繆伊雯，白 菲，童華榮*

（西南大學食品科學學院，重慶 400715）

茶（Camellia sinensisL.）屬山茶科山茶屬，原產(chǎn)于中國的常綠灌木，是世界上最受歡迎的無酒精飲料之一[1-3]。中國已有千年的飲茶史，2020年我國茶葉產(chǎn)量高達297萬 t[4-5]。茶葉按照加工工藝分為六大類，其中綠茶加工工藝較簡單，有效保留了其鮮葉所含的天然物質(zhì)，在中、日、韓等國備受歡迎；白茶、黃茶和烏龍茶是中國特有茶類，主要在中國產(chǎn)銷；紅茶是一種酶促發(fā)酵的全發(fā)酵茶，在亞洲和歐洲備受歡迎，在全世界銷量位居第一；黑茶則是一種由酶、微生物和濕熱加工條件三者綜合作用的后發(fā)酵茶，主產(chǎn)于中國西南部地區(qū)[6]。茶葉因具有多種保健功能而深受大眾的喜愛，然而有毒化學物質(zhì)污染可能會削弱茶葉的健康作用[2,7]。如今，茶葉質(zhì)量安全已日益引起關注，其中與霉菌毒素相關的風險評估是當前學界與大眾所關注的熱點[8]。茶葉在種采、加工和流通等環(huán)節(jié)中極易受到霉菌侵染，其中產(chǎn)毒菌在適宜的條件下會產(chǎn)生霉菌毒素，人類通過飲用茶湯可能會存在霉菌毒素膳食暴露的風險[9-10]。

霉菌毒素主要是由曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、鏈格孢屬（Alternaria）和鐮刀菌屬（Fusarium）等特定霉菌在適宜的產(chǎn)毒條件下產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，經(jīng)口、皮膚或呼吸道等途徑吸收時會導致機體機能下降、生病或死亡，是世界范圍內(nèi)食品和飼料中最常見的污染物，如黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）曾被美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）評價為食品中不可避免的污染物[11-12]。

如今，發(fā)達國家相繼要求對茶葉進行微生物項目檢驗，這無形中增加了我國茶葉出口貿(mào)易的技術性貿(mào)易壁壘，使茶葉產(chǎn)業(yè)陷入十分被動的局面[13]。中國食品土畜進出口商會所編寫的《出口商品技術指南-輸歐茶葉》也曾指出，茶企有必要關注茶葉中存在的霉菌毒素風險，以應對發(fā)達國家的技術法規(guī)、標準和合格評定程序的復雜多變[14]。因此，世界各國衛(wèi)生部門加強對霉菌毒素的監(jiān)督是大勢所趨，而茶葉中霉菌毒素的控制、分析檢測仍然是目前學術界研究的熱點。本文對茶葉中霉菌毒素的來源、種類及危害進行了簡述，對茶葉中霉菌毒素污染現(xiàn)狀進行了總結(jié)，探討了相關檢測技術的優(yōu)缺點，并對茶葉中霉菌毒素的防控措施進行了展望，旨在為茶葉質(zhì)量控制提供參考。

1 茶葉中霉菌毒素的來源

目前，全球范圍內(nèi)被認定的霉菌毒素已超過400 種[15]。茶葉加工的周期長短不一且步驟多樣導致其在任何階段可發(fā)生霉菌侵染，如種采、加工與流通等環(huán)節(jié)[2]。如圖1所示，霉菌侵染的影響因素和發(fā)生污染的概率存在差異，其中茶葉的特性和貯藏條件又會進一步影響霉菌的產(chǎn)毒能力，而茶葉中霉菌毒素殘留會影響茶葉的品質(zhì)和貿(mào)易，并對人類構(gòu)成潛在的健康風險。因此，掌握霉菌侵染茶葉的途徑可有效改善茶葉中霉菌毒素污染[16-17]。

圖1 中國6 種典型茶類的生產(chǎn)流程、霉菌侵染的風險程度與影響因素Fig.1 Production process of six kinds of typical Chinese tea, degree of risk of mold contamination, and its influential factors

1.1 種采環(huán)節(jié)

