黃昭陽,張炎華,朱 穎,翁育偉,

2019年12月,中國武漢報道了由新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染引起的肺炎病例[1],世界衛(wèi)生組織將該病(World Health Organization,WHO)命名為COVID-19(Coronavirus disease 2019)。2020年3月11日,WHO宣布COVID-19已形成“全球大流行”。截至2023年2月10日,全球有超過200個國家和地區(qū)報告COVID-19確診病例超過7.55億,死亡病例683萬例。SARS-CoV-2具有高度變異性,自新冠病毒武漢株之后,先后進化成為Alpha、Beta、Gamma、Zeta、Delta等多種變異株以及數(shù)量不等的子代進化分支。伴隨病毒持續(xù)變異和進化,SARS-CoV-2傳染性逐步增強,并顯示出逐漸增強的免疫逃逸性,2021年11月在南非被首次確認(rèn)的Omicron變異株更是具有高度的傳染性和免疫逃逸能力,對全球公共衛(wèi)生產(chǎn)生了巨大挑戰(zhàn)。由于SARS-CoV-2高度的傳染性和致病性,我國將其列為第二類病原微生物進行管理。根據(jù)《國家實驗室生物安全通用要求》(GB19489-2008),涉及SARS-CoV-2活病毒的試驗均應(yīng)在BSL-3(Bio-safety level-3)實驗室中進行,但由于BSL-3實驗室建設(shè)要求高,數(shù)量較少,極大限制了SARS-CoV-2病原學(xué)、免疫學(xué)等研究工作的開展。

假型化病毒(Pseudotyped virus)是一種被異源外膜蛋白包被,通過基因工程技術(shù)引入復(fù)制缺陷表型的病毒顆粒[2],能很好模擬野生病毒吸附、進入細(xì)胞過程,同時可避免病毒泄漏導(dǎo)致的人員感染,是可替代野生病毒在低生物安全等級實驗室進行各種實驗研究的安全有效的實驗?zāi)Ｐ蚚3]。在體外抗病毒分析和體內(nèi)生物分布分析的數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn),使用假型化病毒與使用活的野生型病毒產(chǎn)生的結(jié)果高度相關(guān)[4-5]。鑒于假型化病毒的相對安全性和可操作性,它被廣泛用于各類新發(fā)和再發(fā)傳染性病毒的實驗研究,包括MERS-CoV[6]、狂犬病毒(Rabies virus)[7]、埃博拉病毒(Ebola virus)[8]、拉薩病毒(Lassa virus)[9]等。為安全、高效開展SARS-CoV-2抗體中和試驗,本研究基于HIV包裝系統(tǒng),通過密碼子優(yōu)化和體外包裝條件的優(yōu)化,構(gòu)建了表達(dá)S蛋白的假型化SARS-CoV-2,并比較了其與野生型病毒在抗體中和試驗結(jié)果的相關(guān)性和一致性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、質(zhì)粒、血清 HEK 293T細(xì)胞購自ATCC,Vero E6細(xì)胞由本課題組保存,pCR-XL-2-TOPO和E.coliTOP 10購自Thermo Fisher Scientific公司。真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)購自南京金斯瑞生物科技股份有限公司,慢病毒骨架載體pHAGE-CMV-Luc2-IRES-ZsGreen-W、pHDM-Hgpm2、pRC-CMV-Rev1b、pHDM-Tat1b購自Addgene。S基因的密碼子優(yōu)化和合成委托南京金斯瑞生物科技股份有限公司進行。血清采集自新冠滅活疫苗加強免疫后(第3劑)人群,本研究通過福建省疾病預(yù)防控制中心倫理審查[閩疾控倫審(2021)第(021)號]。實驗所用野生型SARS-CoV-2均為福建省疾病預(yù)防控制中心BSL-3實驗室分離。

