汪一峰,王兆鳳,胡海強(qiáng),徐 慧,王 磊,王 樺

(1.湖州學(xué)院 湖州市綠色能源材料與電池梯次利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 智能制造學(xué)院,浙江 湖州 313000; 2.湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 湖州 313000; 3.魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺 264025)

0 引 言

近年來,隨著國民收入的不斷提高,人們對健康飲食越來越重視.水產(chǎn)品含有豐富的蛋白質(zhì)和微量元素,且脂肪含量遠(yuǎn)低于肉類[1],因此受到我國國民的青睞.隨著電子商務(wù)在農(nóng)產(chǎn)品銷售領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,水產(chǎn)品的銷路不斷拓寬,國民對水產(chǎn)品的消費(fèi)需求進(jìn)一步提高,這也推動了我國水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的快速發(fā)展[1-2].但隨著水產(chǎn)品產(chǎn)量的日益增加,我國水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)存在的問題也越來越突出.眾所周知,水產(chǎn)病原菌是制約水產(chǎn)品產(chǎn)量的一大主要因素,部分從業(yè)者為提高經(jīng)濟(jì)效益,濫用抗生素,致使超級細(xì)菌誕生[3],嚴(yán)重影響了水產(chǎn)行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展.水產(chǎn)生物體內(nèi)殘留的抗生素也威脅到了食用者的身體健康[3-4].因此,研發(fā)高效且對人體無害的抑菌劑來取代抗生素迫在眉睫.

銀是一種在我國具有悠久使用歷史的抑菌劑.例如,中醫(yī)以銀作為針灸為人治病,牧民們用銀質(zhì)的容器保存牛奶等.納米銀(Silver nanoparticles, AgNPs)是通過化學(xué)方法合成的粒徑小于100 nm的銀單質(zhì)粒子.較之宏觀的金屬銀,AgNPs具有更大的比表面積、更好的抑菌效果,不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[5],且對多種病原菌有極好的抑制作用,有望成為抗生素的替代品[6].AgNPs的主要合成方法包括物理法、化學(xué)法和生物法.其中,物理法能耗大,且對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較高[7];化學(xué)法常使用帶有毒性的物質(zhì),因此所得的AgNPs常帶有一定的毒副作用或伴生毒副產(chǎn)品[8-9].相較前兩種方法,生物法具有節(jié)能、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[9],其中植物合成法相對傳統(tǒng)的微生物合成法,免去了繁雜的細(xì)胞培養(yǎng)過程,從而降低了生產(chǎn)成本,縮短了生產(chǎn)周期.

枸杞是茄科枸杞屬植物,全世界約有80種[10].枸杞在我國有著悠久的藥用歷史[11],具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目等保健功效[12].研究表明,枸杞還具有抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種藥理作用[12],其原因是枸杞富含類胡蘿卜素[13-15]、維生素[13, 15]、枸杞多糖[13, 16]和多種黃酮類化合物[13-15]等具有還原能力的生物活性成分[14].這些生物活性成分能夠使枸杞提取物將Ag+還原成單質(zhì)Ag,且制得的AgNPs溶液中剩余的還原性成分可以對抗外界物質(zhì)對AgNPs的氧化,起到穩(wěn)定劑的作用.

目前,關(guān)于AgNPs的制備及其對細(xì)菌抑制的相關(guān)研究有很多.AgNPs已在諸如食品包裝[17-18]、紡織[19]等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用,基本實(shí)現(xiàn)了商品化.但其在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的應(yīng)用研究仍較少.本研究以枸杞提取液作為還原劑和穩(wěn)定劑,采用生物合成法制備AgNPs,并檢測其對6種常見水產(chǎn)病原菌的抑菌活性,力求將AgNPs的應(yīng)用拓展到水產(chǎn)領(lǐng)域,為水產(chǎn)病原菌的防治提供一種新方法.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)用枸杞采購自當(dāng)?shù)厥袌?硝酸銀(AR)、蛋白胨(AR)、酵母提取物(AR)、氯化鈉(AR)、 瓊脂粉(AR),采購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)用水產(chǎn)病原菌菌株(鰻弧菌、燦爛弧菌、點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌和溶藻弧菌)來自本實(shí)驗(yàn)室.實(shí)驗(yàn)用的水均為超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm).