氣溫20～30 ℃、土溫25～30 ℃、酸性土壤且最大持水量80%～90%的環(huán)境有利于茶樹生長發(fā)育，但溫暖濕潤的環(huán)境也為霉菌定植和產(chǎn)毒提供了最佳條件[6]。當前，茶葉中常見的霉菌包括曲霉屬、青霉屬、鏈格孢屬、鐮刀菌屬、散囊菌屬（Eurotiumsp.）和根霉屬（Rhizopusspp.）等[2]。青霉屬、鐮刀菌屬是田間霉菌，可能存在于茶樹種植區(qū)的空氣、土壤、水源和肥料中，并在茶樹的生長和采收過程中附著于鮮葉上并帶入后續(xù)加工中。此外，采收環(huán)節(jié)中工作人員與容器的衛(wèi)生情況則會進一步影響霉菌污染茶葉的程度[2,6]。

目前，在世界上主要的茶葉生產(chǎn)國中，中國和印度地處亞熱帶氣候，這也直接導致中印兩國是受霉菌毒素影響最嚴重的國家[2]。在針對中國的六大茶類的霉菌毒素檢測中均發(fā)現(xiàn)了不同程度的霉菌毒素感染情況，其中，產(chǎn)自拉脫維亞的綠茶和黑茶中檢測出的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和T-2毒素（T-2 toxin，T-2）通常是由田間霉菌入侵而產(chǎn)生的[17-18]。雖然曲霉屬歸屬于倉貯性霉菌，但在日本茶園的27 份酸性土壤中也分離出57 株黃曲霉屬真菌[19]，王鷺等[20]則在日本綠茶中檢出黃曲霉毒素B2（aflatoxins B2，AFB2）（4.40 μg/kg），這表明在茶葉的生產(chǎn)實踐中，茶葉所受到的侵染菌和產(chǎn)毒菌是多樣的，且存在污染擴散的情況。

1.2 加工環(huán)節(jié)

茶葉鮮葉的水分質(zhì)量分數(shù)約為75%，蛋白含量較低，含有可溶性糖，加工成干毛茶后水分質(zhì)量分數(shù)降至2%～10%不等，可被多種來自環(huán)境或自帶的潛在產(chǎn)毒霉菌侵染[21-22]。Dutta等[23]從茶廠的空氣、葉際和土壤樣本中分離出34 種霉菌，包括產(chǎn)生霉菌毒素的黑曲霉（A.niger）、黃曲霉（A.flavus）、煙曲霉（A.fumigatus）和乳酸鐮刀菌（Fusarium lactis）。此外，霉菌的繁殖能力較強，所產(chǎn)的霉菌孢子可以通過原料、空氣、生產(chǎn)用水、工具等媒介侵入茶樣并在條件適宜時萌發(fā)繁殖，對茶樣造成進一步污染[24]。

不同的茶類具有不同的加工工藝，造成各大茶類霉菌侵染的影響因素和發(fā)生污染的概率存在差異[2,24]。綠茶被認為是加工過程中受污染風險最小的茶類，這主要與綠茶加工步驟簡單、周期短及干茶水分質(zhì)量分數(shù)低（4.64%～9.73%）密切相關[2,25]，但目前也有研究報道了綠茶中感染AFB2、黃曲霉毒素G1（aflatoxins G1，AFG1）、互隔交鏈孢酚（alternariol，AOH）、恩鐮孢菌素B（enniatin B，ENN B）、騰毒素（tentoxin，TENT）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等毒素的案例。其中，AOH（1.70～5.90 μg/kg）、TENT（4.60 μg/kg）和HT-2毒素（HT-2 toxin，HT-2）（5.58 μg/kg）僅在綠茶樣品中有報道[16-17]，赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）在綠茶的袋泡茶（0.01～19.96 μg/kg）、茶湯（0.10～0.80 ng/L）和散茶（0.54～20.35 μg/kg）中均有檢出[26-27]。此外，研究人員認為綠茶受到霉菌毒素污染風險較低，與其富含的多酚類化合物具有一定的抗菌作用密切相關[6,24]。

