王玉玲 倪琳琳 趙良倩

1.山東省臨沂市中醫(yī)醫(yī)院婦科，山東臨沂 276002；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖科，山東濟(jì)南 250014

隨著人們生活水平的提高，代謝相關(guān)疾病發(fā)病率不斷增加，糖耐量減低（impaired glucose tolerance，IGT）和非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率也在日益增長(zhǎng)，有數(shù)據(jù)顯示目前全球NAFLD發(fā)病率為25.24%，亞洲為27.37%[1]，糖尿病人群中NAFLD的患病率為76%[2]。IGT作為糖尿病的前期階段也是NAFLD的高危因素。有研究表明人群由IGT向2型糖尿病進(jìn)展過(guò)程中脂肪肝的患病率也逐漸升高，并且程度逐漸加重[3]。在IGT合并NAFLD階段及時(shí)干預(yù)可以降低糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及NAFLD進(jìn)一步向肝纖維化發(fā)展。目前大部分觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為NAFLD發(fā)病[4]：一是胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致肝脂肪的變性；二是氧化應(yīng)激反應(yīng)引起肝細(xì)胞產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化及激活炎性細(xì)胞因子導(dǎo)致脂肪性的肝炎。炎癥反應(yīng)是NAFLD發(fā)展中非常重要的一環(huán)[5]。脂質(zhì)肝臟異常堆積使肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞死亡激活內(nèi)皮細(xì)胞使細(xì)胞因子表達(dá)增加，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和肝臟纖維化，促進(jìn)了NAFLD的進(jìn)展[6]。本研究通過(guò)觀(guān)察糖異平對(duì)IGT合并NAFLD模型大鼠糖脂代謝及炎癥因子和氧化應(yīng)激水平的影響，探討糖異平治療IGT合并NAFLD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只，許可證號(hào)SYXK（魯）2022 0009，體重150～180 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本研究經(jīng)臨沂市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)ADL公司）。大鼠灌胃器、手術(shù)器械、5 ml與l ml注射器、ELx800酶標(biāo)儀、BP310S電子天平、WKYin微量移液器、高速低溫離心機(jī)3K-30、超低溫冰箱725、強(qiáng)生ONETOUCHHorizon型血糖儀、OLYMPUS AU2700全自動(dòng)血生化儀（日本OLYMPUS公司）。高糖高脂飼料（10.0%豬油、20.0%蔗糖、10.0%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉和59.5%常規(guī)飼料）定購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。糖異平（生黃芪30 g、玄參15 g、柴胡9 g、黃連9 g、白芍15 g、蒼術(shù)12 g、川牛膝12 g、丹參15 g）。所用藥物購(gòu)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，所有中藥冷水泡30 min，兩煎相兌后濃縮至1 g/ml（生藥量）。

1.2 動(dòng)物造模及給藥

1.2.1 動(dòng)物分組喂養(yǎng) Wistar大鼠40只，雌雄分別20只，喂養(yǎng)7 d后，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=10）及實(shí)驗(yàn)組（n=30）。其中對(duì)照組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)期大鼠都自由喝水，每只大鼠均每天早晚分別喂養(yǎng)1次，每天所喂食量均為其體重的3%。

1.2.2 IGT合并NAFLD大鼠模型建立 大鼠共被喂養(yǎng)8周，并被禁食12 h后，自鼠尾采血測(cè)空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）；再依據(jù)大鼠體重（2 g/kg）分別給予50%濃度的高濃度葡萄糖注射液灌胃，2 h后再次自鼠尾采血測(cè)餐后2 h血糖（2 h postprandial blood glucose，2 hPG）。FPG＜7 mmol/L且7.8 mmol/L≤2 hPG＜11.1 mmol/L表示IGT大鼠造模成功；實(shí)驗(yàn)組則按照隨機(jī)原則選取2只大鼠處死，并分別取大鼠肝臟常規(guī)病理切片后再行HE染色，光鏡下若發(fā)現(xiàn)空泡樣變性的肝細(xì)胞表示NAFLD大鼠造模成功，將IGT合并NAFLD建模[7]成功大鼠納入本研究。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥劑量 選取實(shí)驗(yàn)組中20只造膜成功的大鼠，隨機(jī)分為模型組和治療組，每組各10只。模型組與治療組均予以高糖、高脂飲食，對(duì)照組予以常規(guī)飲食。給藥量按照“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量”計(jì)算而得，治療組予以中藥水煎劑12.19 g/（kg·d）灌胃，每天1次；模型組和對(duì)照組均給予等量生理鹽水灌胃。干預(yù)4周。

