高擎 吳志遠 李海洋 李擁軍

摘要：目的 探索單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）在多發(fā)性大動脈炎（TA）腎動脈病變中的初步應用。方法 納入2例北京醫(yī)院血管外科進行腎動脈手術搭橋治療的TA患者，將其腎動脈組織樣本分別采用GEXSCOPE試劑盒和自配消化液2種酶解方式，并進行scRNA-seq和生物信息學分析。結果 共獲取2920個細胞納入下游分析。經過無偏聚類分析后，確定2種內皮細胞、2種平滑肌細胞、1種成纖維細胞、2種單核巨噬細胞、1種T細胞及1種未定義的細胞。其中，2種平滑肌細胞主要表現(xiàn)為收縮型及分泌型。scRNA-seq分析結果顯示試劑盒酶解法獲取的細胞以內皮細胞（57.46%）為主，免疫細胞（13.21%）較少，而自配消化液酶解法獲取的細胞以免疫細胞（34.64%）為主。結論 scRNA-seq可用于區(qū)分TA患者病變血管的細胞異質性，不同酶解方式會影響獲取細胞的種類與數(shù)量。

關鍵詞：大動脈炎；單細胞測序；細胞異質性；內皮細胞；平滑肌細胞

中圖分類號： R654.3? 文獻標志碼： A? 文章編號：1000-503X（2023）01-0080-08

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15006

Preliminary Results of Single-cell Transcriptome Sequencing in Renal Arterial Lesions of Takayasu Arteritis

GAO Qing1，WU Zhiyuan2，LI Haiyang，LI Yongjun2

1Department of Cardiovascular Surgery，Beijing Anzhen Hospital，Capital Medical University，Beijing 100029，China

2Department of Vascular Surgery，Beijing Hospital，Beijing 100730，China

Corresponding author：LI Yongjun Tel：010-85132266，E-mail：liyongjun4679@bjmoh.cn

ABSTRACT：Objective To explore the preliminary application of single-cell RNA sequencing （scRNA-seq） in the renal arterial lesions in Takayasu arteritis （TA） patients.Methods This study included 2 TA patients with renal artery stenosis treated by bypass surgery in the Department of Vascular Surgery，Beijing Hospital.The obtained 2 renal artery samples were digested with two different protocols （GEXSCOPE kit and self-made digestion liquid） before scRNA-seq and bioinformatics analysis.Results A total of 2920 cells were obtained for further analysis.After unbiased cluster analysis，2 endothelial cell subsets，2 smooth muscle cell subsets，1 fibroblast subset，2 mononuclear macrophage subsets，1 T cell subset，and 1 undefined cell subset were identified.Among them，the two subsets of smooth muscle cells were contractile and secretory，respectively.The results of scRNA-seq indicated that enzymatic hydrolysis with GEXSCOPE kit produced a large number of endothelial cells （57.46%） and a small number of immune cells （13.21%）.However，immune cells （34.64%） were dominant in the cells obtained by enzymatic hydrolysis with self-made digestive liquid.Conclusion scRNA-seq can be employed to explore the cellular heterogeneity of diseased vessels in TA patients.Different enzymatic digestion protocols may impact the proportion of different cells.

Key words：Takayasu arteritis；single-cell RNA sequencing；cellular heterogeneity；endothelial cell；smooth muscle cell

