宋淼,鄒通,徐禮斌,龔雪琳,王笑峰,邢士超

(青島大學(xué),山東 青島 266021 1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系; 2 口腔醫(yī)學(xué)院)

尿酸是嘌呤代謝的終末產(chǎn)物。在我國,高尿酸血癥(HUA)的患病率為13.3%,其中女性的患病率為7.9%[1-2]。近年來,女性不孕率不斷升高,這與飲食、生活習(xí)慣和環(huán)境等因素密切相關(guān)[3]。研究表明,HUA與女性生殖障礙之間存在密切聯(lián)系,但其機(jī)制尚不清楚[4-5]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,親吻肽(Kiss-peptin)通過調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素(GnRH)影響下丘腦-垂體-性腺軸[6]。Kisspeptin蛋白由吻素1(KISS1)基因所編碼,通過與吻素1受體(KISS1R)結(jié)合,發(fā)揮其生物學(xué)功能[7]。Kisspeptin和其受體KISS1R基因敲除的小鼠無正常的動情周期,且卵巢更小,存在生育困難[8-9]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建HUA雌性大鼠模型,觀察雌鼠動情周期、器官濕質(zhì)量系數(shù)、卵巢病理變化及卵巢組織中KISS1和KISS1RmRNA的表達(dá),探究HUA對雌鼠生殖功能的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康成年雌性Wistar大鼠14只,12周齡,體質(zhì)量為(240±20)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。腺嘌呤(北京索萊寶生物科技有限公司);氧嗪酸鉀(生工生物工程股份有限公司);質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10的高酵母飼料(北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司);毛細(xì)玻璃管(華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠);真空采血管(康衛(wèi)仕醫(yī)療器械有限公司);低溫離心機(jī)(賽默飛科技有限公司);PCR試劑盒(塞維爾生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動物分組及處理 采用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為HUA組和對照組,每組7只。HUA造模參考李傳偉等[10]的方法。HUA組大鼠飲食分為兩個(gè)階段:第1階段,飼喂高酵母飼料,并且用40 g/L的腺嘌呤溶液按照100 mg/(kg·d)的劑量灌胃;在檢測到大鼠血尿酸(SUA)水平顯著下降時(shí),進(jìn)入第2階段,繼續(xù)飼喂高酵母飼料,腺嘌呤劑量減半,同時(shí)每日12:00給予大鼠腹腔注射氧嗪酸鉀,用量為100 mg/(kg·d)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)持續(xù)9周。對照組大鼠飼喂普通飼料,并且給予等體積的蒸餾水進(jìn)行灌胃。兩組大鼠均每間隔1周內(nèi)眥取血0.5 mL,以3 500 r/min 離心10 min,取血清,采用生化分析儀檢測SUA。

1.2.2動情周期觀察 在確認(rèn)造模成功后(第7周),每天8:00和20:00,抓取大鼠放置于手心,將沾有生理鹽水的細(xì)小棉棒緩慢地插入大鼠陰道后稍停留,并輕輕旋轉(zhuǎn),緩慢地拔出,將陰道內(nèi)含物均勻地涂抹在載玻片上,待自然干燥后,用亞甲藍(lán)染色5 min,顯微鏡下觀察。參考印丹丹等[11]的方法,根據(jù)細(xì)胞種類和比例的變化來判斷動情周期,直至觀察一個(gè)完整的動情周期。

1.2.3器官濕質(zhì)量系數(shù)測定 在造模第9周后處死大鼠,留取完整的子宮、卵巢,吸干表面水分后稱質(zhì)量,計(jì)算器官系數(shù)。子宮(卵巢)系數(shù)=子宮(卵巢)質(zhì)量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)×100%。

1.2.4卵巢組織病理學(xué)觀察 卵巢稱質(zhì)量后,取部分組織立即置于40 g/L甲醛中進(jìn)行固定,制備組織蠟塊,切片(5 μm),行蘇木精-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察。

1.2.5卵巢組織KISS1和KISS1RmRNA表達(dá)檢測 剩余部分卵巢組織用trizol提取mRNA,逆轉(zhuǎn)成為cDNA后,使用PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測。所用引物及其序列見表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

表1 PCR引物及其序列(5′→3′)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組SUA水平比較

在模型構(gòu)建第1、5、7、9周時(shí),HUA組大鼠的SUA水平均顯著高于對照組(F=9.430～28.910,P<0.05),表明HUA大鼠模型造模成功。見表2。

