屈芷馨李憲美張峰華*

（1. 福建醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室，福州 350122；2. 福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福州 350122）

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，肝癌已成為威脅人類健康的第六大癌癥類型，其死亡率高居第二［1］。 隨著世界人口的不斷增長，人類對環(huán)境的破壞日益嚴重，肝癌的發(fā)病率及死亡率仍在持續(xù)上升。 肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種原發(fā)性肝癌，占所有肝癌病例的90% ～95%［2］。 由于病人早期不會表現(xiàn)出明顯癥狀，極少主動就診，往往晚期才被確診，但已錯失最佳治療時期。 早期診斷的肝癌腫瘤標志物包括甲胎蛋白、凝血酶原等，但二者的升高也不排除是由妊娠、肝炎、肝硬化等原因?qū)е碌?，這給HCC 的早期診斷帶來了一定的挑戰(zhàn)。

目前，針對HCC 患者的治療手段比較有限，且存在一定的局限性。 一般認為手術(shù)切除、肝移植以及局部消融等方式對于早期HCC 患者具有一定的臨床治療潛力。 然而，手術(shù)切除可能無法清除所有的肝癌細胞，肝移植也會受到供體肝數(shù)量的限制。對于直徑較小或位于肝深部的肝癌組織，局部射頻消融技術(shù)比較常用，該技術(shù)可在超聲或CT 引導下通過電極傳遞電磁能量，最終導致腫瘤熱壞死，但該技術(shù)對于組織較大或鄰近血管的腫瘤并不適用。中晚期肝癌患者一般需要通過放射性治療或化學藥物治療來維持一定的生活質(zhì)量并提高生存率，但這也僅僅是一種非治愈性療法，且常伴有嚴重的副作用，同時還存在耐藥性問題。 臨床上，有4 種較新的肝細胞癌化療藥物，包括一線藥物樂伐替尼，二線藥物瑞戈菲尼、雷莫蘆單抗及卡博替尼。 但不同患者對藥物的敏感性不一，因此建立合適的人源腫瘤異種移植（patient-derived tumor xenograft，PDX）模型用于評估不同患者的藥物敏感性對于指導HCC患者的臨床用藥十分必要。

不論是新技術(shù)手段還是新藥開發(fā)，均需要利用動物模型來驗證其有效性或測試其毒副作用。 通常，利用小鼠模型可以獲得致癌基因誘導細胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機制，并揭示腫瘤微環(huán)境下癌細胞的動力學變化及對藥物的治療響應情況。 但小鼠模型不可避免地會存在以下缺點和不足，如飼養(yǎng)成本高、可用于實驗的動物數(shù)量有限、活體實時成像較為困難、不適合高通量篩選等。 斑馬魚因其獨特的優(yōu)勢，可以克服小鼠模型的不足，現(xiàn)已成為生物醫(yī)藥研究領域不可或缺的一種模式生物，其在胚胎發(fā)育、毒理學、腫瘤生物學、遺傳育種以及藥物篩選等領域發(fā)揮著重要作用。 本文綜述了近年來利用斑馬魚模型進行肝細胞癌相關(guān)研究的最新成果，為肝癌研究提供參考。

1 斑馬魚用于構(gòu)建肝細胞癌模型的獨特優(yōu)勢

斑馬魚（Danio rerio）是一種小型熱帶淡水魚，迄今為止已被用于構(gòu)建各種人類疾病模型，包括心血管系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病以及包括肝細胞癌在內(nèi)的各種癌癥模型。相對于其他模式動物而言，其被廣泛應用于肝細胞癌模型研究的主要原因包括以下3 個方面。

首先，斑馬魚的肝發(fā)育過程、組織結(jié)構(gòu)及功能與人類高度相似。 斑馬魚的肝發(fā)生過程主要包括3 個階段：肝母細胞特化、出芽／分化以及肝生長［3］。在結(jié)構(gòu)上可形成與人類肝相似的左右肝葉及肝內(nèi)膽管。 在功能上同樣發(fā)揮調(diào)節(jié)必需營養(yǎng)素的消化和代謝、維生素的儲存、紅細胞的分解、血漿蛋白（如凝血酶原、纖維蛋白原等）的合成、白蛋白及荷爾蒙的產(chǎn)生，以及解毒等作用。