1.3 標(biāo)本采集

末次給藥后禁食不禁水18 h，麻醉后腹主動(dòng)脈取血，3000 r/min離心15 min，分離血清。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

①一般情況：分別觀(guān)察大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、食欲、毛色及大小便等情況。②血糖（FPG、2 hPG）水平：大鼠禁食12 h后，經(jīng)鼠尾采血測(cè)血糖（FPG、2 hPG）水平。③血脂水平：用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）及 高 密 度 脂 蛋 白（high-density lipoprotein，HDL）的 水 平。④炎 癥 因 子：IL-6、TNF-α及IL-1β水平依照試劑盒操作書(shū)步驟進(jìn)行檢測(cè)。⑤氧化應(yīng)激指標(biāo)：丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）以及谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平依照試劑盒操作書(shū)步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀(guān)察

對(duì)照組大鼠正常喂養(yǎng)，皮毛光澤鮮亮，反應(yīng)機(jī)敏；模型組大鼠高糖高脂飲食，精神不振，反應(yīng)遲滯，皮毛雜亂稀少，體重明顯增加；治療組大鼠較模型組癥狀輕，精神狀態(tài)一般，反應(yīng)較模型組大鼠靈敏，皮毛柔順。觀(guān)察期間無(wú)大鼠死亡。

2.2 各組大鼠治療前后FBG、2 hPG水平比較

治療前，與對(duì)照組比較，模型組FBG（t=1.427，P=0.035）、2 hPG（t=3.638，P=0.028）和治療組FBG（t=1.326，P=0.046）、2 hPG（t=4.783，P=0.038）水平均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；同模型組比 較，治 療 組FBG（t=-1.578，P=0.225）、2 hPG（t=-3.108，P=0.135）水平均較低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠治療前FBG、2 hBG比較（mmol/L， ± s）

表1 各組大鼠治療前FBG、2 hBG比較（mmol/L， ± s）

注 與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；FBG：空腹血糖；2 hPG：餐后2 h血糖

組別 n FBG 2 hPG對(duì)照組 10 4.26±0.32 6.64±0.45模型組 10 4.43±0.14a 9.15±0.61a治療組 10 4.42±0.64a 8.91±0.97a

各組大鼠在藥物干預(yù)4周后，與對(duì)照組比較，模 型 組FBG（t=2.213，P=0.032）、2 hPG（t=2.940，P=0.023）和治療組FBG（t=1.727，P=0.002）、2 hPG（t=2.681，P=0.038）水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），提示大鼠存在糖代謝紊亂；同模型組比較，治療組FBG（t= -1.928，P=0.002）、2 hPG（t=-2.263，P=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），表示糖異平可以有效改善模型大鼠的血糖，糾正代謝紊亂。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠治療后FBG、2 hBG比較（mmol/L， ± s）

表2 各組大鼠治療后FBG、2 hBG比較（mmol/L， ± s）

注 與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與模型組比較，bP ＜ 0.05；FBG：空腹血糖；2 hPG：餐后2 h血糖

組別 n FBG 2 hPG對(duì)照組 10 4.08±0.52 6.64±0.45模型組 10 4.12±0.56a 8.90±0.65a治療組 10 4.11±0.39ab 7.10±0.68ab

2.3 各組大鼠治療后TG、TC、LDL、HDL水平比較

各組大鼠在藥物干預(yù)4周后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠TG（t=6.542，P=0.028）、TC（t=4.286，P=0.045）、LDL（t=1.010，P=0.042）水平均升高，差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（P＜ 0.05）；HDL（t=-2.241，P=0.130）水平降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。與對(duì)照組比較，治療組大鼠TG（t=-7.917，P=0.009）、TC（t=-4.130，P=0.028）、LDL（t=-5.110，P=0.043）水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；HDL（t=1.950，P=0.897）水平升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。與模型組比較，治療組大鼠TG（t=-4.501，P=0.016）、TC（t=-3.593，P=0.004）水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；LDL（t=-4.236，P=0.523）水平降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；HDL（t=14.230，P=0.032）水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。提示糖異平能有效降低血脂。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠治療后TG、TC、LDL、HDL水平比較（mmol/L， ± s）