同樣，作為加工步驟較少的白茶，也被認為是受污染較少的茶類，截至目前僅有2 例報道，在西班牙樣品中檢出了OTA、AFs、ZEN、T-2、DON和桔青霉素（citrinin，CIT），其中DON高達259.10 μg/kg[28]。在中國的13 個白茶樣品中檢出的棒曲霉素（patulin，PAT）含量最高可達10.90 μg/kg，而此前針對PAT的關注更多是在水果及其制品中[29]，這表明隨著科學技術的發(fā)展，越來越多研究人員開始重視在其他食品類別中存在的霉菌毒素在茶葉中的檢出情況。黃茶需要在高濕高溫的條件下進行悶黃，可為霉菌的繁殖及產(chǎn)毒提供條件[30]，針對黃茶的研究僅在Li Hai等[29]報道的7 份黃茶樣品中檢出PAT（＜2.90 μg/kg），究其原因可能是黃茶本身的產(chǎn)銷量較少，在全球的消費群體數(shù)量少于其他茶類，但隨著人類對健康的關注程度不斷提高，當前對于茶葉的風險評估正在逐步擴大試驗茶樣的范圍。青茶在工序上采用的毛火溫度高、烘焙時間長，所制成的茶水分質(zhì)量分數(shù)為4%～7%，因此，青茶受到的霉菌侵染較少，可能是因為在此過程中不耐高溫的霉菌毒素會發(fā)生降解，從而降低霉菌毒素的含量[6]。至今，僅在中國所產(chǎn)銷的青茶樣品中檢出黃曲霉毒素B1（aflatoxins B1，AFB1）（34 μg/kg）[31]、AFB2（5.76 μg/kg）[20]和PAT（＜21.40 μg/kg）[29]。

紅茶作為一種全發(fā)酵茶，其在揉捻時各種營養(yǎng)物質(zhì)外溢增多，有利于霉菌菌絲和孢子大量繁殖，同時，霉菌代謝產(chǎn)生蛋白酶和氨基酸脫羧酶，分解后會產(chǎn)生臭味，影響紅茶的品質(zhì)[32]。和青茶一樣，高溫干燥可以有效降低紅茶中部分不耐高溫的霉菌毒素的含量。

AFs[17,20,27,33]和OTA[17,26-27,31,34]是在紅茶中檢出率最高的2 類霉菌毒素，這主要是因為AFs和OTA的熔點較高，分別為269 ℃和169 ℃，且針對AFs和OTA的檢測技術最為成熟，研究者關注度較高[24]。伏馬毒素B1（fumonisin B1，F(xiàn) B1）是紅茶中檢出的含量最高的霉菌毒素，可達280 μg/kg，這可能與FB1熱穩(wěn)定性強，且具有水溶性有關[35]。

以微生物后發(fā)酵為主的黑茶是如今受污染和研究最多的一類茶葉[36]。黑茶的渥堆發(fā)酵主要是在炎熱潮濕的復雜環(huán)境下進行，來自原料茶、環(huán)境和人員等媒介的霉菌或霉菌孢子在渥堆發(fā)酵階段侵染茶樣，主要包括曲霉屬、散囊菌屬和青霉屬[37-38]。此外，普洱茶在發(fā)酵過程中的水分質(zhì)量分數(shù)（10%～30%）、pH值（5～6）、渥堆中心溫度（＜50 ℃）等條件有利于霉菌繁殖并產(chǎn)毒[39]。目前，世界各國針對黑茶中霉菌毒素的研究較多。Haas等[38]在36 份普洱茶樣品中檢測到根霉、毛霉和青霉。在茯磚茶生產(chǎn)過程中，散囊菌屬中的冠突散囊菌是“發(fā)花”和“菌花香”的來源，而青霉和黑曲霉則屬于污染菌[40]。相反，曲霉屬是六堡茶渥堆階段的優(yōu)勢菌[35,39]，胡沛然[41]在六堡茶中分離出傘狀毛霉菌（Lichtheimia corymbifera）、塔賓曲霉（A.tubingensis）和煙曲霉（A.fumigatus）。與紅茶類似，AFs和OTA是研究和檢出率最高的兩類霉菌毒素，其中黃曲霉毒素G2（aflatoxins G2，AFG2）含量可達59 600 μg/kg，是綠茶中的784 倍[42-43]。因此，相較于其他茶類，黑茶具有更加多元化的侵染菌與產(chǎn)毒菌和多樣化的霉菌毒素。

此外，成茶所選擇的外包裝方式亦能影響霉菌侵染程度[44]。采用天然材料（木質(zhì)、竹質(zhì)等）、紙材料類（紙袋、紙盒、棉紙等）和陶瓷材料類（土陶、紫砂等）等密閉性較差、易受潮的材料可能會在包裝破損或不適當?shù)膬Υ娣绞较掳l(fā)生霉菌侵染并產(chǎn)毒，而金屬包裝（鐵罐、鋁罐、錫罐、不銹鋼罐等）、塑料包裝（聚乙烯、聚丙稀、聚氯乙烯等）和復合材料包裝（紙塑復合包裝盒、鋁塑復合真空包裝袋等）等具有較好的阻氣性、防潮性，采用此類包裝材料加之真空或充氮技術包裝茶葉則能在一定程度上降低茶葉霉變的概率[45]。

1.3 流通環(huán)節(jié)