其次，調(diào)控斑馬魚肝發(fā)育及腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵基因及信號通路是保守的。 如FGF、BMP 和WNT 等信號通路均在斑馬魚肝發(fā)生中起關(guān)鍵作用［4－5］。 而人HCC 的致癌基因如KRAS、MYC、UHRF1 等同樣能夠誘導斑馬魚HCC 的發(fā)生［6－8］。 與人類高度相似的遺傳背景及組織器官發(fā)育模式，使得斑馬魚逐漸成為能夠模擬包括HCC 在內(nèi)的各種人類疾病的良好模式生物。

最后，斑馬魚超強的繁殖能力、小巧的體積、快速的發(fā)育過程、低廉的養(yǎng)殖成本等均是其能夠快速成為“科研新星”的重要原因。 而且，研究者已開發(fā)出無色素的全透明Casper品系［9］，利用該品系可以活體全程追蹤內(nèi)源或外源基因表達變化，以及腫瘤細胞在體內(nèi)的增殖、遷移情況，這是哺乳類模式動物無法比擬的優(yōu)勢。 此外，斑馬魚學界已在Casper背景下開發(fā)出多種免疫缺陷突變體［10－11］，這使得利用斑馬魚成魚進行腫瘤細胞移植，甚至構(gòu)建PDX 模型用于腫瘤精準治療成為可能。

綜上所述，利用斑馬魚構(gòu)建HCC 遺傳模型或者異種移植模型優(yōu)勢非常明顯，如實驗成本低、周期短、便于活體觀察、適用于高通量藥物篩選等。 基于這些優(yōu)點，國內(nèi)外已有大量關(guān)于斑馬魚肝細胞癌模型研究的相關(guān)成果。

2 斑馬魚的遺傳學肝細胞癌模型

近年來，通過全基因組或者全外顯子組測序，可以鑒定出HCC 患者體內(nèi)與腫瘤形成可能相關(guān)的遺傳變異［12］，對這些變異進行深入的功能研究將有助于揭示新的驅(qū)動HCC 發(fā)生發(fā)展的基因突變，這是實現(xiàn)HCC 個性化治療的重要前提。

起初，研究者通過已知的化學致癌物，如7，12-二甲基苯并蒽（DMBA）來誘導斑馬魚HCC 的形成［13］。 但這種方法建模周期長、個體差異大，不利于進行相關(guān)機制的深入研究。 于是研究者們開始利用遺傳學方法來建立斑馬魚HCC 模型，從而模擬人類HCC 中的突變［14］。

2.1 斑馬魚突變體相關(guān)的肝細胞癌模型

斑馬魚HCC 的形成過程與人類相似，都要經(jīng)過肝炎、脂肪變性、纖維化、畸形增生、癌變等步驟。2005 年，Sadler 等［14］通過遺傳篩選的手段從297 個斑馬魚突變體中篩選到了7 個突變體，其在發(fā)育至5 d 時肝明顯增大。 其中，vps18 突變體會出現(xiàn)肝腫大、空泡化，并伴有溶酶體缺失；腫瘤抑制基因nf2的突變體會出現(xiàn)膽總管囊腫；fgr突變體會出現(xiàn)肝細胞增大、脂肪變性。 這些突變體均可作為良好的肝疾病模型或者潛在的HCC 模型。

TP53 是調(diào)控細胞增殖與凋亡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其功能缺失與多種癌癥相關(guān)，而肝特異性缺失TP53會導致人HCC 的形成［15－17］。 斑馬魚中，tp53 突變體雖然不會自發(fā)發(fā)生HCC，但其在繼發(fā)性損傷存在時更易發(fā)展為HCC［18］。 乙肝病毒X 抗原（HBx）與HCC 的發(fā)生密切相關(guān)，Lu 等［19］發(fā)現(xiàn)在野生型斑馬肝中特異性過表達HBx 會導致脂肪變性、纖維化及糖原積累。 值得注意的是，如果在tp53 突變體中過表達HBx 卻能夠誘導HCC 的發(fā)生，且該過程與src酪氨酸激酶通路的激活有關(guān)。 與該機制相一致的是，在tp53 基因突變的背景下過表達src也會導致肝畸形增生、HCC 以及肉瘤樣HCC。 2021 年，Luo等［20］利用CRISPR／Cas9 技術(shù)在斑馬魚肝中特異性敲除了tp53 和pten，同樣證實了tp53 單一突變無法誘導HCC，而pten的缺失足以觸發(fā)HCC。 值得注意的是，與單突變的斑馬魚相比，pten和tp53 雙突變的斑馬魚HCC 發(fā)生率及組織學分級更高、且生存期更短。 該研究表明，雖然tp53 突變并非斑馬魚HCC的起始因子，但其突變使得斑馬魚對HCC 致病因子更為敏感，在HCC 的進一步發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色。