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

采用UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)(UV-vis, UV-2550,日本Shimadzu公司)測試不同合成時(shí)間AgNPs溶液的最大吸收波長,掃描波長為300～700 nm.采用 X射線衍射儀(XRD,D/max-2500PC, 日本, 理學(xué))對AgNPs的物相進(jìn)行分析,掃描范圍為 5°～80°.將少量的納米銀溶液滴在覆炭銅網(wǎng)上,室溫干燥后,使用透射電子顯微鏡(TEM,JEM-1230, 日本電子公司)在100 kV電壓下觀察AgNPs的形貌和粒徑.采用衰減全反射法測定枸杞提取液和納米銀的紅外光譜(傅里葉變換紅外光譜儀,Nicolet is50,美國Thermo Fisher Scientific公司,掃描范圍為4000 cm-1～500 cm-1).Zeta電位于Nano-zs90(英國 Malvern Zetasizer 公司)上完成.

1.3 枸杞提取液的制備

用分析天平稱取1.5 g干枸杞于50 mL的兩口燒瓶中,加入15 mL超純水,在石蠟浴中105 ℃微沸2.0 h,停止加熱并自然冷卻后,減壓抽濾,得到一次枸杞提取液.將濾渣收集于兩口燒瓶中,再次加入 15 mL 超純水,繼續(xù)105 ℃微沸2.0 h,停止加熱并自然冷卻后,減壓抽濾,得到二次枸杞提取液.將兩次提取液混合,4 ℃保存?zhèn)溆?

1.4 AgNPs的制備

準(zhǔn)確稱取0.169 9 g硝酸銀(AgNO3)溶解于超純水,并定容于100 mL容量瓶中,得到0.01 mol/L AgNO3溶液;向20 mL的圓口燒瓶中加入2.0 mL 0.01 mol/L AgNO3溶液、1.0 mL枸杞提取液和17 mL超純水,使溶液的硝酸銀終濃度為1 mM;設(shè)置油浴溫度為95 ℃,加熱上述混合溶液至95 ℃后開始計(jì)時(shí),分別于0 、10 、20 、30 、40、60 min各取樣一次,用于后續(xù)紫外-可見吸收光譜的測量.

1.5 納米銀抗菌效果的測定

1.5.1 抑菌圈實(shí)驗(yàn)

采用牛津杯法測定納米銀的抑菌活性.將測試病原菌接種于2216E培養(yǎng)基(稱取蛋白胨5.0 g、 酵母膏1.0 g、磷酸高鐵0.010 g、瓊脂粉15.0 g, 用海水定容至1 000 mL,再用1.0 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至7.6～7.8;除去瓊脂粉,用以上成分配制液體培養(yǎng)基,120 ℃ 高壓滅菌20 min)培養(yǎng)至對數(shù)生長期,再將培養(yǎng)好的菌液稀釋至 1×106CFU/mL,取0.1 mL測試病原菌液均勻涂布于固體平板培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)基上放置外徑為8 mm的牛津杯,并在杯中加入 20 μL的納米銀溶液,用枸杞提取液和生理鹽水作為陰性對照,每種細(xì)菌平行實(shí)驗(yàn)3次,28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測量各組樣品的抑菌圈直徑,并求平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差.

1.5.2 抑菌動力學(xué)實(shí)驗(yàn)

在28 ℃、150 r/min下,將鰻弧菌置于 2216E 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期,然后將培養(yǎng)好的菌液稀釋至1×106CFU/mL;分別加入已合成好的納米銀材料,使其終濃度分別為 1.0 、3.0 μg/mL,將AgNPs換成生理鹽水作為對照,于150 r/min,28 °C恒溫?fù)u床培養(yǎng);分別于不同時(shí)間間隔(0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48 min)取樣,用分光光度計(jì)測定OD600值,繪制鰻弧菌的生長動力學(xué)曲線.

1.5.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)實(shí)驗(yàn)

選取鰻弧菌作為供試菌,用二倍稀釋法測定AgNPs的MIC和MBC[20].上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3 次.

2 結(jié)果與討論

2.1 枸杞合成納米銀的表征

AgNPs水溶液一般呈黃色,這是由銀納米顆粒的表面等離子體共振吸收造成的[20].因此,通過溶液顏色的變化可以初步判斷AgNPs是否生成.此外,AgNPs溶液的顏色還與其所含納米銀的粒徑和濃度息息相關(guān),通常AgNPs濃度越大,粒徑越大,溶液的顏色也會越深[21].由圖1(a)可以看出,在合成溫度為60 ℃及以下時(shí),溶液的顏色幾乎未發(fā)生改變,說明在較低溫度條件下,AgNPs難以生成或生成速率極低,枸杞提取物在低溫下不能還原硝酸銀,不足以使溶液顏色發(fā)生改變;在合成溫度為80 ℃時(shí),溶液呈淺黃色;在合成溫度為95 ℃時(shí),溶液呈黃褐色,說明在95 ℃時(shí)AgNPs生成的速率更大,故認(rèn)為95 ℃為本實(shí)驗(yàn)合成AgNPs的最佳溫度,并以此溫度研究反應(yīng)時(shí)間對AgNPs合成的影響.