由于茶葉具有多孔性結(jié)構(gòu)，若在流通環(huán)節(jié)因包裝破損或儲存條件不當會導致茶葉的水分活度升高，加大了茶葉受霉菌侵染并產(chǎn)毒的可能性[46-47]。其中，運輸工具的潔凈程度、貯藏時間的長短和環(huán)境條件是最重要的影響因素。當前，對茶葉中霉菌毒素的研究主要是針對市售樣品，例如，在奧地利購買的36 份市售普洱茶樣品中，有11%的樣品含有OTA，含量最高可達94.70 μg/kg[38]。此外，也有部分學者針對貯藏時間與條件展開研究，在對不同年份六堡茶的研究中發(fā)現(xiàn)，CIT與貯藏時間相關，其陳化過程儲存溫度在25～42 ℃之間，這有利于曲霉和青霉的繁殖和產(chǎn)生CIT，而貯藏過程中的氣候條件和水分活動是影響霉菌定植和CIT積累的關鍵因素[48]。

2 茶葉中常見的霉菌毒素及危害

由于茶葉加工工藝不規(guī)范或是在環(huán)境中感染霉菌，特別是未知霉菌產(chǎn)生的次生代謝物可能對茶葉的飲用安全構(gòu)成風險[49]。霉菌毒素毒性譜較廣，對人體具有致神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂及肝腎損傷等危害。同時，如AFs、OTA、CIT等霉菌毒素已被證實具有致癌、致畸和致突變作用[46]。霉菌毒素的中毒癥狀及嚴重程度取決于霉菌毒素的類型、暴露的數(shù)量和持續(xù)時間、暴露個體的年齡、健康狀況和性別及與其他物質(zhì)的協(xié)同效應[16,46]。另外，豐富的品類和多樣的飲茶方式，導致世界各地對不同茶類的飲用習慣不同，例如，中國以熱飲茶為主，而美國則喜歡冰茶[50]；綠茶的沖泡時間較短，水溫較低[51]，而黑茶除清飲外[2]，在中國少數(shù)民族地區(qū)的酥油茶[52]和咸奶茶[53]則會進行較長時間熬煮。因此，生茶的污染程度、沖泡溫度的高低、沖泡時間的長短、溶劑性質(zhì)、霉菌毒素的熱穩(wěn)定性及從基質(zhì)轉(zhuǎn)移到茶湯中的能力都會影響茶葉中霉菌毒素的浸出率，從而影響飲茶者的霉菌毒素膳食暴露量和健康情況[54]。目前，茶葉中常見的霉菌毒素主要包括AFs、CIT、OTA、ZEN等共31 種[2,16-17,24,48]。

2.1 黃曲霉毒素

AFs是一類結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相似的二氫呋喃雜氧萘的衍生物，因其在食品基質(zhì)中的強致癌性成為了茶葉中首先被追蹤的候選物質(zhì)[2]。AFs急性中毒導致死亡，慢性中毒導致癌癥、免疫抑制等[46]。AFs能夠與DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合，已被國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）列為1類致癌物[16]。通過飲食攝入AFs被認為是引發(fā)原發(fā)性肝細胞癌的重要危險因素，特別是乙型肝炎患者[46]。據(jù)報道，AFs從茶葉遷移到飲料中的比例約為30%～40%[16]。但AFs具有很高的脂溶性，難溶于水，耐熱，茶葉受到AFs污染后只有少量會在沖泡過程中進入茶湯[24]。

2.2 赭曲霉毒素A

OTA是繼AFs之后被人們所關注到的一類具有香豆素和苯丙氨酸結(jié)構(gòu)的類似物，OTA是最強的腎臟致癌物，已被IARC認定為2B類致癌物，在人體內(nèi)的半衰期最長[55]。此外，動物實驗研究表明OTA還具有肝毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性、致畸性，具有物種和性別敏感性差異的特點[46]。OTA以多種方式干擾細胞生理活動。OTA微溶于水，在茶湯中的轉(zhuǎn)移率比AFs高，膳食暴露風險更高，且其產(chǎn)毒菌曲霉屬和青霉屬均為茶葉加工和倉儲過程中的常見微生物[55]。此外，在沖泡過程中茶葉與水接觸時間越長，茶湯中浸出的OTA含量越高[34]。