Wnt／β-catenin 信號通路的異常激活與HCC 的發(fā)生有關(guān)，腫瘤抑制因子APC 的功能缺失會持續(xù)性激活Wnt／β-catenin 信號通路［21－22］。 小鼠肝特異性剔除Apc基因會導致Wnt／β-catenin 通路異常激活，從而發(fā)生HCC［23］。 斑馬魚中其同源基因apc的雜合突變體會出現(xiàn)自發(fā)性肝腺瘤。 若利用DMBA 處理apc雜合突變體，其HCC 的發(fā)生率將從20.5%提高至70.8%［24］。 這些結(jié)果表明apc突變在觸發(fā)斑馬魚HCC 過程中發(fā)揮著重要作用，與小鼠和人中的基因功能保守性較強。

因此，對于不同HCC 患者，若臨床上篩查到新的可能導致HCC 的致癌突變，可利用斑馬魚進行同源基因敲除，制備相應突變體，從而快速驗證其是否與HCC 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

2.2 持續(xù)表達型轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝細胞癌模型

除了構(gòu)建基因功能缺失的突變體，研究者們還建立了多種轉(zhuǎn)基因斑馬魚HCC 模型，用于研究特定基因過表達對HCC 發(fā)生發(fā)展的影響，研究者們大多通過轉(zhuǎn)入突變型致癌基因來建立HCC 模型［6，25-27］。

Ras原癌基因是參與癌細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的核心調(diào)節(jié)因子，在多種類型的癌癥中會發(fā)生突變［28－30］。Nguyen 等［6］構(gòu)建了肝穩(wěn)定過表達致癌基因krasV12的轉(zhuǎn)基因斑馬魚HCC 模型，該模型中krasV12的高表達激活了肝中Ras-Raf-MEK-ERK 及Wnt／β-catenin信號通路，觸發(fā)了HCC 的發(fā)生。 值得注意的是該轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的HCC 潛伏期相對較長，在9 月齡的成魚中，HCC 的發(fā)生率也不到30%。 此外，tp53缺失可加速krasV12轉(zhuǎn)基因斑馬魚HCC 的發(fā)生，但腫瘤發(fā)病率并沒有增加，這同樣證實tp53 突變并非斑馬魚HCC 的觸發(fā)因子，而在HCC 的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

極光激酶A（Aurora A，AURKA）是有絲分裂進程的主要調(diào)節(jié)因子，對中心體成熟和紡錘體的穩(wěn)定起重要作用［31－32］。 近年來又發(fā)現(xiàn)其可通過激活上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（ epithelial-mesenchymal transition，EMT）以及細胞干性重編程來促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移［33］。 2019 年，Su 等［25］構(gòu)建了AURKA（V352I）和AURKA（WT） 兩種轉(zhuǎn)基因斑馬魚，發(fā)現(xiàn)AURKA（V352I）轉(zhuǎn)基因斑馬魚在3 個月時便誘導出了纖維化標志基因col1a1 的表達，7 個月形成HCC，而AURKA（WT）轉(zhuǎn)基因斑馬魚則需要9 個月才能進展到HCC 階段。 該研究表明，突變型的AURKA（V352I）可能對于HCC 的早期發(fā)生具有重要作用。

β-catenin 是經(jīng)典Wnt 信號通路的重要組成部分，β-catenin 突變可能與HCC 的起始有關(guān)［34］。2015 年，Evason 等［26］在斑馬魚肝中特異性過表達爪蟾突變型β-catenin，在4 ～5 月齡時斑馬魚生存率顯著降低，部分個體表現(xiàn)出肝體積增大、肝細胞核膨大以及核輪廓不規(guī)則等組織學異常。 在6 月齡時斑馬魚肝結(jié)構(gòu)被嚴重破壞，表現(xiàn)出與人類HCC 相似的病理學特征，因此，該品系可作為臨床上β-catenin 突變誘導的HCC 模型，用于相關(guān)藥物篩選或機制研究。

持續(xù)的病毒感染是HCC 形成的主要原因。HBx 是乙型肝炎病毒（HBV）的X 抗原，其過表達可誘導小鼠出現(xiàn)HCC 的表型，且src可作為共同調(diào)節(jié)因子參與HBx 誘導的小鼠HCC 的發(fā)生［35－36］。 在TP53 缺失突變的背景下，同時過表達HBx 和src能夠誘導斑馬魚在5 月齡時出現(xiàn)HCC，高脂飲食飼養(yǎng)時，HCC 比例增加［27］。 值得注意的是，單獨過表達HBx 或src，僅能誘導斑馬魚肝細胞增生或畸形，但無法直接誘導出HCC 的表型。 這可能是因為斑馬魚并非HBV 的宿主，體內(nèi)不存在相關(guān)受體。