1.2 主要試劑和工具酶 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、青/鏈霉素等購自GIBCO公司。限制性內(nèi)切酶KpnI、NotI購自NEB公司,引物序列由尚亞生物科技有限公司合成,質(zhì)粒小提試劑盒購自北京全式金公司,膠回收試劑盒購自QIAGEN公司,質(zhì)粒大提試劑盒和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine 3000)購自Thermo Fisher Scientific公司,兔抗SARS-CoV-2 S蛋白和山羊抗兔lgG H&L購自Abcam公司,螢火蟲熒光素酶檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 SARS-CoV-2 S基因優(yōu)化、設(shè)計與表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 從COVID-19病例(武漢類似株感染者)樣本提取病毒RNA,使用RT-PCR擴增獲得S蛋白編碼基因全長(引物Spike-Fw/Bw,見表1),反應(yīng)條件為:98 ℃變性10 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸4 min,循環(huán)30次;72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。產(chǎn)物經(jīng)純化后插入pCR-XL-2-TOPO并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,重組質(zhì)粒經(jīng)sanger法測序后進行S基因全長密碼子優(yōu)化,優(yōu)化后的S基因插入pcDNA3.1(+)。

表1 本研究使用的引物序列信息

使用引物(表1)分別對密碼子未優(yōu)化和優(yōu)化后的S基因進行PCR擴增,同時設(shè)計S蛋白C端肽段缺失13個(SEPVLKGVKLHYT)和19個(KFDEDDSEPVLKGVKLHYT)氨基酸的引物,擴增不同長度S基因。在上游引物序列加入kozak序列用以增強轉(zhuǎn)錄效率。將擴增產(chǎn)物分別插入pcDNA3.1(+)并轉(zhuǎn)化E.coliTOP 10,得到6種S蛋白表達(dá)載體,即未經(jīng)密碼子優(yōu)化和優(yōu)化后的全長(W-S1、W-OS1)、C末端缺失13個氨基酸(W-△S13、W-△OS13)、C末端缺失19個氨基酸(W-△S19、W-△OS19)。按照上述方法,參考GenBank病毒序列,構(gòu)建Delta(GISAID:EPI_ISL_10067523.1)和Omicron(GISAID:EPI_ISL_6913991.1)變異株S蛋白的表達(dá)質(zhì)粒(D-△OS13、O-△OS13)。

1.4 假型化病毒包裝與表達(dá)質(zhì)粒篩選 293T細(xì)胞(2.5×105/孔)接種于細(xì)胞板,待細(xì)胞密度生長至70%～90%時進行轉(zhuǎn)染。將上述構(gòu)建的6種S蛋白表達(dá)質(zhì)粒和空載pcDNA3.1(+)分別與pHAGE-CMV-Luc2-IRES-ZsGreen-W、pHDM-Hgpm2、pRC-CMV-Rev1b、pHDM-Tat1b用Lipofectamine 3000共轉(zhuǎn)染進293T細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染6 h后更換為2%血清的培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集上清。

轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定,0.5% Triton X-100室溫通透細(xì)胞,5% BSA封閉,加入兔抗SARS-CoV-2 S1(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,山羊抗兔lgG(1∶2 000)室溫孵育1 h,DAPI對細(xì)胞核染色,在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

將VeroE6細(xì)胞(4×104/孔)接種于96孔板,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后,加入病毒上清(100 μL/孔),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基,每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞,再加入100 μL螢光素酶底物,檢測細(xì)胞內(nèi)的螢光相對發(fā)光值(Relative luminescence units,RLU),篩選螢火蟲螢光酶活性最高的表達(dá)質(zhì)粒類型。

1.5 假型化病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染比例的確定 采用不同比例的包裝質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒,以及不同比例的DNA和Lipofectamine 3000,共9種不同組合共轉(zhuǎn)染293T,24 h后收獲上清。上清感染Vero E6細(xì)胞24 h后,檢測每組RLU。

1.6 不同時間點收獲轉(zhuǎn)染后假型化病毒感染細(xì)胞的能力測定 為確定轉(zhuǎn)染后假型化病毒收集和假型化病毒在Vero E6細(xì)胞最佳表達(dá)時間,分別于轉(zhuǎn)染293T后24～96 h,間隔24 h收集假型化病毒上清,同時在感染VeroE6后24～96 h內(nèi),間隔24 h檢測RLU。

1.7 假型化病毒的滴定 將Vero E6(4×104/孔)接種于96孔板,24 h后吸棄培養(yǎng)液。用含2%FBS培養(yǎng)基系列稀釋(1∶10)假型化病毒,加入細(xì)胞培養(yǎng)孔(100 μL/孔),每個稀釋度做4個復(fù)孔,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后檢測RLU。以高于細(xì)胞對照均值10倍的孔判定為陽性孔,Reed-Muench法計算假型化病毒的50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。

