周浩偉王秉謙張宇辰潘亞磊

（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2. 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，秦藥特色資源研究開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽(yáng) 712083）

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低，骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨骼脆性增加，容易發(fā)生骨折為特征的全身性骨?。?］。 雖然目前抗骨質(zhì)疏松癥的藥物種類(lèi)和數(shù)量較多，但在療效和減少不良反應(yīng)上均有待改進(jìn)，如骨吸收抑制劑雙膦酸鹽類(lèi)可能會(huì)增加非典型股骨骨折和下頜骨壞死；骨形成促進(jìn)藥物甲狀旁腺素類(lèi)似物不建議長(zhǎng)期使用，且需謹(jǐn)慎用于具有骨肉瘤潛在風(fēng)險(xiǎn)的患者［2］。 因此骨質(zhì)疏松癥的治療藥物仍是當(dāng)前研究熱點(diǎn)，而構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型是研究相關(guān)藥物不可或缺的重要途徑。 本研究檢索近10 年來(lái)骨質(zhì)疏松癥相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)，篩選出國(guó)內(nèi)外期刊公開(kāi)發(fā)表的有關(guān)骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究論文，采用數(shù)據(jù)挖掘的方式對(duì)骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型的動(dòng)物種類(lèi)、造模方式、檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行闡述，為今后骨質(zhì)疏松癥建模研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

在中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)、維普數(shù)據(jù)庫(kù)、PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索2013 年01 月01 日～2023 年01 月01 日有關(guān)骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)文獻(xiàn)，使用高級(jí)檢索，中文以“骨質(zhì)疏松”和“動(dòng)物模型”為主題檢索；英文以“Osteoporosis”AND“models animal”為主題詞檢索。 共搜索出3810 條結(jié)果。

1.2 文獻(xiàn)篩選標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：明確為骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)且數(shù)據(jù)詳細(xì)的文獻(xiàn)。 排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）剔除動(dòng)物模型不明、合并骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)疏松為其他疾病并發(fā)癥、數(shù)據(jù)不全及存在缺漏的文獻(xiàn)；（2）剔除綜述、理論研究、學(xué)位論文、會(huì)議類(lèi)文獻(xiàn)。 最終僅選用模型條件完備（動(dòng)物種類(lèi)、性別、造模方式、檢測(cè)指標(biāo)等明確）的且可獲得全文的期刊文獻(xiàn)，總計(jì)457 篇，其中中文224篇，英文233 篇。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Excel 軟件，將納入的457 篇文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)、體重、性別、造模方式、檢測(cè)儀器、檢測(cè)指標(biāo)等信息匯總整理成骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型數(shù)據(jù)庫(kù)。 動(dòng)物種類(lèi)、名稱(chēng)等均參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》進(jìn)行規(guī)范［3］。 使用Excel 進(jìn)行頻次分析，采用SPSS Modeler 18.0 對(duì)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物類(lèi)別

在篩選后的457 篇文獻(xiàn)中，頻數(shù)和占比前5 的骨質(zhì)疏松癥模型動(dòng)物分別為： 大鼠（315 次，68.9%）、小鼠（84 次，18.4%）、兔子（19 次，4.2%）、斑馬魚(yú)（14 次，3.1%）、羊（13 次，2.8%）；此外，鳉魚(yú)和樹(shù)鼩為3 次，食蟹猴為2 次，豬、豚鼠、狗和雞各1 次。

大鼠和小鼠是骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型首選動(dòng)物。其次是兔子，相對(duì)于大、小鼠而言，兔子的耳朵碩大，耳緣靜脈取血方便，便于長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)觀察血清生化骨代謝相關(guān)指標(biāo)等。 羊作為較大體型的動(dòng)物，易其骨骼標(biāo)本易用作力學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。 但兔子和羊的造模成本較高，飼養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，模型穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究。 斑馬魚(yú)具有成本低、易飼養(yǎng)、造模周期短、給藥簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，且與哺乳動(dòng)物基因高度同源性，因而近年來(lái)使用斑馬魚(yú)建立骨質(zhì)疏松癥模型逐漸引起研究者的關(guān)注［4］。 但斑馬魚(yú)仍具有造模方式單一、難以連續(xù)觀測(cè)等缺點(diǎn)，在研究時(shí)應(yīng)根據(jù)所考察指標(biāo)選擇使用。