持續(xù)表達型轉(zhuǎn)基因斑馬魚HCC 模型可很好地模擬人類HCC 的發(fā)生，并用于測試藥物的抗癌效果，也可作為潛在精準醫(yī)療的藥物篩選平臺。 但持續(xù)過表達致癌基因，易導致胚胎缺陷，這將使研究長期的癌癥進展以及維持轉(zhuǎn)基因品系變得較為困難。

2.3 誘導型轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝細胞癌模型

為了克服上述持續(xù)表達型HCC 模型的缺點，研究者進一步開發(fā)出了誘導型轉(zhuǎn)基因HCC 模型，可控制致癌基因表達時間及表達量，從而隨時控制腫瘤的起始及進展。

Nguyen 等［37］、Emelyanov 等［38］嘗試使用米非司酮誘導的LexPR 系統(tǒng)控制krasV12在斑馬魚肝中特異性過表達。 研究者通過調(diào)整米非司酮的濃度可控制krasV12基因的表達水平，同時，通過控制何時加入米非司酮，可實現(xiàn)在斑馬魚任意發(fā)育階段啟動腫瘤的發(fā)生［37］。 研究發(fā)現(xiàn)，利用2 μmol／L 米非司酮處理krasV12轉(zhuǎn)基因斑馬魚1 個月后，可100%誘導出HCC。 值得注意的是，撤除米非司酮后，HCC 的表型可恢復。 除了krasV12轉(zhuǎn)基因斑馬魚，研究者們還建立了其他基因的米非司酮誘導表達品系，如tgfβ1a轉(zhuǎn)基因品系、myca和mycb轉(zhuǎn)基因品系［39－40］等。

四環(huán)素誘導的Tet-on 系統(tǒng)是斑馬魚HCC 模型中另一個常用的誘導表達系統(tǒng)，被用于控制krasV12、xmrk和小鼠Myc等基因在斑馬魚肝中特異性表達［7，41－43］。 Xmrk 是劍尾魚黑色素瘤受體激酶，其蛋白結(jié)構(gòu)與人表皮生長因子受體（EGFR）高度相似，在肝癌發(fā)生中起著重要作用［44］。 癌基因Myc與HCC 不良預后相關(guān)，被認為是人類肝腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵［45］。 在四環(huán)素誘導后，上述3 種轉(zhuǎn)基因品系均表現(xiàn)出肝迅速腫大，以及肝腫瘤形成。 其中krasV12和xmrk品系誘導的大部分腫瘤可進展為HCC，而小鼠Myc誘導的則大多是肝細胞腺瘤。

單一致癌基因過表達的轉(zhuǎn)基因模型可以穩(wěn)定地誘導斑馬魚HCC，但腫瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象甚少發(fā)生。Twist 是一種堿性的螺旋－環(huán)－螺旋轉(zhuǎn)錄因子，與癌癥患者的低生存率相關(guān)，在誘導EMT 過程中發(fā)揮重要作用［46］。 2020 年，Nakayama 等［47］構(gòu)建了米非司酮誘導的Twist1-ERT2／xmrk雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚，在三苯氧胺處理時，約80%的雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚通過誘導EMT 在5 d 內(nèi)發(fā)生肝癌細胞擴散，甚至長距離遷移到軀干和尾部，在部分魚中，甚至還觀察到了繼發(fā)性腫瘤的建立。 類似地，twist1a ／krasV12雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚也表現(xiàn)出自發(fā)的腫瘤轉(zhuǎn)移， 脂多糖（lipopolysaccharides， LPS） 處理可增加腫瘤細胞轉(zhuǎn)移［48］。

結(jié)合上述兩種誘導型轉(zhuǎn)基因表達系統(tǒng)可有選擇性地激活不同的致癌基因，這種策略不但可以研究多種候選基因的致癌功能，還可以有效規(guī)避誘導物對下游實驗的可能干擾。 值得注意的是，單一的誘導表達系統(tǒng)依賴于誘導物的持續(xù)暴露，這通常會導致斑馬魚所有的肝細胞全部發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，與人類癌癥發(fā)生的實際情況不符。 結(jié)合米非司酮誘導的krasV12模型和Cre／loxP 系統(tǒng)，只需短暫暴露于米非司酮，便可誘導Cre-loxP 介導的永久性基因組重組［49］。 由于Cre 酶介導的基因組重組往往是不完全的，可使krasV12在肝部分細胞中特異性表達。 在這個誘導系統(tǒng)中，斑馬魚肝會出現(xiàn)不同的腫瘤結(jié)節(jié)，腫瘤病變過程與經(jīng)致癌物處理的斑馬魚十分相似，能夠更好地模擬人類HCC 的形成過程。 因此，在進行實驗設計時需要明確實驗目的，選擇合適的誘導表達系統(tǒng)來建立斑馬魚HCC 模型。

