柯淑紅 孔彩霞 徐瑤 彭聰

摘要：目的 研究circ_0092315對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響，并探討其分子機(jī)制。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中circ_0092315的表達(dá)水平，CCK-8法和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TPC-1細(xì)胞的增殖和侵襲能力，Western blot檢測(cè)高遷移率族蛋白A2（HMGA2）蛋白表達(dá)水平。通過(guò)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)印跡法探討circ_0092315、微小RNA-1256（miR-1256）和HMGA2的靶向調(diào)控關(guān)系。結(jié)果 circ_0092315在人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)（P均＜0.001）。circ_0092315促進(jìn)TPC-1細(xì)胞增殖和侵襲能力（P均＜0.001）。轉(zhuǎn)染circ_0092315小干擾RNA可上調(diào)miR-1256的表達(dá)水平（P<0.001）。miR-1256抑制物上調(diào)HMGA2蛋白表達(dá)（P＜0.001）。結(jié)論 circ_0092315在人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中呈高表達(dá)，通過(guò)調(diào)控miR-1256/HMGA2軸促進(jìn)TPC-1細(xì)胞的增殖和侵襲。

關(guān)鍵詞：甲狀腺乳頭狀癌；circ_0092315；微小RNA-1256；高遷移率族蛋白A2

中圖分類號(hào)： R581.9? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1000-503X（2023）01-0016-06

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15026

circ_0092315 Promotes Proliferation and Invasion of Papillary Thyroid Carcinoma Cells via Regulating microRNA-1256/High Mobility Group A2 axis

KE Shuhong1，KONG Caixia1，XU Yao2，PENG Cong1

1Department of Endocrinology，2Department of Pathology，Wuhan No.1 Hospital，Wuhan 430030，China

Corresponding author：PENG Cong Tel：027-85332130，E-mail：343747430@qq.com

ABSTRACT：Objective To investigate the role and mechanism of circ_0092315 in the proliferation and invasion of papillary thyroid carcinoma cells.Methods The expression of circ_0092315 in papillary thyroid carcinoma cells was examined by real-time fluorescence quantitative PCR.The proliferation and invasion of TPC-1 cells was assessed by CCK-8 and Transwell assays.The protein level of high mobility group A2 （HMGA2） was determined by Western blotting.The regulatory relationship of circ_0092315，microRNA-1256 （miR-1256），and HMGA2 was explored by bioinformatics tools，dual-luciferase reporter assay，real-time fluorescence quantitative PCR，and Western blotting.Results circ_0092315 was overexpressed in papillary thyroid carcinoma cells （all P<0.001）.circ_0092315 promoted the proliferation and invasion of TPC-1 cells （all P<0.001）.The transfection of si-circ_0092315 up-regulated the expression of miR-1256 （P<0.001），and miR-1256 inhibitor up-regulated the protein level of HMGA2 （P<0.001）.Conclusion circ_0092315 is overexpressed in TPC-1 cells and it promotes the proliferation and invasion of TPC-1 cells by regulating the miR-1256/HMGA2 axis.

Key words：papillary thyroid carcinoma；circ_0092315；microRNA-1256；high mobility group A2

Acta Acad Med Sin，2023，45（1）：16-21

甲狀腺癌是目前最常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，占內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤的95%［1］。甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌臨床病理分型之一，也是最常見(jiàn)、分化程度高、惡性度小的甲狀腺腫瘤［2］。盡管對(duì)其已有許多研究，但甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多因素的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，目前具體發(fā)病機(jī)制不清。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類共價(jià)閉合環(huán)狀的內(nèi)源性非編碼RNA，在正常生理活動(dòng)以及各種疾病進(jìn)程中具有重要作用［3］。研究表明circRNA在腫瘤中表達(dá)異常且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但circRNA在甲狀腺癌中的功能尚不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0060060在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)抑制微小RNA（microRNA，miR）-144-3p增加甲狀腺癌細(xì)胞的順鉑耐藥性［4］。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法研究circ_0092315對(duì)甲狀腺癌乳頭狀癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響，并探究其潛在的分子機(jī)制。