2.3 桔青霉素

CIT為聚酮類化合物，攝入被CIT污染的產(chǎn)品對人和動物具有腎毒性、肝毒性、免疫抑制和致癌作用。腎臟被認為是CIT的關鍵靶器官，且CIT與OTA的協(xié)同作用和腎毒性已有報道[56]。據(jù)IARC報道，暫無科學證據(jù)表明CIT具有致癌性，被列為第3類致癌物。然而，值得引起關注的是在茶葉中CIT與OTA共存的比例較高，且CIT具有一定的水溶性[48]。此外，細胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生和細胞內(nèi)三磷酸腺苷（adenosine 5’-triphosphate，ATP）含量的降低已被發(fā)現(xiàn)與CIT有關[56]。目前，白茶和黑茶中已有相關檢出的報道[28,48]。

2.4 玉米赤霉烯酮

ZEN是一類2,4-二羥基苯甲酸內(nèi)酯類化合物，具有免疫毒性、肝毒性等。它與人類卵巢產(chǎn)生的主要激素雌二醇非常相似，以至于它可以與哺乳動物靶細胞中的雌激素受體結(jié)合，具有很強的雌激素樣作用和合成代謝作用。ZEN及其代謝物隨食物攝入后會被人體吸收，可出現(xiàn)在血液、尿液和母乳等生物體液中[46]。人體推薦的玉米赤霉烯酮安全攝入量為每天0.05 g/kgmb[24]。目前，ZEN在中國紅茶[8]、摩洛哥綠茶[16]、拉脫維亞黑茶[17]和西班牙白茶[30]的研究中均有報道。

2.5 伏馬菌素B1

FB1是一種雙酯化合物，主要由丙三羧酸和不同的多氫醇組成。與OTA同屬于2B類致癌物，F(xiàn)B1可損傷肝腎功能，在中國和南非部分地區(qū)伏馬毒素污染與食道癌發(fā)病率呈正相關[46]。與其他霉菌毒素不同，F(xiàn)B1極易溶于水，這就可能導致FB1在實際沖泡茶湯時轉(zhuǎn)移率高等問題，因此需要加大對茶葉中FB1的關注[24,35]。目前，F(xiàn)B1在綠茶、紅茶和黑茶中均有報道[20,35,57]。

2.6 其他毒素

除上述霉菌毒素外，柄曲霉素（sterigmatocystin，STC）[8]、TENT[16]和HT-2[17]等霉菌毒素在茶葉中也有檢出，但由于其檢出含量較少或危害較小，研究人員暫時對其關注度相對偏低，相關報道研究較少。

茶葉中存在的產(chǎn)毒菌及霉菌毒素如表1所示；表2列舉了近年來茶葉中霉菌毒素的檢測結(jié)果。

表1 茶葉中存在的產(chǎn)毒菌及霉菌毒素Table 1 Toxigenic fungi and mycotoxins present in tea

表2 茶葉中霉菌毒素的檢測結(jié)果Table 2 Mycotoxin contents in tea

續(xù)表2

3 茶葉中霉菌毒素的檢測方法

3.1 樣品前處理技術

霉菌毒素是一類小分子的化合物，而茶葉則是一種復雜的食品基質(zhì)，其豐富的內(nèi)含物可能會干擾正常的分析檢測過程，茶樣需經(jīng)過復雜的提取和凈化程序才能進行分析[58,65]。在茶葉預處理過程中，消除基質(zhì)效應是當前開展分析工作的主要挑戰(zhàn)。目前，茶葉實際分析過程中需要結(jié)合下述分析方法進行前處理，以提高復雜基體的精密度和特異性[66]。茶葉毒素檢測的提取方法主要包括固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）[67]、分散固相萃?。╠ispersive solid-phase extraction，DSPE）[31]、液-液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）[68]、固相支撐液-液萃?。╯upported liquid extraction，SLE）[59]、分散液-液微萃?。╠ispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）[16]、懸浮固化分散液-液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction based on the solidification of floating organic droplets，DLLME-SFO）[65]、基于同位素的快速、簡單、廉價、有效、堅固和安全（quick-easycheap-effective-rugged and safe，QuE-ChERS）[69]、稀釋進樣（dilute and shoot，D&S）[68]；凈化方法主要有免疫親和柱（immune affinity column，IAC）與多功能柱（multi-function columns，MFC）[70-71]等。

