王壽富 黎桃敏 張?zhí)m蘭 鐘志奎 施文婷 劉權(quán)震 魏 梅

廣東一方制藥有限公司廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東佛山 528244

丹參主產(chǎn)地為河北、陜西、山東等，其基源是唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhizaBge.），取其干燥根和根莖入藥，其味苦，性微寒，可具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛等，常用于胸痹心痛、痛經(jīng)經(jīng)閉等病癥[1-2]。丹參是我國常用的大宗藥材，其發(fā)揮主要藥效的關(guān)鍵成分為丹參所富含水溶性的酚酸類以及脂溶性的丹參酮類化合物，對血液及心血管系統(tǒng)有抗心律失常、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抑制心肌纖維化等作用[2-5]。

2021年發(fā)布的《關(guān)于結(jié)束中藥配方顆粒試點(diǎn)工作的公告》（2021年第22號）明確將中藥配方顆粒的質(zhì)量監(jiān)管納入中藥飲片管理范疇，凸顯了中藥飲片的主體性，也表明在臨床應(yīng)用上中藥配方顆粒是中藥飲片的補(bǔ)充[6]。本研究利用HPLC法測定丹參飲片、水煎液、配方顆粒的指紋圖譜[7]，對丹參飲片到水煎液再到配方顆粒制備全過程的質(zhì)量相關(guān)性進(jìn)行探究，以期為丹參配方顆粒的生產(chǎn)全過程質(zhì)量控制和生產(chǎn)試驗(yàn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

試驗(yàn)用儀器見表1。

表1 試驗(yàn)所用儀器明細(xì)

1.2 試藥

試驗(yàn)用試藥見表2，其中17批丹參藥材均為正品，可供本試驗(yàn)研究使用，藥材鑒定員為廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師；對應(yīng)的飲片（編號Y1～Y17）、水煎液（編號S1～S17）和配方顆粒（編號K1～K17）均按照相關(guān)要求規(guī)定的方法制備而來。

表2 試驗(yàn)所用試藥明細(xì)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[8]

采用Waters Xselect HSS T3色譜柱（柱長250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5.0 μm）；采用雙相流動(dòng)相系統(tǒng)按表3進(jìn)行梯度洗脫；體積流量為1.0 ml/min；檢測波長為286 nm，進(jìn)樣量為10 μl。

表3 梯度洗脫表

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備[8]

精密稱取各對照品適量，加入甲醇水溶液（甲醇體積占比為80%）制成含丹參素19.992 μg/ml、原兒茶醛18.426 μg/ml、咖啡酸18.943 μg/ml、丹酚酸E 21.462 μg/ml、迷迭香酸21.288 μg/ml、紫草酸143.374 μg/ml和丹酚酸B 103.169 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 供試液的制備

2.3.1 丹參飲片供試液[8]取丹參飲片進(jìn)行粉碎處理，粉末過三號篩，取過篩后粉末約0.2 g，精密稱定，加甲醇水溶液（甲醇體積占比為80%）50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率為140 W、頻率為42 kHz）30 min，取出，靜置至樣品冷卻至室溫，再次稱定重量，用甲醇水溶液（甲醇體積占比為80%）補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過0.22 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得丹參飲片供試液。

2.3.2 丹參水煎液供試液[8]精密吸取丹參水煎液10 ml，再加甲醇溶液40 ml，照“2.3.1”項(xiàng)下制備方法，自“密塞，稱定重量”起，同法制備，即得水煎液供試液。

2.3.3 丹參配方顆粒供試液[8]取丹參配方顆粒約0.2 g，研細(xì)，精密稱定，按照“2.3.1”項(xiàng)下制備方法，自“加甲醇水溶液（甲醇體積占比為80%）50 ml”起，同法制備，即得配方顆粒供試液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn)[9]取空白溶劑、混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品供試液適量，依法測定，記錄譜圖，見圖1。在相應(yīng)的保留時(shí)間處，樣品供試液與混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜均被洗脫出相同的色譜峰，且空白溶劑對各成分的出峰無干擾，表明該方法具有良好的專屬性。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC色譜堆疊圖