表2 兩組大鼠SUA水平比較

2.2 兩組動情周期比較

雌性大鼠動情周期可分為4個(gè)階段。①動情前期:涂片可見大量有核上皮細(xì)胞和少量的角化上皮細(xì)胞(圖1A);②動情期:涂片可見滿視野的角化上皮細(xì)胞和少量的有核上皮細(xì)胞(圖1B);③動情后期:涂片上有核上皮細(xì)胞、角化上皮細(xì)胞、白細(xì)胞均可見且比例相當(dāng)(圖1C);④動情間期:可見大量的白細(xì)胞和黏液(圖1D)。與對照組相比,HUA組大鼠動情前期、動情期、動情后期時(shí)間無明顯變化,而動情間期明顯縮短(F=14.000,P<0.01)。見表3。

A:動情前期;B:動情期;C:動情后期;D:動情間期。亞甲藍(lán)染色,200倍。

表3 兩組大鼠動情周期比較

2.3 兩組器官濕質(zhì)量系數(shù)比較

與對照組相比,HUA組大鼠的子宮系數(shù)無明顯變化,但卵巢系數(shù)顯著下降(t=2.377,P<0.05),說明HUA對卵巢產(chǎn)生影響。見表4。

表4 兩組器官濕質(zhì)量系數(shù)比較

2.4 卵巢組織病理學(xué)觀察

兩組大鼠卵泡細(xì)胞的發(fā)育和成熟正常,病理切片無明顯改變,說明HUA對卵巢組織沒有明顯破壞。見圖2。

2.5 兩組卵巢組織KISS1和KISS1R mRNA表達(dá)比較

qPCR檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,HUA組大鼠卵巢組織中KISS1和KISS1RmRNA表達(dá)顯著增高(t=3.456、5.408,P<0.05)。見表5。

表5 兩組大鼠卵巢組織KISS1和KISS1R基因表達(dá)比較

3 討 論

隨著生活水平的提高,我國HUA發(fā)病率越來越高,女性發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐年增長的趨勢。尿酸不僅已經(jīng)被證實(shí)是心血管疾病和高脂血癥、糖尿病等代謝類疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素[12],還與多種女性生殖障礙類疾病相關(guān),如多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位、妊娠并發(fā)癥等[5,13]。

在雌性哺乳動物中,動情周期分為動情前期、動情期、動情后期和動情間期4個(gè)階段。雌性大鼠體內(nèi)的激素水平、卵巢和子宮的生理狀態(tài)都隨著動情周期的改變而變化,動情周期是雌性生殖健康的重要標(biāo)志[14]。動情周期是由下丘腦-垂體-性腺軸所控制的,主要通過GnRH進(jìn)行調(diào)節(jié),主要有兩種調(diào)節(jié)模式:一種是脈沖式分泌模式,負(fù)責(zé)刺激卵泡發(fā)育和類固醇生成;另一種則是激增分泌模式,主要負(fù)責(zé)誘導(dǎo)促黃體生成素的激增[15]。KISS1R是GnRH神經(jīng)元脈沖式分泌活動調(diào)節(jié)的關(guān)鍵受體[16]。荀文娟等[17]研究發(fā)現(xiàn),KISS1/KISS1R系統(tǒng)對豬的發(fā)情周期具有重要的調(diào)節(jié)作用。本文研究結(jié)果顯示,與對照組相比較,HUA組大鼠卵巢組織中KISS1和KISS1RmRNA的表達(dá)水平均明顯增高,尤其是KISS1RmRNA的表達(dá)增高更為顯著。KISS1RmRNA編碼的產(chǎn)物為Kisspeptin蛋白受體,本研究HUA組大鼠動情間期縮短,可能是由于KISS1R表達(dá)水平升高,使大鼠對激素更加敏感所致。

卵巢KISS1/KISS1R系統(tǒng)還控制著卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟、調(diào)節(jié)排卵和卵巢類固醇激素的合成等[18]。FABOV等[19]研究發(fā)現(xiàn),在卵巢的體外模型中,低劑量的Kisspeptin蛋白對卵巢有保護(hù)、抗凋亡的作用,而高劑量的Kisspeptin蛋白對卵巢具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。本研究HUA組大鼠卵巢組織中KISS1mRNA表達(dá)水平增高,但卵巢系數(shù)下降。猜測這可能是由于卵巢中Kisspeptin蛋白過量表達(dá),卵巢功能被抑制所導(dǎo)致的。但目前尚缺乏直接證據(jù)與大規(guī)模的臨床研究證實(shí)這一猜測。

綜上所述,HUA可能通過KISS1系統(tǒng)導(dǎo)致雌性大鼠動情周期紊亂和卵巢系數(shù)下降,這為HUA的早期篩查及其并發(fā)癥的預(yù)防性治療提供了新的理論依據(jù),也為女性生殖障礙相關(guān)疾病的診療提供了新的思路。