BAT重量和解耦聯(lián)蛋白1(UCP 1)量,均用單因素方差分析(one-way analysis of variance)的方法來(lái)分析,用Excel繪制圖表,數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)形式表示。p<0.05表示差異顯著,p<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 黃鼠的體重變化

對(duì)黃鼠體重測(cè)量發(fā)現(xiàn),黃鼠體重(圖1)呈年周期變化模式,黃鼠在起始育肥期體重開(kāi)始增加,達(dá)到體重最高峰時(shí),約增長(zhǎng)了70%的重量,平均每天增長(zhǎng)(1.92±0.21) g,入眠前期體重下降,冬眠階段黃鼠體重緩慢降低,平均每天降低(0.74±0.05) g。

圖1 黃鼠年周期體重變化圖Fig.1 The annual change of body weight

2.2 不同時(shí)期黃鼠BAT重量

黃鼠BAT重量結(jié)果如圖2所示,EL組黃鼠BAT重量顯著高于其他組,為(2.40±0.17) g,AR組黃鼠BAT重量較LH組顯著下降。育肥期,黃鼠BAT重量緩慢增加。

圖2 不同時(shí)期BAT重量變化Fig.2 The weight of BAT at different stages

2.3 不同時(shí)期BAT中UCP 1表達(dá)

不同時(shí)期黃鼠BAT中UCP1表達(dá)結(jié)果如圖3所示,EF組黃鼠BAT中UCP 1表達(dá)為(0.844±0.07), MF組BAT中UCP 1表達(dá)為(0.960±0.07),PF組BAT中UCP 1表達(dá)為(1.169±0.18),EH組BAT中UCP 1表達(dá)為(1.151±0.07),LH組BAT中UCP 1表達(dá)為(1.18±0.09),AR組黃鼠BAT中UCP 1表達(dá)為(0.881±0.08),PF組、EH組、LH組黃鼠UCP 1表達(dá)顯著高于其他3個(gè)組。

3 討 論

在冬眠前儲(chǔ)存大量脂肪、增加體重對(duì)動(dòng)物冬眠有很重要作用[30],本研究表明,達(dá)烏爾黃鼠體重呈年周期變化,繁殖期后開(kāi)始育肥,體重在冬眠前下降,冬眠階段緩慢下降。Yan等[31]檢測(cè)金背黃鼠(SpemtophilusLaterali)冬眠階段體重的變化,在育肥階段成年雌性金背黃鼠體重平均每天增加(1.22±0.15) g,冬眠階段金背黃鼠平均每天降低(0.54±0.05) g,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,提示達(dá)烏爾黃鼠作為一種典型的貯脂型冬眠哺乳動(dòng)物,冬眠前育肥,為冬眠時(shí)儲(chǔ)存能量,并在冬眠期間消耗脂肪。

BAT產(chǎn)熱在動(dòng)物冬眠和冬眠覺(jué)醒中起著重要作用[32-33]。研究發(fā)現(xiàn),金黃黃鼠(Mesocvicetusauratus)在冬眠階段中消耗約255 mg BAT[34],蝙蝠(Eptesicusvulturnus)出眠后BAT重量顯著減少[35]。孫金生和曾縉祥[36]發(fā)現(xiàn)東北刺猬入眠前BAT重量顯著增加,出眠期BAT重量顯著下降。本研究發(fā)現(xiàn)達(dá)烏爾黃鼠在冬眠階段BAT重量顯著高于育肥階段,且出眠期黃鼠BAT重量顯著降低,結(jié)果提示黃鼠在冬眠前儲(chǔ)存大量BAT,出眠期消耗BAT,將體溫恢復(fù)到活動(dòng)狀態(tài)水平,進(jìn)而覺(jué)醒。UCP 1是BAT產(chǎn)熱蛋白,主要通過(guò)消耗質(zhì)子梯度來(lái)產(chǎn)生熱量[37]。研究發(fā)現(xiàn),冷馴化下大絨鼠BAT中UCP 1表達(dá)顯著增加[38],冬眠期多紋黃鼠BAT中UCP 1顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)黃鼠在完成育肥期UCP 1已顯著增加,并在冬眠期保持高水平,出眠期顯著下降,推測(cè)在完成育肥期黃鼠增加UCP 1蛋白為冬眠做準(zhǔn)備,并在出眠期通過(guò)UCP 1產(chǎn)熱,進(jìn)而覺(jué)醒。本研究組之前發(fā)現(xiàn)黃鼠冬眠期UCP 1蛋白的mRNA表達(dá)增加[28],與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

綜上所述,達(dá)烏爾黃鼠體重呈年周期變化,在冬眠前進(jìn)行育肥,冬眠階段體重緩慢下降,冬眠期黃鼠增加BAT重量和UCP 1表達(dá)量來(lái)維持體溫,出眠期通過(guò)UCP 1產(chǎn)熱,進(jìn)行覺(jué)醒。