SPE和LLE是當前霉菌毒素殘留常用的提取方法，常用于降低基質(zhì)效應并提高靈敏度，但LLE存在有機溶劑用量大、耗時長等問題，而SPE費用昂貴，不符合綠色化學的要求[67-68]；DLLME具有快速、簡便、成本低、溶劑用量少、富集率高等優(yōu)點已被廣泛應用于霉菌毒素樣品的處理[72]。DLLME在實際應用中還常與其他提取方法相結(jié)合，比如，Cina等[65]建立袋泡茶樣品中OTA的分析提取和凈化方法，將DLLME-SFO與高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）聯(lián)用技術相結(jié)合定量評價，該分析技術具有生態(tài)友好、靈敏、選擇性好、快速等特點；QuE-ChERS被廣泛應用于食品基質(zhì)（水果和蔬菜）中農(nóng)藥殘留檢測，現(xiàn)主要將QuE-ChERS與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）相結(jié)合用于茶葉中的AFs與多種霉菌毒素的檢測，該方法獲得了令人滿意的回收率（78.94%～121.00%）[58,64,69]；目前解決基質(zhì)效應的最新趨勢是采用稀釋進樣技術，該方法的優(yōu)點是簡單、樣品損失最小、吞吐量高、分析物種類多。但在茶葉霉菌毒素檢測方面該技術仍處于方法建立階段，還有待進一步開拓其在不同茶樣中的應用[73]。

IAC是一種利用抗體與抗原特異性結(jié)合的凈化方法，該方法凈化后的霉菌毒素純度高，已應用于大多數(shù)的樣品檢測當中，但由于抗體特異性、凈化耗時長與柱子不可重復使用等原因均限制了IAC的應用[61,66]。MFC與IAC相比無需經(jīng)過活化、淋洗和洗脫步驟，凈化時間更短、操作更簡單。MFC可以通過對茶葉樣品的基質(zhì)進行選擇性地吸附，減少樣品基質(zhì)對待測霉菌毒素的干擾，但該方法對部分霉菌毒素的特異性差，存在吸附毒素本身的問題，造成回收率偏低[24,70]。目前，已有MFC-IAC聯(lián)合凈化法，該方法通常用于復雜的基質(zhì)，具有優(yōu)異的分離能力和較高的靈敏度和回收率（75%～120%），但該方法預處理過程復雜且昂貴，尤其是對茶葉而言[59,70]。

綜上，未來應開發(fā)凈化和預濃縮步驟，以提高方法的分析能力。其中，基于納米材料、生物材料和合成材料的樣品預處理和分析技術被認為是測定霉菌毒素的重要方法[64]。據(jù)報道，二氧化硅/石墨烯氧化物和多壁碳納米管（multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）已成功應用于谷物和食品中AFs的檢測。此外，已有研究報道了胺化多壁碳納米管對茶多酚和葉綠素的去除能力，以及基于MWCNTs開發(fā)的AFs檢測生物傳感器[64]。雖然新的技術層出不窮，但也有學者指出茶在飲用方式上與其他谷物相比有著根本的差異，評價飲茶中攝入的霉菌毒素應該根據(jù)其飲用方式的不同做出相應調(diào)整[20]。

3.2 檢測技術

基于側(cè)向流試紙條（lateral flow test，LFT）、酶聯(lián)免疫吸附測試（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和液相色譜（liquid chromatography，LC）的霉菌毒素檢測方法已被廣泛采用，在檢測常見的霉菌毒素方面已建立了良好的基礎[62,66,74]。LFT可實現(xiàn)快速篩選且抗基質(zhì)干擾，無需對樣品進行復雜處理，但該方法線性范圍不及現(xiàn)代儀器分析，且重現(xiàn)性較差[74]。ELISA具有操作簡單、分析時間短等優(yōu)勢，但該方法需要制備特定的抗體，面臨著開發(fā)難度大、重現(xiàn)性差、易出現(xiàn)假陽性等問題。例如，在ACT聯(lián)合ELISA試驗中，樣品的預處理不僅費時，而且會存在假陽性的問題[62]。相比于LFT和ELISA，LC是目前應用最廣的檢測方法，LC包括高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和UPLC/MS/MS等。LC在提取上有試劑用量少、萃取體積小的優(yōu)點；在結(jié)果上有靈敏度高、回收率高、選擇性好、穩(wěn)定性高和假陽性率低等優(yōu)點，此外，LC還可以應用于同時檢測多種霉菌毒素[31,66]。然而，LC的柱前或柱后衍生化需要大量的衍生劑（如三氟乙酸），這會對儀器造成損害。同時LC依賴于基質(zhì)的電離抑制，因此想要準確定量目標分析物就需要進行耗時且復雜的矩陣匹配校正[69]。

