蔡昕瑤 陳瑤 陳詩淇 郁潔 雷曉明

1. 湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院,湖南 長沙 410208

2. 湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿與康復學院,湖南 長沙 410208

3. 湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院血管生物學與轉化醫(yī)學湖南省重點實驗室,湖南 長沙 410208

骨質疏松癥(osteoporosis, OP)是一種骨代謝障礙的慢性疾病,以骨量流失,骨組織內部結構被打亂,骨單位遭到破壞,骨脆性增加甚至并發(fā)骨折為主要特征[1]。女性絕經后雌激素水平下降,成骨細胞(osteoblast,OB)介導的骨形成活動和破骨細胞 (osteoclast, OC)介導的骨吸收活動平衡被打破,出現腰背疼痛,骨量下降,骨質流失等骨質疏松癥的表現[2]。各種酶、炎癥、內分泌以及機械刺激信號調控著破骨細胞活動,促使溶骨作用增強,骨吸收活動呈現高活躍狀態(tài)[3]。研究表明絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)的發(fā)病與骨重建活動中骨轉換率升高密切相關,而核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)-核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)調控破骨因子使其在溶骨效應中發(fā)揮重要作用[4]。成骨細胞所表達的RANKL與其受體RANK相結合,誘導破骨細胞的成熟分化[5]。RANKL/RANK信號失調將導致破骨活動增強,影響骨代謝[5]。因此阻斷RANKL/RANK信號通路抑制破骨因子過度活躍,改善骨耦聯代謝失衡是防治PMOP的重要舉措。

中醫(yī)認為PMOP病機主要為腎虛,壯骨止痛方由7味補腎中藥構成,課題組前期實驗研究及醫(yī)院治療中的使用過程證實壯骨止痛方具有促進成骨分化、促進骨形成、增加骨密度的療效,對于防治PMOP具有顯著作用[6]。但壯骨止痛方通過調控破骨細胞活動發(fā)揮抗PMOP的具體機制尚不明確,因此本研究的目的是研究壯骨止痛方對去勢大鼠骨組織破骨因子血清水平和蛋白表達的影響,進一步探索壯骨止痛方調控CTSK、RANK、TRAP等破骨因子干預PMOP的部分具體療效機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物:SPF級3月齡體質量220～280 g雌性SD大鼠40只,授權于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心向湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購買,放置在湖南中醫(yī)藥大學清潔級動物實驗中心飼養(yǎng),飼養(yǎng)中心許可證號:SCXK(湘)2019-0009,動物批號:SCXK(湘)2019-0004,采用普通飼料喂養(yǎng),飼料由動物中心統一購置,環(huán)境溫度18～24 ℃,濕度40 %～60 %,模擬12 h晝/夜循環(huán)照明,分籠飼養(yǎng)。保持籠舍潔凈,及時換新潔凈墊料,大鼠可以在籠舍內自由活動、攝取食物、飲水。本研究所有動物實驗設計和操作流程符合動物倫理的要求,獲動物實驗倫理委員會批準,倫理編號:LL202205250。

1.1.2主要儀器:珀金埃爾默股份有限公司Quantum GX型小動物顯微CT(美國);Rayto,RT-6100型多功能酶標儀;盧湘儀離心機儀器有限公司TGL16M臺式高速冷凍離心機(中國 上海);賽默飛世爾科技有限公司HM325型石蠟切片機;麥克奧迪電氣股份有限公司BA410E 型顯微鏡。