2.2 造模方式

在文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中，骨質(zhì)疏松癥造模方式和占比統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：手術(shù)造模占比72.6%，藥物誘導(dǎo)造模占比19.5%，手術(shù)合并藥物造模方式占比4.8%。此外，還包括少量其他造模方式如飲食誘導(dǎo)、缺鐵性貧血、酒精刺激、基因調(diào)控等。

手術(shù)造模具有效果穩(wěn)定、可復(fù)制性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度大、應(yīng)用較為廣泛等優(yōu)點(diǎn)。 但手術(shù)創(chuàng)傷初期引起的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)干擾血清代謝等檢測(cè)指標(biāo)，手術(shù)造模所需周期也較長(zhǎng)。 藥物造模的優(yōu)點(diǎn)為建模周期短、操作簡(jiǎn)便。 但藥物造模的成模效果不穩(wěn)定，停用藥物后骨量丟失會(huì)逆轉(zhuǎn)，而藥物過(guò)量則會(huì)造成骨壞死、免疫抑制等并發(fā)癥。

2.2.1 手術(shù)造模

在332 篇手術(shù)造模文獻(xiàn)中，頻數(shù)和占比前3 位的為：去卵巢（320 次，96.4%）、去睪丸（6 次，1.8%）、去坐骨神經(jīng)（3 次，0.9%）；此外，去臂叢神經(jīng)、切除靜脈和去5／6 腎各出現(xiàn)1 次。

去卵巢是首選手術(shù)造模方式，其可模擬婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。 在去卵巢手術(shù)文獻(xiàn)中，背部入路占比28.1%，腹部入路占比17.8%，其余未明確手術(shù)入路方式。 從腹部入路摘除卵巢時(shí)，容易找到卵巢，操作相對(duì)簡(jiǎn)單、易行［5］。 但動(dòng)物爬行時(shí)腹部在墊料上摩擦，加之嚙齒類(lèi)動(dòng)物會(huì)舔舐傷口，使得傷口較易撕裂或感染。 從大鼠背部做切口摘除卵巢時(shí)，需要在背部正中線做一個(gè)2 cm 左右的切口，大鼠背部肌肉發(fā)達(dá)，較腹部入路縫合復(fù)雜，但具有不易感染、脫線和傷口愈合更快等優(yōu)點(diǎn)［6］。

2.2.2 藥物誘導(dǎo)造模

藥物誘導(dǎo)是研究繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的造模方法。 有明確給藥途徑、給藥劑量和造模時(shí)間的中文文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1，英文文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。 造模所用大鼠體重大多在180 ～300 g 之間；小鼠的體重在18～27 g 之間。 動(dòng)物在成年之前，體重和月齡呈正相關(guān)，目前骨質(zhì)疏松癥藥物誘導(dǎo)造模所用大鼠和小鼠的月齡跨度較大，這可能會(huì)因動(dòng)物的月齡差異導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥形成系統(tǒng)誤差。 造模所用藥物種類(lèi)，中文文獻(xiàn)維甲酸和糖皮質(zhì)激素類(lèi)（地塞米松、氫化可的松、甲潑尼龍、強(qiáng)的松）各約占據(jù)一半，英文文獻(xiàn)除1 例維甲酸，其余全部為糖皮質(zhì)激素類(lèi)。 從給藥途徑來(lái)看，維甲酸均采用灌胃法，糖皮質(zhì)激素類(lèi)則采用注射方式，但注射部位包括肌內(nèi)注射、皮下注射、腹腔注射、腹膜內(nèi)注射、靜脈注射等。 從給藥劑量來(lái)看，維甲酸給藥劑量較集中采用70 ～100 mg／kg；糖皮質(zhì)激素類(lèi)則差異較大，如地塞米松肌內(nèi)注射劑量為1 ～21 mg／kg。