一般情況下，由于強烈的基質(zhì)效應，茶葉中霉菌毒素的平均回收率在80%左右[65]。但這些技術既耗時又會產(chǎn)生大量有機溶劑廢物，不符合綠色化學的要求。考慮到OTA、AFs本身具有熒光性，Gonzalez等[59]基于并行因子分析（parallel factor analysis，PARAFAC）和多元曲線分辨率交替最小二乘法（multivariate curve resolutionalternating least squares，MCR-ALS）聯(lián)合高效液相色譜-熒光檢測法（high performance liquid chromatographyfluorescence detection，HPLC-FLD）進行檢測，以極低的溶劑就可實現(xiàn)定量。Bogdanova等[58]建立二維液相色譜-飛行時間質(zhì)譜（two-dimensional liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry，2D-LC-TOF-MS）同時檢測出普洱茶中70 種霉菌毒素，該方法不僅能夠快速準確地分析復雜基質(zhì)樣品中的霉菌毒素，而且在分離不同霉菌毒素時具有更好的效果，使得分析結(jié)果更清晰準確。同時，該方法還可檢測到極少被關注的OTB。此外，利用HPLC與高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測農(nóng)藥殘留、霉菌毒素、吡咯里西啶和生物堿的方法已在小麥、韭菜和茶等食品中有所應用[75]，未來利用高分辨率技術檢測茶葉中的霉菌毒素將成為趨勢。茶葉中霉菌毒素檢測方法與評價指標見表3。

表3 茶葉中霉菌毒素檢測方法與評價指標Table 3 Detection methods for mycotoxins in tea and their figures of merit

綜上所述，茶葉中的霉菌毒素檢測研究目前多集中在AFs、OTA、DON中，其他毒素（如STC、AHO和PAT）關注較少，而關注多種霉菌毒素的研究更少。在六大茶類中，針對黑茶的檢測占據(jù)大多數(shù)，青茶、白茶和黃茶中較少涉及。值得注意的是，由于樣品及測定方法不同，茶葉中的霉菌毒素的檢測結(jié)果并不一致。針對茶葉基質(zhì)中的霉菌毒素的快檢技術研究較少，現(xiàn)有的定量分析方法不足以實現(xiàn)未知霉菌毒素的準確定性定量分析，是否存在假陽性的問題還有待深究。此外，這些研究中大多沒有說明其檢測樣品的原始狀態(tài)、具體來源和倉儲狀態(tài)等情況，這為霉菌毒素的科學風險評估帶來難題。因此，建立一種可靠的、能有效降低茶葉基質(zhì)干擾的霉菌毒素檢測方法勢在必行。

4 控制措施

4.1 育種與改良

在防止作物在收獲前被污染方面，可以通過植物育種和基因工程增強抗霉菌基因，使用生防劑及針對霉菌毒素開發(fā)中的調(diào)控基因來提高宿主抵抗力[46]。在植物中基于基因工程開發(fā)宿主植物對霉菌毒素的抗性已有先例[76]。Solliman等[77]將從鷹嘴豆（Cicer arietinumL.）中分離的防御基因作為抗霉菌基因生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因番茄，增強了番茄的抗霉菌性能。Chen Qiming等[78]發(fā)現(xiàn)蘋果抗再植病相關基因MdCERK1-2的超表達可以影響本氏煙草植物的多重防御反應并增加其對霉菌病原體的抗性。該研究還發(fā)現(xiàn)超表達MdCERK1-2增強了蘋果對霉菌病原體的防御反應。然而，育種改良技術在茶樹中的研究較少，但有望形成一種趨勢，其中，有研究在大吉嶺茶樹中發(fā)現(xiàn)AV-2栽培品種在抗水皰?。ú≡鸀镋xobasidium vexans）方面具有優(yōu)勢，可作為今后茶樹選育的參考[79]。

4.2 控制加工條件

當前，茶葉質(zhì)量控制所面臨的挑戰(zhàn)之一是在不影響原有品質(zhì)的情況下消除危害因素。所以控制霉菌毒素的方法在很大程度上是預防性的，其中良好的農(nóng)業(yè)實踐和適應的加工方式對茶葉而言尤為重要[46]。我國國家標準要求在茶葉生產(chǎn)過程中嚴格遵守GB/T 20014.12—2013《良好農(nóng)業(yè)規(guī)范: 第12部分 茶葉控制點與符合性規(guī)范》[80]、GB/T 32744—2016《茶葉加工良好規(guī)范》[81]和GB/Z 21722—2008《出口茶葉質(zhì)量安全控制規(guī)范》[82]等，確保加工和倉庫等場所保持干燥、通風和清潔，并設立防霉設施。茶葉在貯藏時應該符合GH/T 1071—2011《茶葉貯存通則》規(guī)定，即確保茶葉無霉變[83]。Zhang Xuanjun等[24]認為中國茶葉所選擇的低溫貯藏和真空包裝的方式可有效避免霉菌污染。