1.1.3主要藥品及試劑:壯骨止痛方由枸杞子、淫羊藿、骨碎補、女貞子、懷牛膝、補骨脂、狗脊7味中藥構成,上述所有中藥在湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房購買;拜耳醫(yī)藥保健有限公司規(guī)格為1 mg/片 戊酸雌二醇,批號:J20171038;戊巴比妥鈉,批號:20200422產自美國默克公司;青霉素鈉,批號:F9102109由華北制藥股份有限公司生產;RANKL ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司,批號:20221101-30267A)E2ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司,批號:202201101-30432A)。EDTA慢速脫鈣液 (Servicebio);兔抗大鼠抗體RANK (Immunoway YT5881);兔抗大鼠抗體TRAP (愛博泰克A0962);兔抗大鼠抗體CTSK(愛博泰克A5871);電鏡固定液(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號:G1102)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及模型建立:40只SD大鼠按照完全隨機原則,分為ZGZTF組、EV組、OVX組、SHAM組,每組10只。各組均采用國內外常用造模方法建立絕經后骨質疏松癥病理模型[7],SHAM組摘除同等體積脂肪。現配2 %戊巴比妥鈉溶液,按照0.4 mL/100 g對大鼠進行腹腔注射。將麻醉好的大鼠固定于鼠板,摘除雙側卵巢后進行縫合,碘伏消毒傷口防治大鼠互相撕咬,造模后3 d為防術后感染從大鼠后腿注射4萬U青霉素。

1.2.2藥品制備:將所有中藥放入煎藥灌中浸泡1 h,武火煮沸后改文火繼續(xù)煎煮1 h,將煎煮所得藥液倒出,加入與第一次煎煮同等體積蒸餾水繼續(xù)煎煮1 h,將兩次所得藥液攪拌混合,所得混合液按照生藥含量6.6 g/kg 濃縮,待中藥藥液冷卻后放入冰箱冷藏。

1.2.3給藥方法:手術1周后給予藥物灌胃,1次/d,連續(xù)給藥12周。ZGZTF組灌胃6.6 g/kg生藥量的中藥藥液,EV組灌胃劑量體表面積換算公式按照絕經后女性體重水平來確定(成人劑量×60 kg×0.018/0.2 kg),余下各組灌胃相應體積的蒸餾水。

1.2.4Mirco-CT檢測股骨骨微結構和骨密度:每組隨機選取3個樣本,剔除右側股骨表面多余結締組織后應用顯微CT從生長版最高點以下1 mm位置往下數50層的骨小梁進行平掃。掃描模式為:掃描電壓90 kV,掃描電流為88 μA,360 °旋轉掃描,掃描持續(xù)14 min,分辨模式為90 u,掃描結果采用Analyze12.0分析。

1.2.5HE檢測骨組織病理形態(tài):取左側脛骨,置于4 %多聚甲醛中浸泡1周,在EDTA脫鈣液中浸泡2個月,每4～6天更換脫鈣液。經脫水、包埋、切片、封片、染色后用顯微鏡觀察骨小梁結構。

1.2.6掃描電鏡檢測骨組織骨小梁超微結構:將大鼠左側脛骨的肌肉組織剔除,保留完整脛骨組織和骨膜,用濃度為 0.1 %的磷酸緩沖液對脛骨進行清洗,采用2.5 %戊二醛溶液固定,隨后用叔丁醇梯度脫水,置于-10 ℃冰凍,干燥。導電膠固定標本后將金屬材料噴涂于骨組織表面,使用掃描電子顯微鏡觀察孔隙內骨組織及纖維組織生長情況。

1.2.7ELISA檢測血清E2、RANKL水平:終末取材時,按照0.4 mL/100 g的劑量給各組大鼠注射2 %戊巴比妥鈉麻醉,注射方式為腹腔注射,腹主動脈采血,靜置2 h,3 000 r/min離心15 min后分離血清,采用雙抗夾心技術對大鼠血清中E2、RANKL水平進行測定,用酶標儀測定各組在450 nm波長時的吸光值,對數據進行統計學分析。

1.2.8免疫組化檢測RANK、TRAP、CTSK蛋白表達:取左側脛骨,置于4 %多聚甲醛中浸泡1周,在EDTA脫鈣液中浸泡2個月,每4～6天更換脫鈣液。經過脫水、透明、切片后,滴加一抗進行孵育,室溫過夜。PBS清洗3次,滴加二抗,室溫中靜置1 h,顯色后終止反應,顯微鏡下觀察切片視野,采用Image Pro Plus 6.0 圖像分析處理軟件對RANK、TRAP、CTSK蛋白的IOD進行比較分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 壯骨止痛方對大鼠骨微結構和骨密度的影響