3 斑馬魚的肝細胞癌異種移植模型

構(gòu)建腫瘤異種移植模型是研究腫瘤進展和測試新療法的重要途徑。 相較于遺傳學模型，異種移植模型的造模周期更短，且供體細胞多為人源腫瘤細胞系或來自于患者的腫瘤組織，更利于測試人的腫瘤細胞對藥物的敏感性，因此臨床應用前景更廣闊。

大多數(shù)斑馬魚HCC 異種移植模型使用永生化細胞系作為供體，評估腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管新生、腫瘤微環(huán)境等。

3.1 斑馬魚幼魚的肝細胞癌異種移植模型

斑馬魚受精后1 個月左右后天免疫系統(tǒng)才完全發(fā)育成熟［50］。 所以，異種移植腫瘤細胞到斑馬魚幼魚體內(nèi)，可免受免疫系統(tǒng)排斥，移植成功率較高。

目前，多數(shù)研究選擇將人肝癌細胞系注射到受精后2 d（days post fertilization，dpf）的幼魚卵黃囊以評估其體內(nèi)增殖能力，并測試藥物對肝癌細胞的抑制能力［51－53］。 2016 年，Tseng 等［51］將Huh7 細胞注射到2 dpf 的斑馬魚幼魚卵黃囊，并用不同濃度的茚［1，2-b］喹喔啉衍生物處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能夠在斑馬魚內(nèi)體發(fā)揮良好的抗腫瘤效果。 采用類似的方法，Liu 等［52］和Xu 等［53］又分別發(fā)現(xiàn)苦豆堿和茶褐素對HCC 細胞的生長均有一定的抑制作用。

研究者也可通過對HCC 細胞系進行目的基因敲降或過表達后，再構(gòu)建異種移植模型，從而評估基因?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移能力的影響［54－56］。 甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2β（MAT2B）基因在肝癌組織中高表達，并且在臨床上與肝癌患者的不良預后相關(guān)。 2019 年，Wu 等［54］在多種HCC 細胞系中敲降MAT2B基因，然后構(gòu)建斑馬魚HCC 異種移植模型。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默MAT2B可通過部分抑制EGFR 信號通路抑制HCC 細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和侵襲，提示MAT2B可以作為HCC 新的預后標志物和治療靶點。 2021 年，Akbari 等［55］構(gòu)建了過表達G 蛋白偶聯(lián)受體5（LGR5）的Huh7 細胞系，并將其植入斑馬魚卵黃囊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達LGR5 時Huh7 細胞轉(zhuǎn)移率更高。 采用類似方法，研究者發(fā)現(xiàn)在人肝癌細胞系SNU-449 中過表達HOX 轉(zhuǎn)錄物反義基因間RNA（HOTAIR）基因會促進肝癌細胞在斑馬魚體內(nèi)的轉(zhuǎn)移［56］。

除了評估肝癌細胞在體內(nèi)的增殖與轉(zhuǎn)移能力，斑馬魚異種移植模型同樣適用于評估腫瘤細胞引起的血管新生。 2016 年，Tonon 等［57］將具有較強侵襲性的人HCC 細胞株JHH6 注射到2 dpf 的血管綠色熒光品系斑馬魚幼魚卵黃囊，通過熒光觀察及血管染色，并對血管內(nèi)皮生長因子及其受體基因進行定量分析，發(fā)現(xiàn)該模型可重現(xiàn)肝細胞癌的促血管生成能力，且該模型可用于測試血管新生相關(guān)藥物如硼替佐米的抗HCC 效果。

斑馬魚幼魚異種移植模型還可用于進行規(guī)?；幬锖Y選。 2020 年，Nakayama 等［47］利用轉(zhuǎn)移性HCC 斑馬魚模型從67 種FDA 批準的藥物中篩選出一種HSD11β1 的抑制劑——腎上腺甾酮，并證實腎上腺甾酮的確可通過抑制HSD11β1 的表達來抑制HCC 的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。