表3 各組大鼠治療后TG、TC、LDL、HDL水平比較（mmol/L， ± s）

注 與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與模型組比較，bP ＜ 0.05；TC：總膽固醇；TG；三酰甘油；LDL：低密度脂蛋白；HDL：高密度脂蛋白

組別 n TG TC LDL HDL對(duì)照組 10 0.43±0.05 1.27±0.12 0.19±0.03 0.61±0.01模型組 10 0.65±0.04a 1.48±0.23a 0.23±0.02a 0.59±0.13治療組 10 0.41±0.05ab 1.24±0.16ab 0.16±0.01a 0.67±0.14b

2.4 各組大鼠治療后血清炎癥因子比較

各組大鼠在藥物干預(yù)4周后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠的血清炎癥因子IL-6（t=0.238，P=0.026）、IL-1β（t=2.602，P=0.034）、TNF-α（t=0.890，P=0.023）和 治 療 組IL-6（t=0.669，P=0.041）、IL-1β（t=1.155，P=0.045）、TNF-α（t=0.176，P=0.039）水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；同模型組比較，治療組大鼠血清炎癥因子IL-6（t=-2.027，P=0.012）、IL-1β（t=-1.791，P=0.048）、TNF-α（t=-0.922，P=0.026）水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)表4。提示糖異平方能使機(jī)體的炎癥反應(yīng)有效降低。對(duì)照組 10 43.64±5.05 10.72±1.21 25.58±2.16模型組 10 95.21±9.05a24.62±1.24a79.23±5.02a治療組 10 54.06±4.78ab12.53±1.76ab37.76±3.36ab

表4 各組大鼠治療后血清炎癥因子比較（pg/ml， ± s）

表4 各組大鼠治療后血清炎癥因子比較（pg/ml， ± s）

組別 n IL-6 IL-1β TNF-α

2.5 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

各組大鼠在藥物干預(yù)4周后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD（t=-1.103，P=0.046）、MDA（t=-1.024，P=0.031）、GSH（t=-2.901，P=0.034）和 治 療 組SOD（t=-1.719，P=0.045）、GSH（t=-3.962，P=0.042）水平均降低，MDA（t=-2.190，P=0.044）水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；同模型組比較，治療組氧化應(yīng)激 指 標(biāo)SOD（t=1.236，P=0.004）、GSH（t=1.045，P=0.008）水平均升高，MDA（t=3.854，P=0.030）水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)表5。提示糖異平方能有效改善機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

表5 各組大鼠治療后之氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（mmol/ml， ± s）

表5 各組大鼠治療后之氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（mmol/ml， ± s）

注 與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與模型組比較，bP ＜ 0.05；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；GSH：谷胱甘肽

組別 n SOD MDA GSH對(duì)照組 10 173.64±5.05 2.52±0.21 4.58±0.56模型組 10 155.21±9.05a 5.62±0.24a 2.23±0.32a治療組 10 170.06±4.78ab 3.23±0.76ab 3.89±0.56ab

2.6 大鼠肝臟組織病理情況

光鏡下可見(jiàn)對(duì)照組之大鼠肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)規(guī)則，肝索呈放射性分布，小葉邊界清晰，外觀(guān)肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核明顯，可見(jiàn)胞質(zhì)均勻，未見(jiàn)沉積的脂滴，未發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞。模型組的大鼠肝臟肝索排列不規(guī)則，肝細(xì)胞腫大，許多大小不等的脂肪空泡可見(jiàn)，邊界欠清晰，可見(jiàn)浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞。糖異平治療組的大鼠肝細(xì)胞鏡下見(jiàn)相對(duì)規(guī)整，排列尚規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)少量脂肪空泡可見(jiàn)，未看見(jiàn)壞死的肝細(xì)胞。提示糖異平能有效降低脂質(zhì)在肝臟的堆積，并能使炎癥反應(yīng)減輕，減輕肝臟脂肪變性，對(duì)IGT合并NAFLD的肝臟起到良好的保護(hù)。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠肝臟組織病理情況（HE染色，40×）