1.8 中和抗體水平檢測

1.8.1 假型化病毒中和抗體試驗 采用上述方法構(gòu)建的假型化病毒檢測201份新冠疫苗加強免疫后的血清中和抗體滴度。實驗設(shè)置3個對照,即陰性對照:未接種新冠疫苗者血清和假型化病毒;病毒對照:只加入假型化病毒;空白對照:不含血清和假型化病毒。將Vero E6(4×104/孔)接種于96孔板,24 h后吸棄培養(yǎng)液,用2% FBS培養(yǎng)基系列稀釋(1∶2～1∶512)血清樣本,每個稀釋度做3個重復(fù)孔。用2%FBS培養(yǎng)基將假型化病毒稀釋至100 TCID50/50 μL。取70 μL稀釋后的血清樣本與70 μL稀釋于含 2% FBS培養(yǎng)基的假型化病毒液混合,37 ℃孵育1 h,取100 μL假型化病毒-血清混合液加入細(xì)胞孔,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后檢測RLU。感染抑制率(%)=(1-血清組RLU/病毒對照組RLU)×100%。抑制率≥50%判定為具有中和活性。該稀釋度即血清中和抗體滴度。

1.8.2 野生型病毒中和抗體試驗 該實驗在福建省疾病預(yù)防控制中心BSL-3實驗室完成。實驗操作與假型化病毒血清中和抗體檢測操作一致,每個稀釋度做3個重復(fù)孔。野生病毒感染細(xì)胞后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至7 d,觀察細(xì)胞病變情況,采用Reed-Muench 法計算50%感染抑制率時血清稀釋倍數(shù),該稀釋度即為該血清樣品的中和抗體滴度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 9.0軟件作圖并進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗;采用Spearman秩相關(guān)性分析,一致性分析采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(ICC),P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SARS-CoV-2 S基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 從病例樣本中擴增的S蛋白全長基因(圖1A),測序結(jié)果表明序列為SARS-CoV-2武漢類似株S基因全長序列。對S基因密碼子優(yōu)化前后的全長、C末端不同缺失長度的基因進行擴增,并于與載體pcDNA3.1(+)連接,獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒用KpnI和NotI雙酶切,其片段大小均與預(yù)期相符合(圖1B),同時測序結(jié)果顯示6種S基因表達(dá)序列正確。

2.2 S蛋白表達(dá)質(zhì)粒的確定 6種武漢類似株S蛋白表達(dá)質(zhì)粒分別與包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞,收集轉(zhuǎn)染后病毒上清,感染Vero E6細(xì)胞。感染24 h后的免疫熒光顯示,Vero E6細(xì)胞胞漿內(nèi)可見有綠色熒光(圖2A-B);感染后Vero E6細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性顯示(圖3),基于W-△OS13構(gòu)建的假型化SARS-CoV-2的熒光素酶活性最高(H=0.329,P=0.566)。參照W-△OS13構(gòu)建方法,構(gòu)建Delta和Omicron變異株的S蛋白表達(dá)質(zhì)粒(D-△OS13和O-△OS13)?；?種變異株S蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的假型化SARS-CoV-2感染Vero E6細(xì)胞,感染24 h后胞漿內(nèi)可見有綠色熒光(圖2C-F)。

注:A-B.W-△OS13;C-D.D-△OS13;E-F.O-△OS13。

圖3 基于6種武漢類似株S蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的假型化SARS-CoV-2感染后細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性

2.3 假型化病毒包裝系統(tǒng)的優(yōu)化和收獲病毒感染細(xì)胞時間點的確定 包裝質(zhì)粒和目的質(zhì)粒(S蛋白表達(dá)質(zhì)粒)比例分別以1∶1、3∶1、4∶1混合,同時以1∶1、1∶2、1∶3比例(μg∶μL)混合質(zhì)粒DNA和Lipfectamine 3000,共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并收集假型化病毒上清,上清感染Vero E6細(xì)胞后測定細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性,各組間比較,結(jié)果為在包裝質(zhì)?！媚康馁|(zhì)粒=3∶1、轉(zhuǎn)染總質(zhì)粒DNA∶Lipfectamine 3000=1∶2條件下,測得的螢火蟲螢光素酶活性最高(H=19.143,P<0.000 1,圖4)。