雖然利用斑馬魚幼魚構(gòu)建腫瘤異種移植模型已經(jīng)取得了一定的成效，但該模型仍存在一定的局限性。 首先，注射到卵黃囊的腫瘤細胞無法與周圍的組織細胞進行交互，難以模擬體內(nèi)腫瘤生長的真實環(huán)境。 因此，迫切需要評估斑馬魚胚胎不同移植部位對腫瘤細胞增殖、遷移以及血管新生的影響，以確定合適的研究方法。 其次，斑馬魚后天免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟后，移植的腫瘤細胞終將被殺死。 因此，針對幼魚腫瘤移植模型的研究只能局限在較短時間內(nèi)，不利于研究腫瘤發(fā)展的長期過程。 最后，斑馬魚幼魚體積較小，每次只能植入幾十到幾百個細胞，往往這些細胞是不包含腫瘤干細胞的，這使得移植的腫瘤細胞難以持續(xù)生長。 在優(yōu)化斑馬魚幼魚腫瘤細胞移植方法的基礎上進行PDX 模型的構(gòu)建，并測試特定患者對臨床藥物的敏感性，將會推動斑馬魚PDX 模型的臨床應用。

3.2 斑馬魚成魚的肝細胞癌異種移植模型

為了克服上述幼魚模型的局限性，研究者們開發(fā)了斑馬魚成魚的腫瘤異種移植模型，此模型必須使用免疫抑制或免疫缺陷的成魚作為受體［10，58－65］。構(gòu)建免疫抑制或免疫缺陷成魚常用的物理化學方法包括利用γ 射線或地塞米松等藥物抑制免疫細胞功能，遺傳學方法主要是通過敲除免疫相關(guān)功能基因，構(gòu)建免疫缺陷斑馬魚突變品系。

斑馬魚對γ 射線的生物反應與哺乳動物非常相似，研究發(fā)現(xiàn)，在大約20 Gy 的輻照劑量下，斑馬魚淋巴組織內(nèi)的細胞在1 周內(nèi)大部分會被消融，但這并不是永久性的，所有造血細胞會在1 個月內(nèi)恢復。 接受輻照處理的斑馬魚在僅移植5 × 103個白血病細胞時便可出現(xiàn)明顯的惡性轉(zhuǎn)化，而未接受輻照處理的斑馬魚在植入高達5 × 106個白血病細胞后也未出現(xiàn)白血病表型，提示植入的白血病細胞可能遭到受體免疫系統(tǒng)排斥并被清除［58］。

除了利用物理射線抑制免疫系統(tǒng)功能，有研究者使用化學藥物地塞米松處理斑馬魚，發(fā)現(xiàn)其淋巴細胞功能可被顯著抑制，在植入人乳腺癌細胞（MDA-435）、纖維肉瘤細胞（HT1080）以及小鼠黑色素瘤細胞（B16）后，出現(xiàn)了不同程度的細胞侵襲、血管新生及致死效應［59］。 2019 年，Khan 等［60］嘗試使用白消安抑制斑馬魚成魚髓系系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)可以提高肝細胞癌和急性髓系白血病細胞的移植成功率，在移植15 d 后，腫瘤細胞依然可以正常存活。

相對于通過物理方式或化學藥物抑制斑馬魚免疫系統(tǒng)，直接構(gòu)建免疫缺陷突變體更具有應用前景。 2014 年，Tang 等［61］構(gòu)建了斑馬魚rag2E450fs突變體，該突變體缺乏成熟的功能性T 細胞，且B 細胞數(shù)量顯著減少，但其生存能力和繁殖能力基本不受影響。 不但造血干細胞、肌肉細胞等正常細胞可以在rag2E450fs突變體中穩(wěn)定存活，包括白血病細胞、橫紋肌肉瘤細胞以及黑色素瘤細胞等多種腫瘤細胞同樣可在其體內(nèi)穩(wěn)定生長。

Prkdc基因編碼DNA 依賴性蛋白激酶催化亞基，其在DNA 非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）修復中發(fā)揮重要作用。 2016 年，Jung等［62］利用TALENs 技術(shù)敲除了斑馬魚prkdc基因，發(fā)現(xiàn)prkdc缺失突變體的V（D）J 重排缺陷，導致B 淋巴細胞和T 淋巴細胞分化停滯，該模型可用于移植人的多種腫瘤細胞。 2016 年，Sertori 等［63］發(fā)現(xiàn)敲降斑馬魚白細胞介素-2 受體γ 鏈基因il2rga會影響幼魚早期T 淋巴細胞的成熟，但不會影響B(tài) 細胞的成熟，且敲降下游酪氨酸激酶編碼基因jak3 會出現(xiàn)類似的結(jié)果。 2022 年，Sertori 等［64］和Basheer等［65］分別利用TALENs 和CRISPR／Cas9 技術(shù)敲除了斑馬魚il2rga及jak3 基因，證實二者的缺失突變均可影響T 淋巴細胞及NT 細胞的成熟，將人結(jié)直腸癌細胞HCT116 移植到il2rga突變體中，18 d 后仍能觀察到大量的腫瘤細胞。