2.4.2 精密度試驗(yàn)[10]取“2.2”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測定，計(jì)算得各特征峰峰面積的RSD值均＜3%，表明試驗(yàn)所用儀器具有良好的精密度。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)[11]按“2.3”項(xiàng)下方法，取同一份配方顆粒制備6份樣品供試液，依法測定，計(jì)算得各特征峰峰面積的RSD值均＜3%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)[12]按“2.3”項(xiàng)下方法制備丹參配方顆粒供試液，分別在得到樣品供試液的第0、2、4、8、12、24 h依法測定，計(jì)算得各特征峰峰面積的RSD值均＜3%，表明樣品供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定可測。

2.5 HPLC指紋圖譜的確立與相似度評價(jià)

2.5.1 指紋圖譜的確立[13]中藥指紋圖譜所包含的化學(xué)信息更加全面，更能準(zhǔn)確反映中藥內(nèi)在質(zhì)量[14]。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）和Origin 2018軟件，將采集到的丹參飲片、丹參水煎液及丹參配方顆粒的指紋圖譜進(jìn)行疊加，形成共有模式，并建立對照指紋圖譜R1、R2、R3，見圖2～4。17批丹參飲片、水煎液及配方顆粒的指紋圖譜均標(biāo)記出8個(gè)共有特征峰，通過與對照品圖譜比對，確定1號峰為丹參素、2號峰為原兒茶醛、3號峰為咖啡酸、4號峰為丹酚酸E、5號峰為迷迭香酸、6號峰為紫草酸、7號峰為丹酚酸B。

圖2 17批丹參飲片的HPLC指紋圖譜

圖3 17批丹參水煎液的HPLC指紋圖譜

圖4 17批丹參配方顆粒的HPLC指紋圖譜

2.5.2 相似度評價(jià)[13]采用多點(diǎn)校正法和Mark峰匹配，分別計(jì)算各批次飲片、水煎液、配方顆粒HPLC指紋圖譜與其對照指紋圖譜的相似度。結(jié)果見表4，17批丹參飲片、水煎液、配方顆粒指紋圖譜與其對照指紋圖譜的相似度及丹參飲片-水煎液、飲片-配方顆粒、水煎液-配方顆粒間的相似度均大于0.990，表明不同批次丹參飲片、水煎液、配方顆粒的化學(xué)成分較為一致、質(zhì)量較為穩(wěn)定，丹參飲片到水煎液再到配方顆粒的生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，主要化學(xué)成分無丟失。

表4 丹參飲片、水煎液及其配方顆粒HPLC指紋圖譜相似度評價(jià)結(jié)果

2.6 化學(xué)模式識別

化學(xué)模式識別作為一種統(tǒng)計(jì)分析手段，是化學(xué)計(jì)量學(xué)的重要組成部分，可以將原始數(shù)據(jù)集中差異性信息提取并分類[15-17]，如聚類分析法、主成分分析法、偏最小二乘法等是化學(xué)模式識別中較為常見的集中分析方法，在中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)分析中得到了較為廣泛的應(yīng)用[15-16]。

2.6.1 Pearson相關(guān)性分析[7]以17批丹參飲片、水煎液、配方顆粒共51個(gè)樣品“各特征峰峰面積與特征峰總面積的比值”為變量，通過SPSS 20.0軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果詳見表5。丹參飲片與水煎液相比較，有4個(gè)共有特征峰呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)性；丹參飲片與配方顆粒相比較，有4個(gè)共有特征峰呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)性，1個(gè)共有特征峰呈顯著正相關(guān)性；丹參水煎液與配方顆粒比較，8個(gè)共有峰均具有極顯著的正相關(guān)性，說明丹參配方顆粒與水煎液之間可以進(jìn)行較穩(wěn)定的質(zhì)量傳遞。