注:應(yīng)用不同條件下包裝的假型化病毒(W-△OS13)感染Vero E6后,熒光素酶活性差異顯著。control:無質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的空白對照。***:P<0.001;****:P<0.000 1。

在上述轉(zhuǎn)染條件下,間隔24 h收取病毒上清,感染Vero E6細(xì)胞并測定螢光素酶活性,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后24 h收集的假型化病毒,螢光素酶活性最高,隨著收樣時間的延長,滴度降低(H=32.838,P<0.000 1,圖5A);對假型化病毒感染后的不同時間點測定螢光素酶活性,結(jié)果表明,感染后48 h時螢光素酶活性最高,72 h、96 h活性下降(H=15.295,P<0.000 1,圖5B)。

注:A.轉(zhuǎn)染后24 h收獲的假型化病毒(W-△OS13);B.該病毒感染細(xì)胞后48 h檢測,熒光素酶活性相較高。control:無添加假型化病毒的空白對照。**:P<0.01; ****:P<0.000 1。

2.4 中和抗體試驗 分析3種不同變異株的假型化病毒(W-△OS13、D-△OS13、O-△OS13)與相應(yīng)野生型病毒(Wuhan-like、Delta、Omicron)中和抗體實驗的相關(guān)性,結(jié)果顯示(圖6A-C),3種變異株假型化病毒與相應(yīng)野生型病毒的中和試驗結(jié)果呈較強的相關(guān)性(R2分別為0.915 0、0.898 4和0.799 0,均P<0.001);進一步分析3種變異株假型化病毒與相應(yīng)野生型病毒的中和試驗的一致性,Bland-Altman圖(圖7A-C)可見大部分?jǐn)?shù)據(jù)點落在95%一致性界限之內(nèi),對應(yīng)的ICC分別0.957、0.943和0.880,顯示假型化病毒與野生型病毒中和試驗結(jié)果有較好的一致性(P<0.001,表2)。

注:A.野生型病毒W(wǎng)uhan-like與假型化病毒W(wǎng)-△OS13;B.野生型病毒Delta與假型化病毒D-△OS13;C.野生型病毒Omicron與假型化病毒O-△OS13。圖中上、下虛線為95%一致性界限的上、下限。

表2 野生型病毒與假型化病毒組內(nèi)相關(guān)系數(shù)

3 討 論

隨著新冠病毒感染疫情的持續(xù)蔓延和大量變異株的出現(xiàn),研發(fā)有效的疫苗和抗病毒藥物是當(dāng)前控制新冠病毒感染疫情的迫切需要,而相關(guān)研發(fā)工作無法避免使用病毒分離株。出于實驗室生物安全的考慮,以及生物安全管理的限制,目前SARS-CoV-2無法在低等級實驗室使用,極大限制了上述研發(fā)工作的開展。由于假型化病毒表面可嵌合異源病毒表面蛋白,能夠很好的模擬異源野生型病毒,同時極大減少人員感染和病毒的傳播,因此許多研究者采用人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV-1)和水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)包裝系統(tǒng),構(gòu)建假型化病毒用于替代野生型SARS-CoV-2,開展疫苗和藥物研發(fā)以及其他涉及活病毒的科研工作。Schmidt F等[10]利用復(fù)制缺陷的HIV-1病毒質(zhì)粒,將其與密碼子優(yōu)化后的SARS-CoV-2刺突蛋白表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生SARS-CoV-2假型化病毒。Ou X等[11]將SARS-CoV-2 S蛋白表達(dá)質(zhì)粒psPAX2和pLenti GFP共轉(zhuǎn)染到HEK 293T細(xì)胞中,成功構(gòu)建出SARS-CoV-2假型化病毒。Nie J等利用SARS-CoV-2 S蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1和VSV包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞構(gòu)建成功假型化病毒,并在 VSV基因組中攜帶螢火蟲熒光素酶[12],成功建立了基于假型化病毒的抗體中和試驗[13]。