材料和方法

材料 人正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1、人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1、BCPAP、IHH4購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，TRIzol試劑盒、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，circ_0092315小干擾RNA（si-circ_0092315）及小干擾RNA對(duì)照（si-對(duì)照）、miR-1256模擬物及模擬物對(duì)照、miR-1256抑制劑及抑制劑對(duì)照、空載質(zhì)粒、過(guò)表達(dá)人高遷移率族蛋白A2（high mobility group A2，HMGA2）質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，兔抗人HMGA2抗體（貨號(hào)：ab207301）和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，RIPA裂解液和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1、BCPAP、IHH4細(xì)胞在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TPC-1細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于六孔板中，按照Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)處理情況將細(xì)胞分為si-circ_0092315組和si-對(duì)照組、miR-1256模擬物組和模擬物對(duì)照組、miR-1256抑制劑組及抑制劑對(duì)照組、si-circ_0092315+miR-1256抑制物組和si-circ_0092315+抑制物對(duì)照組、si-circ_0092315+過(guò)表達(dá)HMGA2組和si-circ_0092315+空載體組。

qRT-PCR檢測(cè) 采用Trizol試劑按說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在ABI 7500定量PCR儀上完成qRT-PCR擴(kuò)增，采用2-ΔΔCT法分別計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列：circ_0092315上游引物：5′-TGCCAGCATGTAGACCTCAG-3′，下游引物：5′-TTGTGAAAATGCCAAGGACA-3′；miR-1256上游引物：5′-GGCGCGATTTTAGTTTATC-3′，下游引物：5′-TTTAATTACCAACCGAATACG-3′；GAPDH上游引物：5′-GGATTTGGTCGTATTGGGCG-3′，下游引物：5′-CGGTGCCATGGAATTTGCC-3；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGC TTCACGAATTTGCGT-3′。circ_0092315基因檢測(cè)以GAPDH作為內(nèi)參，miR-1256基因檢測(cè)以U6作為內(nèi)參。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染si-circ_0092315的TPC-1細(xì)胞以2×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入10 μl CCK-8試劑在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔細(xì)胞在450 nm處的光密度（optical density，OD）值。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將10 μl Matrigel基質(zhì)膠均勻涂在Transwell小室內(nèi)面，待基質(zhì)膠凝固。向24孔板中加入600 μl含有10%血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，其內(nèi)放置Transwell（8 μm）小室。向小室內(nèi)加入轉(zhuǎn)染si-circ_0092315或陰性對(duì)照的TPC-1細(xì)胞（2.5×104個(gè)/孔），置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后取出小室，用棉簽將上室內(nèi)面的細(xì)胞去掉，4%多聚甲醛固定30 min，0.5%結(jié)晶紫染色液染色15 min，PBS清洗3次，用棉簽擦凈膜內(nèi)面未遷移的細(xì)胞和染料，在顯微鏡下拍照，每個(gè)孔隨機(jī)選5個(gè)視野拍照，并分別計(jì)數(shù)后求出平均值進(jìn)行比較。

Western blot檢測(cè) 按照每1.0×106個(gè)TPC-1細(xì)胞加入100 μl RIPA蛋白裂解液，混勻后置冰上30 min，4 ℃ 12 000 ×g離心30 min，取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白含量。將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜置于5%脫脂奶粉室溫中振蕩封閉1 h，TBST緩沖液清洗后，加入兔抗人HMGA2抗體（1∶1000）4 ℃孵育過(guò)夜，清洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 利用Circular RNA Interactome數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//circinteractome.nia.nih.gov/）預(yù)測(cè)circ_0092315靶基因。將circ_0092315的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)突變，構(gòu)建突變型（circ_0092315突變型）和野生型（circ_0092315野生型）熒光素酶報(bào)告載體（廣州銳博生物技術(shù)有限公司），并與miR-1256模擬物或模擬物陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至TPC-1細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后，利用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒（Promega公司，美國(guó)）檢測(cè)熒光素酶活性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，并采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較；多組間不同時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)? 果