與SHAM組相比,OVX組股骨骨密度值顯著下降,骨質流失嚴重,差異具有顯著性,差異有統計學意義(P<0.05)。與OVX組相比,給藥后ZGZTF組股骨骨密度增加,但差異無統計學意義。

表1 各組大鼠骨組織骨密度差異

注:與SHAM組相比,#P<0.05。

2.2 壯骨止痛方對大鼠骨組織病理形態(tài)改變的影響

顯微鏡下,SHAM組脛骨骨小梁排列整齊,連續(xù)性好,鏡下可見大量骨細胞。與SHAM組比較,箭頭所指處可明顯看到OVX組脛骨骨小梁結構紊亂,連續(xù)性中斷,骨髓腔變寬,骨小梁間隔變大,結構嚴重缺失,鏡下可見骨髓腔內有大量脂肪空泡。與OVX組相比,ZGZTF組脛骨骨組織形態(tài)有不同程度的改善,骨小梁增多,連續(xù)性稍恢復,骨髓腔減小,脂肪空泡減少。

2.3 壯骨止痛方對大鼠骨小梁超微結構的影響

SHAM組大鼠脛骨骨小梁數目較多,骨小梁表面膠原纖維排列緊密,骨小梁壁厚且均勻,形態(tài)大小對稱,連接性好,形成立體的網狀結構。OVX組大鼠脛骨骨小梁網狀結構遭到破壞,骨小梁數目減少,間距增大,骨小梁變細且厚薄不均。小梁表面骨膠原纖維排列紊亂,粗細不均。與OVX組相比,ZGZTF組脛骨骨小梁數目增多,立體網狀結構有所改善,但與SHAM組比較骨小梁數目仍然較少,間距仍然較大。

圖3 各組大鼠骨組織骨小梁病理形態(tài)學檢測結果(100×)

圖4 各組大鼠骨組織電鏡掃描圖(100×)

2.4 壯骨止痛方對大鼠血清E2、RANKL水平的影響

與SHAM組相比,OVX組血清中E2顯著下降,RANKL水平顯著升高,差異具有統計學意義(P<0.05)。與OVX相比,ZGZTF組血清中E2水平升高,RANKL水平降低(P<0.05)。ZGZTF組血清E2和RANKL表達水平與SHAM組相比差異無統計學意義(P>0.05)。ZGZTF組和EV組血清中E2、RANKL水平差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 壯骨止痛方對去勢大鼠血清E2、RANKL影響的比較

注:與SHAM組比較,#P<0.01;與OVX組比較,&P<0.01。

2.5 壯骨止痛方對大鼠脛骨RANK、TRAP、CTSK蛋白表達的影響

與SHAM組比較,OVX組脛骨骨組織中RANK、TRAP、CTSK蛋白表達顯著上升,表達較高,差異具有統計學意義(P<0.05);與OVX組相比,ZGZTF組脛骨骨組織中RANK、TRAP、CTSK蛋白表達明顯下降,差異具有統計學意義(P<0.05);ZGZTF組和EV組陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6、圖7。

注:與SHAM組比較,#P<0.05;與OVX組比較,&P<0.05。

3 討論

中國作為人口老齡化大國,OP的高發(fā)病率和高骨折率對社會造成了嚴重的負擔,導致了沉重的經濟負擔[8]。研究表明我國OP的總患病率為6.6 %～19.3 %[9],第七次全國人口普查數據顯示我國50歲以上人群骨質疏松癥患病率為19.2 %,其中女性為 32.1 %[10]。中醫(yī)學無OP病名,根據臨床表現認為其屬于“骨痿、骨痹”范疇,腎主骨生髓,在骨生長發(fā)育中起重要作用[11],傳統中醫(yī)學理論認為OP主要發(fā)病病機是腎精不足骨髓失于濡養(yǎng)[12]。