S蛋白是SARS-CoV-2的主要外膜蛋白,介導(dǎo)病毒吸附和感染,是SARS-CoV-2疫苗和藥物研制主要靶點[14],但S蛋白胞內(nèi)表達(dá)后,需經(jīng)歷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體之間的中間室膜上組裝和“出芽”,由于其C末端二元基序突變或氨基酸缺失可導(dǎo)致缺乏細(xì)胞內(nèi)定位信號,有利于S蛋白向細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運,促進細(xì)胞表面S蛋白的增加和合胞體的形成并引導(dǎo)感染在細(xì)胞間的傳播[15]。在假型化病毒構(gòu)建中,有研究表明,S蛋白C端缺失18個[16]或19個[17]氨基酸可顯著提高SARS-CoV-2假型化病毒滴度;另外,Nie Y等[18]報道優(yōu)化S蛋白的N 端信號肽序列亦可提高SARS-CoV-2假型化病毒包裝效率。因此,為提高假型化病毒的滴度,本研究除對S基因密碼子進行優(yōu)化的基礎(chǔ)上,對其C末端進行截短,結(jié)果表明,在C端缺失13個氨基酸條件下所產(chǎn)生的假型化病毒滴度較高。除了對S基因進行優(yōu)化外,本研究還對包裝條件進行了優(yōu)化,結(jié)果表明,當(dāng)包裝質(zhì)?！媚康馁|(zhì)粒=3∶1,質(zhì)粒DNA∶Lipfectamine3000=1∶2,轉(zhuǎn)染后24 h后收獲的假型化病毒滴度較高,同時細(xì)胞感染48 h后病毒的表達(dá)水平較高。這與其他研究者的結(jié)果類似,有研究表明,當(dāng)骨架質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒配比為2∶1時,所產(chǎn)生的假型化病毒滴度較高[19];Hu J等[17]發(fā)現(xiàn)用轉(zhuǎn)染48 h后收集的假型化病毒侵染細(xì)胞72 h后侵染效率最高等。因此,通過上述條件的優(yōu)化,我們成功的構(gòu)建了基于HIV包裝系統(tǒng)的假型化SARS-CoV-2,并獲得較高的病毒滴度。

除不斷出現(xiàn)新變異株外,SARS-CoV-2新變異株的復(fù)制、傳播能力也普遍增強,有研究顯示,Delta感染后病毒濃度是武漢株的1 000倍[20],傳染性幾乎是最初武漢毒株的兩倍;而Omicron變異株是一種傳播力更強、感染率更高的變異毒株[21-22]。盡管有報道稱兩次接種早期毒株生產(chǎn)的疫苗對Delta具有一定的有效率[23],但是隨著病毒變異增加,新變異株是否對疫苗的保護產(chǎn)生免疫逃逸,需要更多的研究來加以評價?；诖?本研究在成功構(gòu)建武漢株假型化病毒的基礎(chǔ)上,對Delta和Omicron這2種主要流行變異株進行了假型化,并對3種假型化病毒的抗體中和檢測的效果,與基于野生型病毒的中和檢測結(jié)果進行了比較[24-25],結(jié)果表明,本研究構(gòu)建的3種假型化病毒檢測結(jié)果與野生型病毒檢測結(jié)果具有較好的一致性和相關(guān)性。但同時本研究也發(fā)現(xiàn),兩者間的相關(guān)性系數(shù)R2和組內(nèi)相關(guān)系數(shù)ICC隨著病毒變異度的增加而逐漸下降,其原因可能在于,本研究中構(gòu)建假型化病毒選取的Delta和Omicron 2種變異株的S蛋白基因來自于該變異株的原始毒株序列,而野生型病毒來自于變異株的子代分支(分離株),因此在構(gòu)建假型化SARS-CoV-2以及后續(xù)中和試驗的應(yīng)用中,可能需要考慮S基因的來源問題。

綜上,本研究成功構(gòu)建了基于HIV包裝系統(tǒng)的SARS-CoV-2假型化病毒系統(tǒng),中和抗體檢測結(jié)果表明,3種變異株假型化病毒與野生病毒中和抗體結(jié)果有良好的相關(guān)性和一致性,因此所構(gòu)建的假型化病毒可作為一個安全、可靠、適宜替代品,用于在低等級實驗室開展SARS-CoV-2相關(guān)的免疫學(xué)等試驗,同時本研究的構(gòu)建方法,對于新發(fā)變異株以及其他高致病性披膜病毒的假型化有重要的參考價值和良好的應(yīng)用前景。

利益沖突：無

引用本文格式：黃昭陽,張炎華,朱穎,等.應(yīng)用于抗體中和試驗的假型化新型冠狀病毒的構(gòu)建[J].中國人獸共患病學(xué)報,2023,39(9):857-864.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.102