人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞circ_0092315的表達(dá)水平 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與人正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1比較，人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1（3.152±0.053比0.989±0.007；t=104.977，P<0.001）、BCPAP（2.257±0.041比0.989±0.007；t=71.930，P<0.001）、IHH4細(xì)胞（1.859±0.059比0.989±0.007；t=37.323，P<0.001）中的circ_0092315表達(dá)水平顯著升高，且在TPC-1細(xì)胞中表達(dá)最高（F=483.233，P<0.001）。

circ_0092315對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響 與si-對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染si-circ_0092315的TPC-1細(xì)胞中circ_0092315表達(dá)水平顯著降低（0.486±0.046比0.990±0.009；t=30.982，P<0.001）。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，si-circ_0092315組的TPC-1細(xì)胞在24、48、72 h的細(xì)胞增殖能力顯著低于si-對(duì)照組（F=1896.298，P<0.001），且兩組OD值變化趨勢(shì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1320.688，P<0.001）（圖1A）。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，si-circ_0092315組TPC-1細(xì)胞的侵襲能力顯著低于si-對(duì)照組（37.000±5.121比94.100±4.012；t=27.756，P<0.001）（圖1B）。

circ_0092315與miR-1256的關(guān)系 利用Circular RNA Interactome數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，miR-1256和circ_0092315之間存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-1256模擬物和circ_0092315野生型共轉(zhuǎn)染后，與模擬物對(duì)照組比較，miR-1256模擬物組熒光素酶活性顯著降低（0.528±0.048比0.978±0.009；t=27.889，P<0.001）。與si-對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染si-circ_0092315的TPC-1細(xì)胞miR-1256表達(dá)水平顯著增加（2.126±0.063比0.986±0.011；t=51.347，P<0.001）。

si-circ_0092315和miR-1256抑制物對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，si-circ_0092315+miR-1256抑制物組TPC-1細(xì)胞在24、48、72 h的細(xì)胞增殖能力顯著高于si-circ_0092315+抑制物對(duì)照組（F=1690.251，P<0.001），si-對(duì)照+抑制物對(duì)照組、si-circ_0092315組、si-circ_0092315+抑制物對(duì)照組和si-circ_0092315+miR-1256抑制物組OD值變化趨勢(shì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=598.694，P<0.001）（圖2A）。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-對(duì)照+抑制物對(duì)照組比較，si-circ_0092315組TPC-1細(xì)胞遷移能力顯著降低（21.100±7.838比98.400±1.265，t=30.789，P<0.001）；與si-circ_0092315組比較，si-circ_0092315+抑制物對(duì)照組TPC-1細(xì)胞遷移能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（21.000±2.449比21.100±7.838，t=0.039，P=0.970）；與si-circ_0092315+抑制物對(duì)照組比較，si-circ_0092315+miR-1256抑制物組TPC-1細(xì)胞遷移能力顯著升高（55.400±3.098比21.000±2.449，t=27.542，P<0.001）（圖2B）。

circ_0092315和miR-1256對(duì)HMGA2表達(dá)的影響 利用Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-1256與HMGA2之間存在結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與模擬物對(duì)照組比較，miR-1256 模擬物組TPC-1細(xì)胞HMGA2蛋白表達(dá)水平顯著降低（0.267±0.036比0.990±0.007；t=51.946，P<0.001）；與抑制物對(duì)照組比較，miR-1256抑制物組TPC-1細(xì)胞HMGA2蛋白表達(dá)水平顯著升高（1.587±0.033比0.992±0.007；t=35.866，P<0.001）（圖3B）。與si-對(duì)照組比較，si-circ_0092315組TPC-1細(xì)胞HMGA2表達(dá)下降（0.237±0.036比0.990±0.008，t=64.648，P<0.001）；與si-circ_0092315組比較，si-circ_0092315+抑制物對(duì)照組TPC-1細(xì)胞HMGA2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.224±0.023比0.237±0.036，t=0.967，P=0.346）；與si-circ_0092315+抑制物對(duì)照組比較，si-circ_0092315+miR-1256抑制物組TPC-1細(xì)胞HMGA2表達(dá)顯著增加（0.528±0.048比0.224±0.023，t=17.955，P<0.001） （圖3C）。