表1 骨質(zhì)疏松癥藥物誘導(dǎo)造模中文文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of Chinese literature on drug induced modeling of osteoporosis

表2 骨質(zhì)疏松癥藥物誘導(dǎo)造模英文文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of English literature on drug induced modeling of osteoporosis

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)常用檢測(cè)指標(biāo)見(jiàn)表3。 骨密度測(cè)定常采用雙能X 射線骨密度儀，其以X 射線通過(guò)動(dòng)物組織時(shí)的衰減差異來(lái)分析骨骼和軟組織的數(shù)量，能夠量化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的骨密度，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性和精確性高，是骨質(zhì)疏松癥無(wú)創(chuàng)性檢查的金標(biāo)準(zhǔn)［50］。 血清骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)包含骨鈣素、Ⅰ型膠原氨基端前肽、Ⅰ型膠原C 端交聯(lián)肽、甲狀旁腺素、25-羥基維生素、骨特異性堿性磷酸酶、酸性磷酸酶等，同時(shí)也測(cè)定鈣、鎂及磷等元素含量變化，從而反映骨代謝變化，有助于評(píng)估骨質(zhì)疏松癥的模擬狀態(tài)或者療效［51］。 Mirco-CT 可分析骨骼微結(jié)構(gòu)得到包括骨體積／組織體積（BV／TV）、骨表面／骨體積（BS／BV）、小梁數(shù)（Tb.N）和小梁厚度（Tb.Th）、小梁分離（Tb.Sp）和結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（SMI）等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨骼三維結(jié)構(gòu)的重建，此外Mirco-CT 還可檢測(cè)股骨組織微血管形態(tài)［52］。 與三維的骨微結(jié)構(gòu)相比，制作骨切片在平面上可觀察骨組織形態(tài)和病理狀態(tài)，采用蘇木精-伊紅（HE）染色、油紅O 染色、Masson 染色、甲苯胺藍(lán)、麗春紅等染色法及鈣黃綠素、四環(huán)素等熒光標(biāo)記后可間接動(dòng)態(tài)考察骨組織中骨代謝狀態(tài)。 骨生物力學(xué)測(cè)試方法有軸向壓縮實(shí)驗(yàn)、扭轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)、軸向拔出實(shí)驗(yàn)、三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)和四點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)等，其中三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)使用頻數(shù)最高，占比為55.9%。 骨生物力學(xué)測(cè)定部位頻率由高到低為股骨、脛骨、腰椎骨和肱骨。 常用骨生物力學(xué)測(cè)定指標(biāo)及使用頻率占比為最大應(yīng)力（84.4%）、最大載荷（79.8%）、剛度（42.2%）、彈性模量（37.7%），此外還包括壓縮模量、楊氏模量和能量等指標(biāo)。 最大應(yīng)力是導(dǎo)致骨斷裂所需要最大的力，能夠直觀地評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生骨折的可能性。 最大載荷是骨骼能承受的極限載荷，體現(xiàn)的是骨骼的韌性與抵抗外力的損傷能力，提升骨最大載荷可以顯著降低骨折發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。 表3 為單項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)占統(tǒng)計(jì)文獻(xiàn)的比例，占比相加不等于1。

表3 骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型檢測(cè)指標(biāo)Table 3 Testing indexes of osteoporosis animal model