壯骨止痛方是莫新民教授創(chuàng)制的經驗方,于2005年獲得國家新藥證書,該方由7味補肝益腎中藥構成,方中補骨脂歸腎脾兩經,有溫腎陽補脾陽之功效,是為君藥。臣以淫羊藿益筋骨補命門,使筋骨自堅時亦可助君藥補腎[13]。補骨脂和淫羊藿配伍歸入肝經、腎經,發(fā)揮壯骨補腎強腰膝的作用,治療腎陽不足肝腎虧損[14]。牛膝和骨碎補逐瘀通經、通經活絡,使補中寓通,補而不滯,枸杞女貞補肝腎陰精,陰中求陽,諸藥配伍陰陽肝腎并補,治療PMOP[15]。補骨脂發(fā)揮雌激素樣作用逆轉骨組織Leptin啟動子高甲基化,從而抑制破骨基因的表達[16]。淫羊藿的主要化學成分之一是黃酮類化合物,在治療PMOP中它可以發(fā)揮抑制破骨細胞活動,促進成骨細胞增殖分化的作用[17]。研究表明骨碎補可能通過作用于氧分壓感傳信號通路上關鍵靶點HIF1ɑ抑制破骨細胞活動[18]。李曉曦等[19]研究發(fā)現女貞子與淫羊藿的配伍組合可以上調TGF-β1/Smad信號通路骨保護性相關蛋白起到抗OP的作用。

本研究中采用手術去卵巢方法構建PMOP的病理模型,骨質流失和骨小梁結構的改變均證實PMOP病理模型構建成功[20]。給予壯骨止痛方干預之后,去勢大鼠骨微結構改善,表明壯骨止痛方可以抑制破骨細胞關鍵因子從而調控骨代謝。

破骨細胞主要受到細胞因子RANKL的調節(jié),RANKL對于維持骨穩(wěn)態(tài)具有關鍵作用,在骨質疏松病理性骨吸收中發(fā)揮核心作用[21]。調控破骨細胞的分化和功能一直是防治PMOP的熱門話題。RANKL和RANK結合后募集TRAF-6激活下游MAPK和NF-κB信號通路,活化NFATc1,NFATc1等轉錄因子發(fā)揮協同作用實現破骨基因表達[22]。而MAPK信號通路通過調節(jié)下游轉錄因子調控組織蛋白酶K吸收骨基質降解骨,促進骨吸收[23]。MAPK信號通路上調后可激活NF-κB信號通路影響骨吸收,此外細胞因子及誘導物刺激NF-κB后可以調節(jié)氧化應激反應及炎癥介質的表達,從而調控骨吸收活動[24]。另外RANKL和RANK結合還會影響細胞內Ca2+波動誘導破骨細胞分泌CTSK和基質金屬蛋白酶及TRAP等破骨特異性因子[25]。

CTSK是破骨細胞中溶骨性最強的關鍵酶,其變異或過表達是會增加PMOP的發(fā)病率及骨折的發(fā)生風險[26],因此抑制CTSK的表達在一定程度上可以起到骨保護的作用。TRAP是酸性磷酸酶同功酶中的第5型,作為特異性標志酶,在一定程度上可以檢驗破骨細胞分化成熟與否,可以調節(jié)破骨細胞對骨基質的吸收[24]。TRAP可以通過水解破骨細胞的磷酸醋酶起到破壞細胞基質的作用[27],TRAP的表達異常會影響骨重建平衡。研究表明淫羊藿可以抑制CTSK降解骨質的活性[28],而補骨脂可以競爭性結合CTSK的活性位點降低CTSK于膠原端肽區(qū)相互作用[29]。補骨脂亦可發(fā)揮雌激素樣作用,抑制TRAP降解骨基質固體鈣磷化合物,抑制骨陷窩形成從而降低破骨細胞溶骨活性[30]。

本研究探明壯骨止痛方對破骨細胞活動影響的部分機制,RANKL/RANK信號通路在破骨細胞及骨吸收活動中起激動作用,激活RANKL/RANK通路后,CTSK、TRAP作為下游重要因子可促進破骨細胞分化增殖。而壯骨止痛方可以抑制RANKL/RANK激活下游MAPK、NF-κB信號通路的作用,減少RANKL/RANK通路上破骨因子蛋白陽性表達,使骨重建失衡得到一定程度的恢復,起到治療PMOP的作用。但本研究具有一定的局限性,僅進行了體內研究,壯骨止痛方調控PMOP破骨活動具體機制復雜,未來研究中將結合體外實驗,深入驗證壯骨止痛方的作用機制。