圖1 (a)從左到右依次為枸杞提取液,反應(yīng)時(shí)間為1.0 h,反應(yīng)溫度分別為20 、40 、60 、80 、95 ℃的AgNPs溶液;(b)從左到右依次為枸杞提取液,反應(yīng)溫度為95 ℃,反應(yīng)時(shí)間為20、30、40、60 min的AgNPs溶液

圖1(b)中各組溶液較未反應(yīng)的溶液,其顏色有明顯變化,說明95 ℃反應(yīng)20 min后就有AgNPs生成,且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,溶液顏色逐漸加深,這說明AgNPs濃度隨時(shí)間的延長逐漸增大,粒徑也逐漸增大.

UV-vis吸收光譜是檢驗(yàn)AgNPs是否生成的重要表征手段,AgNPs的最大吸收峰通常出現(xiàn)在410～440 nm之間[22].由圖2(a)可知,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,溶液的吸光度逐漸提高,反應(yīng)30 min后,可以觀察到明顯的吸收峰,其中30、40、60 min處的吸收峰分別出現(xiàn)在417、422、428 nm處,特征峰隨反應(yīng)時(shí)間的延長略微紅移.這說明AgNPs的粒徑隨反應(yīng)時(shí)間的延長逐漸增大[23].

圖2 (a)不同反應(yīng)時(shí)間下AgNPs溶液的紫外-可見吸收光譜圖;(b)枸杞提取液制備AgNPs的XRD圖譜;(c)納米銀的TEM圖;(d) 枸杞提取液和納米銀的紅外光譜圖

XRD測試結(jié)果見圖2(b),樣品在27.46°、31.90°、37.78°、43.78°、64.00°、76.42°處存在6個(gè)顯著的衍射峰.其中,位于37.78°、43.78°、64.00°、76.42°處的4個(gè)峰分別對應(yīng)面心立方(FCC)AgNPs的(110)(200)(220)(311)晶面衍射(標(biāo)準(zhǔn)卡片JCPDS卡01-1167);27.46°、31.90°處的峰分別對應(yīng)氯化銀的(110)和(200)晶面(JCPDS卡31-1238).這說明以枸杞提取物作為還原劑可以將銀離子還原為AgNPs.產(chǎn)物中存在的兩個(gè)氯化銀衍射峰,可能是銀離子與枸杞提取物中生物殘基內(nèi)的氯離子反應(yīng)生成了氯化銀.

對合成的AgNPs進(jìn)行TEM表征,觀察AgNPs的形貌、粒度分布和分散性[24],結(jié)果見圖2(c).由圖2(c)可知,枸杞提取物合成的AgNPs是粒徑分布在5～30 nm之間的橢球體,顆粒之間互不粘連,分散性良好,與多種生物質(zhì)還原硝酸銀制備的銀納米粒子相當(dāng).

對枸杞提取液及其生物合成的AgNPs進(jìn)行紅外光譜分析,結(jié)果見圖2(d).由圖2(d)可知,AgNPs與枸杞提取液存在相同的吸收峰,3 394 cm-1處的吸收峰是由酚類化合物中—OH伸縮振動產(chǎn)生的,1 624 cm-1處的吸收峰是由羰基伸縮振動產(chǎn)生的[25].這說明枸杞提取液包覆在AgNPs表面,提高了AgNPs的穩(wěn)定性,阻止了AgNPs的自聚.將本次實(shí)驗(yàn)制備的AgNPs避光保存40天后取出,發(fā)現(xiàn)溶液顏色無明顯改變,也無明顯團(tuán)聚沉淀現(xiàn)象產(chǎn)生.

用紫外可見分光光度計(jì)測定放置40天后AgNPs溶液的UV-vis光譜圖,并與新合成的AgNPs溶液的UV-vis光譜圖進(jìn)行比對,結(jié)果見圖3(a).由圖3(a)可以看出,在放置40天后,AgNPs溶液的吸光度有所增大,最大吸收峰略有紅移.這說明AgNPs在放置過程中存在少量團(tuán)聚,但其特征吸收峰依舊存在,且進(jìn)一步說明AgNPs并未被氧化,依然保留理化性能.

