樸海旺 金寶城 趙勝軍

承德市中心醫(yī)院骨二科,河北 承德 067000

骨是一種由有機基質(zhì)礦化而不斷形成的再生組織,成骨細胞和破骨細胞參與骨平衡的構(gòu)建[1-2]。而破骨細胞和成骨細胞形成和功能的不平衡導致了許多骨疾病,如骨質(zhì)疏松癥[3]。骨質(zhì)疏松癥是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病,可引起骨折[4]。五味子為臨床常用中藥,具有補腎養(yǎng)肺、生津止咳、保肝護肝、有助睡眠等功效[5]。五味子甲素是五味子的果實提取物,研究表明,五味子甲素能抑制Toll樣受體4/核因子κB通路,降低潰瘍性結(jié)腸炎大鼠炎癥因子水平及腸道黏膜通透性,保護大鼠結(jié)腸組織[6]。五味子甲素同時也具備良好的抗腫瘤活性,能對腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移起到抑制作用,且五味子甲素能增強化療敏感性,在協(xié)同抗癌藥物治療方面能增強抗癌藥物的藥效[7]?；|(zhì)細胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)/CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)通路與成骨分化有著密切的聯(lián)系,有研究表明,SDF-1/CXCR4通路能夠通過介導Janus激酶2/信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子3通路的激活,參與骨髓間充質(zhì)干細胞的分化過程[8]。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)五味子具有抗骨質(zhì)疏松的效果,但這一效果是否是五味子甲素在發(fā)揮作用尚未可知。故本研究擬探討五味子甲素對骨質(zhì)疏松癥大鼠的作用效果,并分析SDF-1/CXCR4通路在這一過程中的作用,以期為治療骨質(zhì)疏松癥的新藥研發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物:SPF級別雌性SD大鼠,8～10周齡,體重242～268 g,購自江蘇珂瑪麒生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2021-0014,所有大鼠均飼養(yǎng)于室溫為20～25 ℃,相對濕度為50 %～70 %的飼養(yǎng)房中,自由取食、飲水,自動光照/黑暗交替(12 h/12 h)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準,審批號:基礎(chǔ)LS2022(043)。

1.1.2藥物與試劑:五味子甲素(批號MR39852,原料藥,純度≥98.8 %)、SDF-1/CXCR4通路抑制劑(AMD3100)(批號MF90184)購自湖南遠泰生物技術(shù)有限公司;阿侖膦酸鈉片(批號20210905)購自海南全星制藥有限公司;Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(CTX-Ⅰ)、骨鈣素(OC)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、HE染色試劑盒、BCA試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號分別為C23884、C39202、C20458、C59274、C10358)均購自青島中仁澳蘭生物工程有限公司;Trizol試劑、PCR試劑盒、蛋白裂解液、ECL發(fā)光液(批號分別為HAS0241、HAS3732、HAS1829、HAS5824)均購自深圳海思安生物技術(shù)有限公司;兔源SDF-1、CXCR4、GAPDH一抗、羊抗兔二抗(批號分別為SR00710、SR00529、SR10539、SR27481)均購自天津賽爾生物技術(shù)有限公司。

1.1.3儀器:雙能X射線骨密度儀(型號Dexa Pro-II)、酶標儀(型號Synergy2)、顯微鏡(型號moticBA210)、熒光定量PCR儀(型號m2000rt)均購自上海然哲儀器設(shè)備有限公司;離心機(型號TD-4W)、凝膠成像系統(tǒng)(型號CBIO-UV6)均購自上海聚慕醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1建模、分組及給藥:采用去卵巢法構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥大鼠模型[9]:SD大鼠禁食不禁水12 h后,戊巴比妥鈉麻醉,固定于手術(shù)臺上,下腹部備皮,沿下腹部正中線切口,打開腹腔,結(jié)扎雙側(cè)卵巢動脈,切除雙側(cè)卵巢組織及周圍少許脂肪組織,逐層縫合,消毒,抗生素預(yù)防感染。另取12只大鼠作為假手術(shù)組,手術(shù)過程中僅暴露卵巢不切除。手術(shù)12周后,采用雙能X射線骨密度儀分別測定造模及假手術(shù)組大鼠左、右股骨骨密度(BMD),以造模大鼠左、右股骨BMD值低于假手術(shù)組且有統(tǒng)計學意義視為造模成功[10]。取造模成功的60只大鼠按照隨機數(shù)表法分為模型組、五味子甲素低(20 mg/kg)、高(40 mg/kg)劑量組[11]、阿侖膦酸鈉(1 mg/kg)組[12]、五味子甲素高劑量+AMD3100(40 mg/kg+5 mg/kg)組[13],每組12只。