過(guò)表達(dá)HMGA2和si-circ_0092315對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，si-circ_0092315+過(guò)表達(dá)HMGA2組TPC-1細(xì)胞在24、48、72 h的細(xì)胞增殖能力顯著高于si-circ_0092315+空載體組（F=3980.506，P<0.001），si-對(duì)照+空載體組、si-circ_0092315組、si-circ_0092315+空載體組、si-circ_0092315+過(guò)表達(dá)HMGA2組OD值變化趨勢(shì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1016.712，P<0.001）（圖4A）。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-對(duì)照+空載體組比較，si-circ_0092315組TPC-1細(xì)胞侵襲能力顯著下降（35.100±2.079比104.800±1.932，t=77.658，P<0.001）；與si-circ_0092315組比較，si-circ_0092315+空載體組TPC-1細(xì)胞侵襲能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（35.600±2.271比35.100±2.079，t=0.514，P=0.614）；與si-circ_0092315+空載體組比較，si-circ_0092315+過(guò)表達(dá)HMGA2組TPC-1細(xì)胞侵襲能力顯著升高（82.200±4.614比35.600±2.271，t=28.656，P<0.001）（圖4B）。

討? 論

近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明circRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)circ_0092315在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，且通過(guò)調(diào)控miR-1256/HMGA2通路促進(jìn)TPC-1細(xì)胞的增殖和侵襲。

circRNA通過(guò)分子海綿作用結(jié)合miRNA從而調(diào)控蛋白表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)作用。有文獻(xiàn)報(bào)道circ_0087862可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-1253，通過(guò)調(diào)控Ras癌基因家族蛋白R(shí)ab3D的表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展［6］；circ_0001955吸附miR-516a-5p上調(diào)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6/絲裂原激活蛋白激酶11的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移［7］。本研究通過(guò)生物信息方法預(yù)測(cè)circ_0092315靶基因，發(fā)現(xiàn)circ_0092315與miR-1256存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，干擾circ_0092315可上調(diào)miR-1256表達(dá)，抑制TPC-1細(xì)胞的增殖和侵襲能力。miR-1256已被證實(shí)在多種腫瘤中起到腫瘤抑制作用，其表達(dá)下調(diào)會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Chang等［8］研究發(fā)現(xiàn)circ_0026134通過(guò)分子海綿機(jī)制下調(diào)miR-1256和miR-1287表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲；Cai等［9］研究顯示circHECTD1通過(guò)靶向下調(diào)miR-1256表達(dá)激活β-連環(huán)蛋白/c-Myc信號(hào)通路促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。因此，circRNAs可能通過(guò)負(fù)調(diào)控miR-1256的表達(dá)發(fā)揮促癌作用。

本研究通過(guò)Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)HMGA2是miR-1256的靶基因，且miR-1256抑制HMGA2表達(dá)。HMGA2在多種惡性腫瘤中存在過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，并通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［10］。Dong等［11］研究顯示HMGA2參與驅(qū)動(dòng)的FOXL2反式激活可直接調(diào)節(jié)對(duì)化療耐藥胃癌的轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換。Ma等［12］研究表明miR-302a-5p/367-3p介導(dǎo)HMGA2表達(dá)可調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的惡性表型。此外，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)circRNA可通過(guò)調(diào)控HMGA2促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，circ_100565通過(guò)miR-506-3p/HMGA2促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［13］；circFAM73A調(diào)控miR-490-3p/HMGA2增強(qiáng)胃癌細(xì)胞干性［14］。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)HMGA2可以逆轉(zhuǎn)si-circ_0092315對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖和侵襲能力的抑制作用，提示HMGA2參與circ_0092315對(duì)TPC-1細(xì)胞的促增殖和侵襲作用。

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circ_0092315在人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中呈高表達(dá)，通過(guò)內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA機(jī)制調(diào)控miR-1256/HMGA2通路，促進(jìn)TPC-1細(xì)胞的增殖和侵襲能力。但本研究缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證；此外，miR-1256/HMGA2下游的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2022-04-01）