圖3 (a)剛制備的納米銀粒與放置40天后的納米銀粒子;(b)枸杞提取物合成AgNPs的Zeta電位

常規(guī)化學(xué)合成方法制備的AgNPs在合成一個(gè)月內(nèi)常常會出現(xiàn)肉眼可見的團(tuán)聚現(xiàn)象,并逐漸失去其特性[20].而本次實(shí)驗(yàn)制備的AgNPs溶液放置40天后與新制備的溶液無明顯差別,證明枸杞提取液生物法制備的AgNPs具有較好的穩(wěn)定性,其原因可能是枸杞中存在多種還原性物質(zhì),使其在納米銀表面形成了保護(hù)層.

AgNPs溶液是一種膠體溶液,體系中AgNPs表面帶有一定的電荷,可使粒子相互吸引或排斥,最終形成相對穩(wěn)定的狀態(tài).常用膠體溶液的Zeta電位可用于評判其穩(wěn)定性,一般Zeta電位的絕對值越大,粒子之間的靜電排斥力越強(qiáng),溶液越容易維持穩(wěn)定.由圖3(b)可以看出,AgNPs溶液的Zeta電位主要分布在-16.4 mV處,粒子表面帶有負(fù)電荷,粒子之間相互排斥,使得納米粒子不易團(tuán)聚,且具有良好的穩(wěn)定性.

2.2 納米銀抑菌活性的檢測

2.2.1 抑菌圈測試

AgNPs對6種水產(chǎn)病原菌的抑菌效果見圖4.由圖4可以看出,生理鹽水和枸杞提取液對6種病原菌均沒有明顯的抑菌活性.而AgNPs的周圍則出現(xiàn)了明顯的抑菌圈,且抑菌圈直徑均大于14.00 mm(表1),其抑菌效果大于目前已報(bào)道的多種生物還原法制備的AgNPs的抑菌效果[26-27].可見,AgNPs具有良好的應(yīng)用前景.

表1 AgNPs對各水產(chǎn)病原菌的抑菌圈直徑

注:a為鰻弧菌;b為燦爛弧菌;c為點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌;d為副溶血弧菌;e為哈維氏弧菌;f為溶藻弧菌;1為AgNPs;2為枸杞提取液; 3為生理鹽水.圖4 AgNPs對6種水產(chǎn)病原菌的抑菌效果

AgNPs對6種水產(chǎn)病原菌的抑菌圈直徑見表1.由表1可知,AgNPs對6種水產(chǎn)病原菌的抑菌圈直徑各不相同,其對鰻弧菌的平均抑菌圈直徑最大.這說明鰻弧菌對AgNPs的敏感性最強(qiáng).因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以將鰻弧菌作為指示菌進(jìn)行抑菌活性測試.

為探討AgNPs的熱穩(wěn)定性,將合成好的AgNPs分別經(jīng)40、60、80、95 ℃加熱1.0 h后測定其抑菌性能,結(jié)果見表2.由表2可以看出,經(jīng)95 ℃處理后的AgNPs抑菌圈最大,但與未進(jìn)行熱處理的AgNPs相比,抑菌圈均有所減小.這說明合成的AgNPs具有較高的熱穩(wěn)定性,經(jīng)加熱后仍能保持較好的抑菌活性.經(jīng)95 ℃處理后的抑菌圈大于40、60、80 ℃處理后的抑菌圈,其原因可能是隨著溫度的升高,熱運(yùn)動速度加快,從而提高了細(xì)菌與納米粒子的相互作用速度[20, 28],增強(qiáng)了抑菌活性.

表2 不同處理溫度下AgNPs對鰻弧菌的抑菌圈直徑

2.2.2 抑菌動力學(xué)檢測

以鰻弧菌為指示菌,檢測 AgNPs 對其生長曲線的影響,結(jié)果見圖5.由圖5可知,細(xì)菌培養(yǎng)液 在 600 nm 下的 OD 值與培養(yǎng)液中細(xì)菌的濃度呈正相關(guān),OD 值越高,培養(yǎng)液中細(xì)菌的濃度越高.生理鹽水對照組的OD600值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長不斷變大,10 min左右接近最大值.1.0 μg/mL AgNPs處理組的OD600值在前24 min內(nèi)無明顯變化,說明AgNPs對細(xì)菌增長有極好的抑制效果;24 min后,OD600值迅速上升,說明AgNPs逐漸失去抑菌活性.3.0 μg/mL AgNPs處理組的OD600值隨時(shí)間幾乎無任何變化,這是由于鰻弧菌被AgNPs徹底殺死.上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明.枸杞提取液合成的AgNPs在液體環(huán)境中可以很好地抑制鰻弧菌的生長.