2019 年，Yan 等［10］在缺乏色素細胞的Casper品系的背景下構(gòu)建了prkdc及il2rga的雙敲除突變體，該品系同時缺失了T、B 及NT 細胞，通過馴化使其能夠適應37℃的飼養(yǎng)環(huán)境。 該品系不但可以用于構(gòu)建多種人類腫瘤細胞系移植模型，而且適用于構(gòu)建患者來源的腫瘤移植（PDX）模型。 通過病理學檢測發(fā)現(xiàn)，該模型中腫瘤細胞的生長動力學及組織學特征與移植到NSG 小鼠中十分相似。 2020 年，Lv等［11］構(gòu)建了foxn1／Casper突變體斑馬魚品系，其表現(xiàn)出T 細胞缺陷，允許包括造血干細胞、肌肉等多種細胞類型的同種異體及異種移植，但其是否適用于人的腫瘤細胞移植尚未經(jīng)過驗證。

4 斑馬魚肝細胞癌模型的應用

HCC 是一種復雜的、異質(zhì)性較強的腫瘤，常常存在多種遺傳變異。 這些變異會導致細胞信號網(wǎng)絡調(diào)控異常，觸發(fā)肝細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和增殖。 斑馬魚的遺傳背景及肝結(jié)構(gòu)與人類高度相似，且易于進行轉(zhuǎn)基因和基因突變等功能研究，是研究HCC 發(fā)生發(fā)展具體機制以及開發(fā)HCC 新療法的良好模型。基于斑馬魚開發(fā)的HCC 模型存在但不限于以下4個方面的應用。

第一，斑馬魚HCC 模型可用于評估相關(guān)物質(zhì)的致癌能力。 4-氨基聯(lián)苯（4-ABP）是一種人類致癌物，會引起DNA 氧化損傷，抑制DNA 修復。 2022 年，Lin等［66］用Tg（fabp10a：HBx，src，p53－／－）斑馬魚HCC模型，發(fā)現(xiàn)低劑量反復暴露于4-ABP 可激活肝中Ras-ERK 通路，誘導或促進肝細胞癌的發(fā)生。

第二，通過構(gòu)建斑馬魚遺傳學HCC 模型可以進行HCC 的發(fā)病機制研究，挖掘新的治療靶點。 2019年，Yang 等［67］在TO（krasG12V）誘導型斑馬魚HCC模型的背景下敲除了瘦素受體基因lepr，發(fā)現(xiàn)敲除lepr的斑馬魚經(jīng)誘導HCC 后的存活率顯著提高，且肌肉萎縮的水平顯著降低，提示瘦素信號可作為HCC 患者肌肉萎縮的一個新的治療靶標。

第三，斑馬魚HCC 模型可用于評估藥物對肝癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響，進行藥物篩選。 斑馬魚模型是高通量的體內(nèi)研究模型，可以將腫瘤新藥的體外實驗和體內(nèi)實驗相結(jié)合，提高臨床前藥物開發(fā)的成功率，降低篩選過程所需的時間和成本。 二甲雙胍（metformin）是治療糖尿病的一種藥物，de Oliveira等［68］利用Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚模型發(fā)現(xiàn)，高脂飲食會促進HCC 的進展，而二甲雙胍可以調(diào)節(jié)肝微環(huán)境中的免疫應答，進而抑制飲食誘導的NASH 相關(guān)HCC 進展。

第四，利用斑馬魚構(gòu)建患者來源的腫瘤細胞移植模型，可加快精準醫(yī)療的進程。 體外培養(yǎng)的腫瘤細胞系容易丟失腫瘤異質(zhì)性和原發(fā)性腫瘤的基因特征，而PDX 模型使用患者來源的腫瘤細胞，可以保留原代腫瘤的大部分特征，具有較為精確的臨床療效預測性。 2022 年，Ali 等［69］構(gòu)建了39 例非小細胞肺癌患者的斑馬魚PDX 模型，并測試了其對埃羅替尼及紫杉醇等藥物的響應情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該模型不但可以在3 d 內(nèi)給出準確的療效評估，還可以準確預測腫瘤細胞的淋巴管轉(zhuǎn)移。