分組完成后,五味子甲素低、高劑量大鼠分別給予20 mg/kg、40 mg/kg五味子甲素灌胃給藥[11](將五味子甲素和生理鹽水混溶成濃度分別為2 mg/mL、4 mg/mL的混懸液,灌胃體積10 mL/kg);阿侖膦酸鈉組大鼠給予1 mg/kg阿侖膦酸鈉灌胃給藥[12](將阿侖膦酸鈉片和生理鹽水混溶成濃度為0.1 mg/mL的混懸液,灌胃體積10 mL/kg);五味子甲素高劑量+AMD3100組大鼠給予40 mg/kg五味子甲素灌胃,然后腹腔注射5 mg/kg的AMD3100[13];假手術(shù)組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃。各組給藥每天1次,連續(xù)12周。

1.2.2大鼠左、右股骨BMD的測定:給藥結(jié)束后,戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采用雙能X射線骨密度儀分別測定各組大鼠左、右股骨BMD。

1.2.3大鼠血清中CTX-Ⅰ、OC水平的測定:BMD檢測完成后,處死大鼠,心臟取血3 mL,分離大鼠雙側(cè)股骨組織,并分為兩部分,一部分用4 %多聚甲醛固定,另一部分置于-80 ℃冰箱中保存。將收集的血液樣品置于離心機中,4 ℃下5 800 r/min離心17 min,取上清,嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作方法及步驟,檢測上清液中CTX-Ⅰ、OC水平。

1.2.4大鼠股骨組織病理學變化:取1.2.3中固定于4 %多聚甲醛的大鼠股骨組織,脫鈣,石蠟包埋,切片(5 μm),HE染色,顯微鏡下觀察大鼠股骨組織病理學變化。

1.2.5大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4信使RNA(mRNA)水平的測定:取1.2.3中凍存大鼠股骨組織,加入液氮充分研磨,Trizol試劑提取股骨組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,熒光定量PCR法檢測大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平,內(nèi)參為GAPDH。引物由廈門侖昌碩生物科技有限公司設(shè)計合成,引物序列見表1。反應(yīng)體系參照PCR試劑盒進行配置,SDF-1、CXCR4 mRNA水平使用2-△△Ct法計算。

表1 引物序列

1.2.6大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平的測定:取1.2.3中凍存大鼠股骨組織,加入液氮充分研磨,蛋白裂解液裂解,4 ℃下9 000 r/min離心14 min,BCA試劑盒定量總蛋白,取20 μg總蛋白,電泳分離后轉(zhuǎn)膜,室溫下脫脂牛奶(5 %)封閉1 h,然后與稀釋好的兔源SDF-1(1∶530)、CXCR4(1∶820)、GAPDH(1∶950)一抗在4 ℃下過夜,加入羊抗兔二抗(1∶2 400),室溫孵育1 h,ECL試劑顯影,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,計算SDF-1、CXCR4蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 五味子甲素對骨質(zhì)疏松癥大鼠左、右股骨BMD的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠左、右股骨BMD顯著降低(P<0.05);與模型組相比,五味子甲素低、高劑量組大鼠左、右股骨BMD依次升高(P<0.05);與五味子甲素高劑量組相比,阿侖膦酸鈉組大鼠左、右股骨BMD差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),五味子甲素高劑量+AMD3100組大鼠左、右股骨BMD顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠左、右股骨BMD的比較

2.2 五味子甲素對骨質(zhì)疏松癥大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,五味子甲素低、高劑量組大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平依次升高(P<0.05);與五味子甲素高劑量組相比,阿侖膦酸鈉組大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),五味子甲素高劑量+AMD3100組大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平的比較

2.3 五味子甲素對骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨組織病理學變化的影響

假手術(shù)組大鼠股骨組織骨小梁結(jié)構(gòu)正常,排列規(guī)則;模型組大鼠股骨組織骨小梁稀疏斷裂,數(shù)量減少,排列紊亂;五味子甲素低、高劑量組大鼠股骨組織上述病理學變化程度依次減輕;阿侖膦酸鈉組與五味子甲素高劑量組大鼠股骨組織病理學變化無顯著差異;與五味子甲素高劑量組相比,五味子甲素高劑量+AMD3100組大鼠股骨組織病理損傷加重。見圖1。

圖1 各組大鼠股骨組織病理變化圖(HE染色,200×)

2.4 五味子甲素對骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,五味子甲素低、高劑量組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平依次升高(P<0.05);與五味子甲素高劑量組相比,阿侖膦酸鈉組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),五味子甲素高劑量+AMD3100組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平的比較

2.5 五味子甲素對骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,五味子甲素低、高劑量組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平依次升高(P<0.05);與五味子甲素高劑量組相比,阿侖膦酸鈉組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),五味子甲素高劑量+AMD3100組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖2、表5。