3 討論

IGT指空腹血糖正常但餐后血糖水平介于正常血糖水平和糖尿病血糖水平之間的一種特殊類(lèi)型代謝狀態(tài)。IGT患者是目前重要的糖尿病高危人群，每年有大量IGT患者進(jìn)展為糖尿病。據(jù)報(bào)告，我國(guó)每年有1.5%～10%的IGT患者進(jìn)展為2型糖尿病[8]。IGT患者中NAFLD發(fā)病率高于普通人群，IGT患者高血糖導(dǎo)致體內(nèi)糖分解受阻，脂肪組織代謝增強(qiáng)，使得血漿內(nèi)游離脂肪酸水平明顯升高，游離脂肪酸可通過(guò)增加胰島素分泌來(lái)誘胰島素抵抗（insulin resistance，IR）。NAFLD發(fā)病機(jī)制目前尚無(wú)明確定論，現(xiàn)被廣泛認(rèn)為的是經(jīng)典（二次打擊）學(xué)說(shuō)[9]，認(rèn)為“第一次打擊”是因?yàn)橐葝u素抵抗引起肝細(xì)胞內(nèi)的TG合成與轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)紊亂而導(dǎo)致脂質(zhì)沉積，引起單純的脂肪變性；“第二次打擊”是在“第一次打擊”后，肝細(xì)胞受到活性氧（reactive oxygen species，ROS）的誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)甚至壞死，繼而引起肝硬化的發(fā)生和發(fā)展，炎癥因子在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用[10]。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）作為一種誘導(dǎo)性核轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)受到外界刺激時(shí)可被激活，進(jìn)入細(xì)胞核參與炎癥反應(yīng)[11]。NF-κB活化后，可增加炎癥因子IL-6、TNF-α的產(chǎn)生和釋放，進(jìn)而再次激活NF-κB，從而導(dǎo)致最初的炎癥信號(hào)進(jìn)一步放大[12]。MDA是細(xì)胞氧化代謝產(chǎn)物，其可反映機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化物破壞程度，SOD、GSH兩者均為重要的內(nèi)源性的氧自由基清除劑，可對(duì)抗氧自由基，從而防止其對(duì)機(jī)體組織細(xì)胞的破壞[13-14]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)IGT合并NAFLD的治療目前主要是通過(guò)生活方式控制、改善胰島素抵抗及應(yīng)用降脂藥物等對(duì)癥處理為主。IGT合并NAFLD作為一個(gè)病程中的可逆階段積極治療預(yù)后良好，如果疏于管理則可能進(jìn)一步發(fā)展為糖尿病或肝硬化。中藥治療IGT合并NAFLD經(jīng)臨床觀(guān)察效果滿(mǎn)意且安全無(wú)副作用。糖異平前期臨床研究表明可有效降低IGT患者餐后血糖，改善臨床癥狀，降低炎癥因子，治療IGT安全有效[15]。本研究通過(guò)高脂高糖飼料造成大鼠IGT合并NAFLD模型，糖異平灌胃4周后觀(guān)察糖異平對(duì)IGT合并NAFLD大鼠糖脂代謝及炎癥因子的影響。結(jié)果顯示與模型組相比糖異平組2 hPG降低，糖異平組TG、TC與模型組比較明顯降低，HDL明顯升高，LDL有降低趨勢(shì)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后模型動(dòng)物血清中IL-6、TNF-α、IL-1β的含量均高于對(duì)照組。治療組IL-6、IL-1β和TNF-α的含量均低于模型組。提示糖方平可有效抑制IGT合并NAFLD大鼠模型的炎癥反應(yīng)。提示糖異平通過(guò)對(duì)2型糖尿病并發(fā)NAFLD具有降低血糖血脂的作用，同時(shí)可以通過(guò)改善炎癥因子的表達(dá)以及改善氧化應(yīng)激狀態(tài)來(lái)起到對(duì)IGT合并NAFLD的治療作用。