Acta Acad Med Sin，2023，45（1）：80-87

多發(fā)性大動脈炎（Takayasu arteritis，TA）是一種流行于東亞的具有高度特異性的自身免疫性血管炎性疾病，主要累及主動脈及其一級分支［1］。TA患者早期幾乎無特定的癥狀或體征，通常以全身性癥狀為主，常需借助影像學檢查發(fā)現(xiàn)或診斷，中晚期病變可引起血管狹窄造成嚴重的器官缺血甚至壞死，導致腦梗死或心肌梗死等［2］。前期大量研究發(fā)現(xiàn)TA是一種涉及CD4+ T細胞、樹突樣細胞（dendritic cell，DC）、白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）信號通路和巨噬細胞浸潤的自身免疫?。?-5］。未知抗原通過DC表面特異性受體激活這一類抗原提呈細胞［6］，分泌多種炎癥因子，促進CD4+ T細胞分化為Th17細胞，誘導IL-17、IL-21、IL-22的產生參與下游的細胞毒性反應［7］。然而，由于該病具體發(fā)病機制不明，目前多采用免疫抑制劑或生物制劑等藥物治療。單細胞RNA測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技術作為一種新的功能強大的高通量測序技術，可通過分析其捕獲的單個細胞的轉錄組，獲取更加詳細的細胞信息，進而對比不同狀態(tài)下細胞的異質性［8］。scRNA-seq技術在頸動脈斑塊［9］、腹主動脈瘤［10］等血管外科疾病中已經得到廣泛應用。本團隊前期采用scRNA-seq技術初步探索了TA患者與健康人群外周血炎癥細胞的占比差異，結果發(fā)現(xiàn)TA患者CD14+單核細胞比例顯著增加［11］。但是目前關于scRNA-seq技術應用于TA血管壁組織的研究報道較少，不同酶解方式獲取的細胞種類亦有不同。因此，本研究旨在探索scRNA-seq在TA腎動脈病變中的初步應用，同時為TA的后期多樣本單細胞研究提供實驗基礎。

對象和方法

對象 2019年10月至2020年2月北京醫(yī)院血管外科收治的2例女性TA患者?；颊叩捏w征、血清學及影像學檢查結果均符合1990年美國風濕病協(xié)會關于TA的診斷標準［12］。本研究通過北京醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批編號：2018BJYYEC-030001），2例患者均簽署知情同意書。

酶解方法 采用2種不同的酶解方法處理TA患者的腎動脈樣本，其中，TAKA-R1樣本采用GEXSCOPE試劑盒（Singleron Biotechnologies公司，中國香港）酶解法，TAKA-R2采用本中心配制的纖維蛋白酶+透明質酸酶+DNA酶的復合消化液（自配消化液）酶解法，相關酶配制方案正在申請專利中。

scRNA-seq技術 將單細胞懸液加載到微流控芯片上，使用GEXSCOPE單細胞RNA文庫試劑盒（Singleron Biotechnologies公司，中國香港）根據Singleron GEXSCOPE操作說明書構建scRNA-seq文庫。將文庫稀釋至4 nmol/L，使用Illumina Novaseq 6000測序平臺進行測序，測序模式為150 bp雙端測序。

數(shù)據質量控制、處理和分析 采用R studio（Version 1.4.1717）中的Seurat進行單細胞表達矩陣的質量控制、前期處理和數(shù)據分析。每個Seurat對象都是用在3個以上細胞中表達的基因創(chuàng)建的。其他質量控制條件設置為：（1）每個細胞內所包含的mRNA種類應在200至3000之間；（2）每個細胞內所包含的粒體基因占全部mRNA的比值應小于25%。經過質量控制后，最終獲取2920個細胞。使用CellCycleScoring函數(shù)計算細胞周期階段評分。采用SCTransform來減少潛在的批次效應或技術變化。主成分分析設置在1∶20，然后進行無監(jiān)督的細胞聚類。利用FindAllMarkers及其默認參數(shù)用于獲取每個簇中特定的差異表達基因，然后選擇代表性標記（具有高avg_logFC和調整P<0.05的基因）進行簇標記。內皮細胞與血管平滑肌細胞各自不同亞群之間的差異表達基因采用FindMarkers進行判定，并將調整P<0.05的基因用于京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG）通路分析。