圖5 不同AgNPs濃度處理下鰻弧菌的生長曲線

2.2.3 MIC 和MBC的測定

以鰻弧菌為指示菌,采用MIC和MBC來定量評價(jià)該生物合成AgNPs的抑菌性,結(jié)果見表3.用2倍稀釋法將納米銀(27.4 μg/mL)溶液稀釋為8個(gè)梯度濃度,分別與等量細(xì)菌懸液混合于試管中,在28 ℃環(huán)境中恒溫培養(yǎng)24 h,發(fā)現(xiàn)1、2、3、4號試管完全澄清,5號試管開始出現(xiàn)輕微的渾濁現(xiàn)象,故認(rèn)為4號試管對應(yīng)的AgNPs濃度(1.7 μg/mL)為MIC.從1、2、3、4號完全澄清的試管中取0.10 mL,均勻涂布于2216E培養(yǎng)皿上,于28 ℃倒置培養(yǎng)24 h,1、2、3號培養(yǎng)皿中未見菌落,4號培養(yǎng)皿中有菌落生長,故認(rèn)為3號培養(yǎng)皿對應(yīng)的AgNPs濃度(3.4 μg/mL)為MBC(表3).

表3 MIC和MBC實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果(鰻弧菌)

2.2.4 抑菌機(jī)制

到目前為止,關(guān)于AgNPs的確切抑菌機(jī)理尚無定論.學(xué)者們普遍認(rèn)可的觀點(diǎn)是:AgNPs通過滲透進(jìn)入菌體內(nèi),抑制呼吸酶活性,破壞其DNA致使細(xì)菌死亡;或通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜,使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏導(dǎo)致其死亡[29].將合成的AgNPs與鰻弧菌一起培養(yǎng)后,用結(jié)晶紫染色,觀察其結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化.結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)AgNPs存在時(shí),鰻弧菌數(shù)量大大減少.其原因是當(dāng)銀離子滲入微生物細(xì)胞后,DNA分子從松弛狀態(tài)轉(zhuǎn)變成濃縮形式,失去復(fù)制能力,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡.此外,銀離子通過形成Ag-S鍵與蛋白質(zhì)的高親和力也可導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活.眾所周知,AgNPs的抗菌機(jī)制與其尺寸分布、形貌和穩(wěn)定性緊密相關(guān),枸杞提取液合成的AgNPs對6種水產(chǎn)病原菌極好的抑菌活性再次說明,合成的AgNPs具有很好的穩(wěn)定性.這與前面的結(jié)果一致.

為進(jìn)一步闡明AgNPs的抑菌機(jī)理,分別用1.0、3.0、5.0 μg/mL枸杞提取物生物合成的AgNPs溶液處理鰻弧菌(對數(shù)期的菌,AgNPs的濃度是終濃度),并于28 ℃、170 rpm下培養(yǎng)1.5 h后,采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit試劑盒提取基因組DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳,電壓為110 V,最后EB染色,拍照,結(jié)果見圖6.電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著生物合成AgNPs溶液濃度的增加,實(shí)驗(yàn)組對應(yīng)的DNA條帶越來越暗,DNA逐步發(fā)生了降解.

M:Marker; 1:對照組; 2:AgNPs濃度為1.0 μg/mL; 3:AgNPs濃度為3.0 μg/mL; 4:AgNPs濃度為5.0 μg/mL圖6 不同濃度AgNPs處理鰻弧菌后基因組DNA的電泳圖

3 結(jié) 論

隨著耐藥細(xì)菌的不斷出現(xiàn),有關(guān)新型抑菌劑的研發(fā)需求日益增加.其中,AgNPs具有生物安全性、廣譜殺菌性、不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),是最大的研究熱點(diǎn)之一.植物提取物中具有多種生物活性成分.研究者發(fā)現(xiàn),使用植物提取液能成功還原Ag+,制備出的AgNPs較傳統(tǒng)方法,其穩(wěn)定性、生物安全性均有所提高,制備過程能耗低且對環(huán)境友好.自此,AgNPs的應(yīng)用也迅速普及,目前納米銀在紡織、食品包裝、醫(yī)療等領(lǐng)域均有一定程度的應(yīng)用,但在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域應(yīng)用的研究和相關(guān)專利仍較少.我國是世界上枸杞產(chǎn)量和出口量最大的國家,以枸杞為原料制備納米銀,材料易得且綠色環(huán)保.以枸杞提取液作為還原劑和穩(wěn)定劑制備的AgNPs,對鰻弧菌、燦爛弧菌、點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌和溶藻弧菌6種水產(chǎn)病原菌有極好的抑菌效果,在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域展示出廣闊的應(yīng)用前景.