2.4 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

采用經(jīng)典的Apriori 算法進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析進(jìn)一步挖掘骨質(zhì)疏松癥各指標(biāo)間的聯(lián)系。 設(shè)置支持度為10%、置信度為50%、最大前項(xiàng)數(shù)為5、增益＞1， 共計(jì)得到6 組配對(duì)。 檢測(cè)指標(biāo)關(guān)聯(lián)情況見(jiàn)圖1，關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果見(jiàn)表4。 結(jié)果顯示，血清骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)、骨微結(jié)構(gòu)和骨組織形態(tài)／病理觀察均與骨密度兩兩緊密聯(lián)系，表明這些指標(biāo)與骨密度一起均為評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松癥的重要依據(jù)。 此外，雖然骨生物力學(xué)／骨強(qiáng)度與骨密度關(guān)聯(lián)性較弱，對(duì)評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松癥作用較小，但測(cè)量生物力學(xué)是預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松癥最常見(jiàn)并發(fā)癥骨折的有利方式，在今后研究中應(yīng)引起重視。

圖1 檢測(cè)指標(biāo)網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖Figure 1 Network association diagram of testing indexes

表4 骨質(zhì)疏松癥檢測(cè)指標(biāo)關(guān)聯(lián)規(guī)則分析Table 4 Analysis of association rules of osteoporosis testing indexes

3 討論

骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型的建立是研究其發(fā)病機(jī)制和研發(fā)新藥的關(guān)鍵步驟。 本文通過(guò)統(tǒng)計(jì)近10 年國(guó)內(nèi)外骨質(zhì)疏松癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)，發(fā)現(xiàn)雖然所用動(dòng)物種類(lèi)較廣，但就目前而言骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型造模大多選取大鼠和小鼠。 大鼠骨骺板缺乏真正閉合以及與人類(lèi)的骨骼差異大，作為骨質(zhì)疏松癥模型存在一定缺陷［53］，但因其遺傳背景清楚、易操作、價(jià)格較低的特點(diǎn)［54］，常作為造模首選。 在原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥模型中，雌性大鼠手術(shù)去卵巢是美國(guó)食品和藥品管理局和世界衛(wèi)生組織推薦的研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型［55］。 而繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥模型以糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物誘導(dǎo)大鼠為主。 筆者通過(guò)分析文獻(xiàn)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物造模存在以下三點(diǎn)有待改進(jìn)之處：第一，藥物誘導(dǎo)造模給藥劑量和造模時(shí)間差異較大，這些可能會(huì)顯著影響動(dòng)物骨質(zhì)疏松程度，因此需要對(duì)不同藥物誘導(dǎo)方法做系統(tǒng)比較研究；第二，研究者所采用的動(dòng)物體重差異較大，動(dòng)物月齡（體重）會(huì)顯著影響骨密度和骨生物力學(xué)［56］，后續(xù)研究需要規(guī)范化；第三，應(yīng)注重自然衰老動(dòng)物骨質(zhì)疏松癥的研究，自然衰老模型更符合人類(lèi)增齡衰老產(chǎn)生骨質(zhì)疏松癥這一客觀規(guī)律。 骨密度和骨微結(jié)構(gòu)可以直接反應(yīng)骨質(zhì)疏松程度，而血清生化骨代謝相關(guān)指標(biāo)和骨組織形態(tài)／病理觀察可反應(yīng)骨形成和骨吸收狀態(tài)。 骨質(zhì)疏松性骨折是骨質(zhì)疏松癥嚴(yán)重的并發(fā)癥，據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)生骨質(zhì)疏松性髖部骨折后患者的一年內(nèi)的死亡率高達(dá)30%，殘疾率大概占50%［57］，因此骨生物力學(xué)指標(biāo)的測(cè)量顯得尤為重要。 總之，骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型需要多指標(biāo)評(píng)價(jià)。

綜上所述，骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型目前使用頻率最高的為雌性大鼠去卵巢，評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松癥需要骨密度、血清骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)、骨組織形態(tài)及病理觀察、骨微結(jié)構(gòu)和骨生物力學(xué)等多指標(biāo)的綜合判定。 今后需要規(guī)范骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型的造模方法，并結(jié)合骨質(zhì)疏松癥的病因，創(chuàng)建更加符合人類(lèi)骨質(zhì)疏松癥特點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物模型，這對(duì)骨質(zhì)疏松癥的研究和治療具有重要的意義。