5 總結(jié)與展望

肝細胞癌是一種原發(fā)性惡性腫瘤，早期診斷比較困難，患者化療效果較差，且其高復發(fā)、高轉(zhuǎn)移率的特點常導致患者預后不良。 因此，迫切需要開發(fā)并建立良好的HCC 動物模型用于新藥篩選及抗腫瘤藥效評估。 斑馬魚繁殖能力強、易于飼養(yǎng)、胚胎透明、體外發(fā)育、后天免疫系統(tǒng)成熟較晚、遺傳背景以及組織器官的發(fā)育與人類高度相似等優(yōu)點使其成為構(gòu)建各種人類疾病模型的良好模式生物。 通過在肝中過表達xmrk、HBx、myc、krasG12V等基因，結(jié)合米非司酮／四環(huán)素誘導系統(tǒng)或Cre-loxP 系統(tǒng)，已經(jīng)建立了多種組成型或誘導型斑馬魚HCC 模型［7，36，43，49］。 斑馬魚后天免疫系統(tǒng)在30 d 左右才發(fā)育成熟，且目前基于Casper背景已開發(fā)出多種免疫缺陷突變體，利用斑馬魚進行腫瘤細胞移植，甚至構(gòu)建PDX 模型用于腫瘤精準治療已成為可能［10－11，69］。 構(gòu)建斑馬魚HCC 模型已經(jīng)成為研究肝細胞癌發(fā)生發(fā)展機制、開發(fā)新的治療靶點以及進行新藥篩選的強有力手段。

盡管利用斑馬魚HCC 模型已經(jīng)取得了許多研究進展，但該模型仍存在一定的局限性。 第一，斑馬魚肝與人類肝雖然功能相似，但結(jié)構(gòu)上存在一定的差異。 例如，斑馬魚肝中不存在Kupffer 細胞，且門靜脈、肝動脈和大膽管在肝實質(zhì)內(nèi)隨機分布，不像哺乳動物肝那樣歸為門管區(qū)。 因此，在今后的研究中需更加關(guān)注斑馬魚肝的微結(jié)構(gòu)，明確其功能分區(qū)或異質(zhì)性，以更加準確地模擬人類HCC。 第二，斑馬魚的肝很小，可用于實驗分析的組織較少。 這就要求研究人員需要充分整合優(yōu)化現(xiàn)有技術(shù)或者開發(fā)出更加精確、可針對微量樣本的新技術(shù)進行相關(guān)指標的檢測。 第三，在斑馬魚中，基于抗體的檢測結(jié)果有時無法重復驗證。 這可能是因為能夠識別斑馬魚抗原的抗體十分有限，而在一些研究中使用了非斑馬魚特異性的抗體來進行檢測。 因此，持續(xù)開發(fā)斑馬魚特異性的抗體仍然是一項任重道遠的任務，聯(lián)合相關(guān)企業(yè)進行共同開發(fā)或許會更快解決制約斑馬魚研究發(fā)展的這一瓶頸。

斑馬魚HCC 異種移植模型存在以下問題亟待優(yōu)化：首先，斑馬魚適宜的飼養(yǎng)溫度是28.5℃，這與人體生理溫度有較大差距，腫瘤細胞在斑馬魚體內(nèi)的增殖速度和組織學特征亦與人類不完全相同。當前的大部分研究都是在非生理溫度下進行的，因此將斑馬魚馴化至適應37℃飼養(yǎng)環(huán)境或許能夠更好地模擬HCC 細胞的生存條件；其次，斑馬魚血管無法完全模擬人HCC 的動脈血供應。 目前，通過生化／顯微成像／免疫學分析可以模擬HCC 細胞發(fā)育的微環(huán)境特征，但尚無有效手段模擬HCC 的動脈樣供血。 因此，在進行HCC 血管生成相關(guān)研究時，建議使用至少2 種細胞系，以提高研究結(jié)論的準確性。最后，斑馬魚HCC 異種移植的注射部位通常是胚胎卵黃囊或成魚腹腔，而非肝。 這使得HCC 細胞在非肝環(huán)境中生長，無法排除斑馬魚體內(nèi)其他因素的干擾，實驗結(jié)論的可靠性有待提升。 因此，如何改善實驗技術(shù)，實現(xiàn)斑馬魚肝腫瘤細胞原位移植是值得相關(guān)研究者關(guān)注的重點方向之一。