結? 果

一般情況 共納入2例行腎動脈重建術的TA患者。2例患者均接受過藥物治療，但病情仍未控制，影像學檢查提示腎動脈嚴重狹窄，故行腎動脈搭橋手術，并留取腎動脈樣本。

TA腎動脈組織的scRNA-seq及無偏聚類分析 TA腎動脈組織樣本經scRNA-seq測序后，共有2920個細胞用于下游數(shù)據分析，其中1476個細胞來源于TAKA-R1樣本，1444個細胞來源于TAKA-R2樣本。無偏聚類分析共獲取2種內皮細胞（endothelial cell，EC）、2種血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）、1種成纖維細胞、2種單核巨噬細胞、1種T細胞及1種未定義的細胞（圖1A）。2個樣本的分布范圍基本相同，但不同區(qū)域的分布密度不同（圖1B）。EC的代表性基因為ACKR1、VWF、PECAM1等（圖1C）。

TA腎動脈組織的EC與VSMC的細胞異質性 根據不同基因在各細胞亞群的表達情況繪制點圖，包括EC-1（ADAMTS1、CSF3、STC1）、EC-2（RAMP2、IFI27、FABP4）、VSMC-1（C11orf96、SORBS2、MYL9）、VSMC-2（MYH10、FN1、POSTN）、成纖維細胞（CFD、FBLN1、DCN）、單核巨噬細胞1（S100A9、S100A12、LYZ），單核巨噬細胞2（HLA-DPA1、C1QC、C1QB），T細胞（CCL5、IL7R、CD69），未定義的細胞（TAOK1、LINC01681、SPATA22）（圖2）。EC分為2種細胞亞群，其中，EC-1（n=64）主要高表達ACKR1、ADAMTS4、ICAM1、VWF、IL6基因，EC-2（n=75）主要高表達CD36、FABP4、ICAM2、CLDN5、TIMP3基因（圖3）；KEGG通路分析顯示，EC-1細胞主要參與IL-17、腫瘤壞死因子、核因子κB等信號通路，而EC-2細胞則主要分泌細胞黏附分子等（圖4）。VSMC分為2種細胞亞群，其中，VSMC-1（n=24）呈現(xiàn)經典的收縮型，VSMC-2（n=86）則表達更多與纖連蛋白和膠原相關的基因如FN1、COL1A1、COL3A1等（圖5），且表達的一些基因參與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、晚期糖基化終末產物（受體）等信號通路（圖6）。

不同酶解方式對細胞類型的影響 GEXSCOPE試劑盒酶解方式獲取的細胞以EC（57.4%）為主，其次為VSMC（16.5%）和免疫細胞（單核巨噬細胞和T細胞）（13.3%）。自配消化液酶解方式獲取的細胞則以免疫細胞（單核巨噬細胞和T細胞）（34.6%）為主，其次為成纖維細胞（29.7%）和EC（27.1%）（表1）。

討? 論

TA作為一種自身免疫性疾病，其發(fā)病機制并不明確。目前TA的臨床治療主要是以藥物治療為主，但仍有近20%的患者病情會進展并需采用外科干預［13-14］，以改善器官缺血或者腎血管性高血壓。在藥物治療方面，主要以激素和免疫抑制劑為主，尚無特異性針對TA的藥物［15］。盡管前期已有部分研究采用一些生物制劑治療TA［16-17］，但效果并不十分滿意。因此，對TA發(fā)病機制進行深入探究并為臨床藥物開發(fā)提供一定的依據仍是現(xiàn)階段的研究重點。

本團隊前期采用scRNA-seq技術對TA患者外周血進行分析發(fā)現(xiàn)，CD14+單核巨噬細胞的占比較正常人明顯升高［11］，同時與氧化應激密切相關的TXNIP、RAGE等基因通路的表達也有所升高，提示單核巨噬細胞所參與的氧化應激反應可能與TA發(fā)病相關。在TA患者動脈組織研究方面，Hadjadj等［18］發(fā)現(xiàn)TA患者的血清抗體可以通過激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路刺激血管EC增殖。Dos等［19］發(fā)現(xiàn)在TA患者病變血管壁中，巨噬細胞的數(shù)量遠高于B細胞、T細胞及NK細胞。Chen等［20］在IL-6的誘導實驗中證實，TA患者的成纖維細胞在IL-6的作用下可以激活Janus激酶通路，促進纖維蛋白的合成。