注:A:假手術(shù)組;B:模型組;C:五味子甲素低劑量組;D:五味子甲素高劑量組;E:阿侖膦酸鈉組;F:五味子甲素高劑量+AMD3100組。

表5 各組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平的比較

3 討論

骨質(zhì)疏松癥的特點是骨強度低,骨折風險高,骨折的發(fā)生也能導致嚴重臨床后果,包括疼痛、殘疾、喪失獨立性甚至死亡[14]。通常情況下,骨質(zhì)疏松癥通過測量BMD進行診斷,某些情況下,也可以通過脆性骨折或獨立于BMD的高骨折概率來診斷[15]。但骨質(zhì)疏松癥的治療較為復雜,通常情況下需要健康的生活方式和良好的營養(yǎng),預(yù)防跌倒,以及避免暴露于骨骼毒素和藥物治療[16]。CTX-Ⅰ是骨吸收過程中的產(chǎn)物,血液中CTX-Ⅰ的水平能反映骨吸收過程,同時也能反映骨細胞的活動情況。OC是一種非膠原蛋白,其水平變化能反映骨代謝的變化[17]。在骨質(zhì)疏松癥中,CTX-Ⅰ和OC水平的下降代表了骨代謝的失衡[18]。本研究通過去卵巢法構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥大鼠模型,結(jié)果顯示造模成功的大鼠左、右股骨BMD、血清中OC、CTX-Ⅰ水平顯著降低,病理學結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠股骨組織骨小梁結(jié)構(gòu)正常,排列規(guī)則;模型組大鼠股骨組織骨小梁稀疏斷裂,數(shù)量減少,排列紊亂。表明骨質(zhì)疏松癥大鼠模型構(gòu)建成功,股骨組織發(fā)生病變。

五味子甲素是五味子的主要活性成分,有抗炎、抗癌、抗病毒等作用[19]。耿峰等[20]研究表明,五味子甲素能顯著降低腹瀉型腸易激綜合征大鼠結(jié)腸組織中炎癥因子水平,改善大鼠腸上皮黏膜屏障功能。五味子的藥效廣泛,具有促進成骨細胞分化,維持骨平衡等作用,同時對于調(diào)控破骨細胞和保護軟骨組織方面均具有一定效果[21]。既往有研究顯示,五味子提取物可以改善骨質(zhì)疏松大鼠的骨強度和骨代謝,其機制是抑制破骨細胞骨吸收和增加成骨細胞分化的活性[22]。本研究使用五味子甲素處理骨質(zhì)疏松癥大鼠以探究五味子甲素在骨質(zhì)疏松癥中的作用,結(jié)果顯示,五味子甲素處理后的骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨組織病變程度減輕,大鼠左、右股骨BMD、血清中OC、CTX-Ⅰ水平升高,且五味子甲素劑量越高,改善效果越好。表明五味子甲素能抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠BMD的下降,改善大鼠骨質(zhì)疏松,結(jié)合姜南希等[21]的研究,猜測這可能與五味子甲素能維持骨平衡有關(guān)。

SDF-1/CXCR4信號通路參與多種器官病理生理過程,還與細胞分化等過程密切相關(guān)[23]。石新慧等[24]研究表明,瑞芬太尼能通過抑制SDF-1/CXCR4信號通路,減輕氣腹大鼠腎損傷。Wang等[25]報道,柚皮素可促進SDF-1/CXCR4信號通路活化,從而增強骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。SDF-1/CXCR4通路在骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用,鄂遠等[26]研究發(fā)現(xiàn),補腎活血湯能通過激活SDF-1/CXCR4通路,加速骨質(zhì)疏松骨折大鼠的骨折愈合,促進骨形成。本研究發(fā)現(xiàn),骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白水平顯著低于健康大鼠;經(jīng)五味子甲素處理后,骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白水平顯著升高,且呈現(xiàn)劑量依賴性。在高劑量五味子甲素的基礎(chǔ)上給予AMD3100干預(yù)后發(fā)現(xiàn),AMD3100可逆轉(zhuǎn)高劑量五味子甲素對骨質(zhì)疏松癥大鼠上述指標的改善效果。結(jié)合Wang等[25]和鄂遠等[26]研究結(jié)果,本研究認為五味子甲素對骨質(zhì)疏松癥大鼠的治療作用,其機制可能與激活SDF-1/CXCR4信號通路有關(guān),SDF-1/CXCR4通路表達增強會促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化,改善骨質(zhì)疏松癥狀。

綜上所述,五味子甲素能抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠BMD的下降,減輕大鼠股骨組織病變,改善大鼠骨質(zhì)疏松,這一機制可能通過激活SDF-1/CXCR4信號通路來實現(xiàn)。但本研究僅探究了五味子甲素通過SDF-1/CXCR4信號通路對骨質(zhì)疏松癥大鼠的保護作用,五味子甲素能否通過其他通路發(fā)揮對骨質(zhì)疏松癥大鼠的治療作用,有待深入研究。