表5 丹參HPLC指紋圖譜共有峰的相關(guān)性分析結(jié)果（r值）

2.6.2 聚類分析[18]以8個(gè)共有特征峰的“各特征峰峰面積與特征峰總面積的比值”為變量，利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對17批丹參飲片、水煎液、配方顆粒進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖5，當(dāng)平方Euclidean距離為15時(shí)，除Y4外，其余飲片單獨(dú)聚為一類，水煎液和配方顆粒另聚為一類，說明配方顆粒與水煎液質(zhì)量較為一致。

圖5 丹參HPLC指紋圖譜聚類分析（CA）樹狀圖

2.6.3 主成分分析[18]以“各特征峰峰面積與特征峰總面積的比值”值為變量，利用SPSS 20.0軟件，對17批飲片、水煎液、配方顆粒的8個(gè)共有特征峰進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表6、7及圖6。以特征值＞1為提取標(biāo)準(zhǔn)[19]，提取出前2個(gè)主成分，其總方差的累積貢獻(xiàn)率達(dá)89.33%，表明提取的2個(gè)主成分基本能反映全部指標(biāo)的信息，其中主成分1載荷高的成分對飲片、水煎液和配方顆粒質(zhì)量的影響最大。由主成分得分圖可以看出水煎液與配方顆粒質(zhì)量更為接近，這與聚類分析結(jié)果一致。

圖6 丹參HPLC指紋圖譜主成分得分圖

表6 丹參HPLC指紋圖譜主成分分析結(jié)果

表7 丹參HPLC指紋圖譜主成分因子載荷矩陣

2.6.4 偏最小二乘法（PLS）分析[20-21]PLS分析是一種多元數(shù)據(jù)分析方法，在中藥指紋圖譜研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[20-21]。為進(jìn)一步篩選影響分類的標(biāo)志物，以17批丹參飲片、水煎液、配方顆粒的分類作為因變量（Y），8個(gè)共有峰峰面積占比作為自變量（X）；采用軟件SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PLS回歸分析。由表8可知該模型預(yù)測能力較好。根據(jù)圖7可知，前6個(gè)色譜峰的VIP貢獻(xiàn)值＞1，說明丹酚酸E、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸B和峰8對于飲片、水煎液、配方顆粒指紋圖譜分類具有重要作用，而紫草酸及迷迭香酸的影響作用相對較小。

圖7 丹參HPLC指紋圖譜分類影響因素VIP得分圖

表8 丹參HPLC指紋圖譜分類的PLS回歸精度分析

3 討論

本研究通過HPLC法建立了丹參飲片、水煎液及配方顆粒的指紋圖譜，并結(jié)合化學(xué)模式識別對丹參飲片、水煎液、配方顆粒指紋圖譜信息進(jìn)行了對比分析。相似度評價(jià)結(jié)果顯示，飲片、水煎液、配方顆粒對照指紋圖譜間的相似度均大于0.990，表明三者的化學(xué)成分基本一致，其主要成分可進(jìn)行穩(wěn)定傳遞。Pearson相關(guān)分析、聚類分析、主成分分析均顯示水煎液與配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量更為接近，這與“中藥配方顆粒與其相對應(yīng)的單味中藥飲片臨床湯劑基本一致”的要求相符合[22-23]。PLS回歸分析結(jié)果表明，影響指紋圖譜信息分類的標(biāo)志性成分主要是丹酚酸E、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸B和峰8，以上確認(rèn)的5種化學(xué)成分均為水溶性的丹酚酸類化合物，可發(fā)揮涼血消癰、清心除煩的功效[24-25]，對丹參配方顆粒質(zhì)量控制有重要作用。

綜上，本研究從飲片、水煎液、配方顆粒三者的關(guān)聯(lián)性方面進(jìn)行研究，反映了丹參飲片、水煎液、配方顆粒之間的質(zhì)量相關(guān)性，可作為丹參配方顆粒生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制的數(shù)據(jù)參考。