scRNA-seq作為一種新型轉錄組測序方法，可用以分析TA患者血管壁的細胞異質性，并發(fā)現(xiàn)各種細胞類型潛在的功能與作用［8］，為探索TA發(fā)病機制提供有利的線索。目前，scRNA-seq技術應用于TA動脈組織的研究報道較少。本研究嘗試采用兩種酶解方法探索EC與VSMC的細胞異質性。有研究表明EC參與了TA的進展，如EC增殖及自身抗原等。Inder等［21］通過病理染色發(fā)現(xiàn)TA患者病變血管上EC發(fā)生增殖。Mutoh等［22］在TA患者EC細胞膜表面發(fā)現(xiàn)了內皮蛋白C受體和B類 Ⅰ 型清道夫受體2種自身抗原，并在患者血清中發(fā)現(xiàn)可以結合這2種抗原的自身抗體，此外，進一步研究結果顯示抗原抗體結合可促進T細胞的分化。本研究中EC-1表達大量的炎癥因子（IL-6，ICAM1），同時高表達IL-17，腫瘤壞死因子，晚期糖基化終產物及其受體信號通路；EC-2高表達ICAM2，TIMP3和白細胞跨膜通路，提示EC在TA疾病進展中可能發(fā)揮著關鍵作用。

VSMC的表型轉換過程在血管疾病中發(fā)揮著重要作用［23］，已有病例報告提出VSMC的凋亡可能參與TA的進展［24］，也有研究顯示VSMC增殖也促進TA炎癥反應［25］，但相關機制未明。本研究中發(fā)現(xiàn)2種VSMC細胞亞群，其中VSMC-1為經典的收縮型VSMC，主要高表達ACTA2、MYH11基因等；而VSMC-2則高表達FN1、COL3A1、COL1A1基因等，主要編碼纖連蛋白和膠原相關的成分。盡管本研究中獲取的VSMC數(shù)量較少，但VSMC異質性的結果仍提示在TA進展過程中VSMC-2也許發(fā)揮著更重要的作用，但尚需進一步的實驗驗證。

酶解消化是單細胞測序技術的首要操作步驟，但是由于血管壁結構細胞及免疫細胞對不同酶的反應性與耐受性不同，因此，根據不同的研究目的，需要將消化酶的種類、濃度及消化時間等因素進行綜合考慮，選擇適合的酶解方案，以獲得理想的消化效果。近期一項在人腹主動脈瘤的scRNA-seq研究中，美國密歇根大學Gallagher教授團隊針對腹主動脈瘤血管壁的酶解方案結果可獲取較多的免疫細胞，而結構細胞如EC、VSMC等較少［26］。本研究中采用的2種酶解方法初步結果顯示，TAKA-R1樣本（GEXSCOPE試劑盒酶解法）中以結構細胞（包括EC和VSMC）為主，免疫細胞占比較低，而TAKA-R2樣本（自配消化液酶解法）中免疫細胞占比明顯升高，說明GEXSCOPE試劑盒酶解法更適合結構細胞的功能研究，而自配消化液酶解法更適合免疫細胞的功能研究。

本研究存在以下局限性：（1）樣本數(shù)量少，可能出現(xiàn)個體樣本差異性誤差；（2）樣本體積小，由于手術術式的限制，所獲取的樣本體積較小。

綜上，本研究結果表明，scRNA-seq揭示了TA患者腎動脈組織的細胞異質性，EC及VSMC在TA疾病發(fā)展過程中可能發(fā)揮了重要作用。同時，不同酶解方式可能會造成最后獲取細胞的種類與數(shù)量的不同，因此需結合研究目的，選擇適宜的酶解方案。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2022-03-23）