此外，研究表明，對加工場所及加工的各個環(huán)節(jié)采取相關的措施可有效降低霉菌侵染的風險及霉菌毒素污染程度。比如，Tong Wei等[32]研究發(fā)現(xiàn)利用10 g/L NaClO溶液對鮮葉進行殺菌可有效降低鮮葉表面微生物豐度，但殺菌后所制成的紅茶中總兒茶素和茶氨酸的含量降低。而傳統(tǒng)的熱殺菌技術在應用時也被發(fā)現(xiàn)會影響茶葉品質(zhì)[84]。如今，隨著技術的發(fā)展，利用輻照殺菌等技術進行產(chǎn)品殺菌能有效保證茶葉品質(zhì)。Jayasinghe等[85]利用Co-60 γ輻照器對市售錫蘭紅茶進行輻照，發(fā)現(xiàn)5 kGy是有效確保微生物安全、保留市售錫蘭紅茶的物理參數(shù)和總多酚含量的最佳劑量。Hayashi等[86]研究發(fā)現(xiàn)綠茶在200 kV的加速電壓和8 μA的束流條件下暴露15 min對其顏色和芳香成分沒有影響，不會降低其商業(yè)價值，同時還可以凈化茶葉，且沒有顯著的質(zhì)量劣化。因此，在確保茶葉原有品質(zhì)的基礎上，探究適合鮮葉與成茶的殺菌技術及安全性是未來的研究熱點之一。

4.3 完善限量標準

目前，關稅同盟國家（亞美尼亞、白俄羅斯、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦和俄羅斯）就茶葉中的霉菌毒素制定了相關限量標準，規(guī)定生茶中AFB1的限量為5 μg/kg。此外，印度規(guī)定AFT在紅茶中的限量為30 μg/kg，阿根廷規(guī)定涼茶沖泡原料中的AFB1和AFs限量分別為5 μg/kg和20 μg/kg。中國則暫未針對茶葉中的霉菌毒素制定相關的限量標準[2,24]。因此，為了評估霉菌毒素在茶中的安全風險，有必要參考上述國家對不同種類的茶葉進行霉菌毒素監(jiān)管的代表性研究，并應選擇其他食品的霉菌限制標準作為參考，建立適用于茶葉中霉菌毒素的限量標準[49]。

4.4 建立風險效益評估機制

根據(jù)茶葉的特殊性，其攝入方式不同于其他食品，飲茶者往往采用沸水沖泡干茶后飲入茶湯，棄去茶渣，但目前茶葉中的霉菌毒素風險評估機制主要參考食品中的評估機制，這不利于正確分析茶葉中的霉菌毒素風險。因此，只有在沖泡過程中進入茶湯的霉菌毒素（即“有效風險量”）才能造成健康風險[34]。建立風險效益評估機制，評估由飲茶誘發(fā)的霉菌毒素風險和茶葉的健康作用之間的關系，調(diào)查茶葉中霉菌毒素在茶湯中的轉(zhuǎn)移情況，并對商品茶產(chǎn)品中是否存在多種霉菌毒素進行分析[46]，完善風險評估機制，這將有助于指導政府制定食品政策和刺激消費者消費行為[47]。

5 結(jié) 語

茶葉中的霉菌病害作為一種嚴重的國際衛(wèi)生問題已成為關注焦點，在茶葉種采、加工及流通過程中存在受霉菌污染的風險。如今，針對茶葉中霉菌及其毒素的定性定量與風險評估已成為研究熱點。但仍然需要引起注意的是：首先，目前針對茶葉中的霉菌毒素的研究數(shù)據(jù)仍然有限，茶葉與霉菌接觸后是否一定會產(chǎn)生毒素，毒素的轉(zhuǎn)移率如何等問題目前尚未完全闡明；其次，針對茶葉中的霉菌毒素分析檢測技術還有待進一步完善；最后，針對茶葉中的霉菌及其毒素的監(jiān)督管理力度還不足，相關法律法規(guī)體系還不健全，專門針對茶葉霉菌的管理措施還有待進一步研究。因此，掌握茶葉中霉菌毒素的來源，研究茶葉中常見霉菌及其毒素的危害，制定相應的控制措施并完善分析檢測體系，對提升茶葉質(zhì)量具有重大意義。