楊 姣,楊衛(wèi)誠(chéng),吳高殷,車(chē)冰潔,梁紅飛,周壁波

(貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,貴州師范大學(xué)喀斯特洞穴研究中心,貴陽(yáng) 550025)

桫欏(Alsophilaspinulosa)屬桫欏科(Cyatheaceae)桫欏屬(Alsophila),國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物,現(xiàn)存唯一的木本蕨類(lèi)植物,主要生長(zhǎng)于溫暖潮濕的熱帶及亞熱帶地區(qū),中國(guó)主要分布于貴州、重慶、四川等地[1]。外形上,桫欏樹(shù)形高雅飄逸、青翠碧綠,特別是排列整齊的孢子囊群是自然界的奇特景觀。桫欏莖、葉含有豐富的黃酮、多酚、多糖、有機(jī)酸等活性物質(zhì),具有較高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值,運(yùn)用及開(kāi)發(fā)潛力大[2-5]。然而,桫欏營(yíng)養(yǎng)葉易被桫欏葉蜂(Rhoptroceroscyatheae)和綠帶妒尺蛾(Phthonolbaviridifasciata)幼蟲(chóng)取食和破壞,且其孢子繁殖周期長(zhǎng),生長(zhǎng)緩慢。野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)地質(zhì)表層桫欏幼苗極少,自然更新困難,極大地限制了桫欏種群的發(fā)展[6]。植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為一種高效的無(wú)性繁殖方法,具有繁殖周期短、繁殖效率高和不受季節(jié)限制等特點(diǎn)。原葉體綠色球狀體(prothallus green globular body,PGGB)是由原葉體不斷增殖形成似球狀的特殊結(jié)構(gòu)。

蕨類(lèi)植物組織培養(yǎng)中可通過(guò)PGGB途徑建立高效的繁殖體系,通過(guò)相應(yīng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)該途徑。張港隆等通過(guò)芒萁(Dicranopterispedata)孢子誘導(dǎo)萌發(fā)的原葉體在6-BA與KT的組合下成功誘導(dǎo)出PGGB,實(shí)現(xiàn)PGGB高效增殖,建立了穩(wěn)定、高效的芒萁繁殖體系[7]。朗月婷等[8]以陰生桫欏(Alsophilalatebrosa)、大葉黑桫欏(Alsophilagigantea)和侯夢(mèng)丹等[9]以桫欏孢子為外植體,通過(guò)不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及比例初步建立其繁殖體系。但孢子萌發(fā)率、分化率和生根率均較低,其技術(shù)尚未成熟,未能得以推廣應(yīng)用。本文在前人研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化桫欏孢子萌發(fā)條件、配子體增殖、分化以及組培苗移栽等過(guò)程,以期構(gòu)建1個(gè)高效的桫欏再生繁殖體系,為進(jìn)一步探究桫欏體外培養(yǎng)發(fā)育機(jī)制、新品種培育、規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 桫欏孢子采集與保存

1.2 桫欏孢子預(yù)處理與無(wú)菌孢子獲取

試驗(yàn)前對(duì)孢子浸泡12 h后消毒,無(wú)菌孢子獲取參照郎月婷等[8]的方法,制成無(wú)菌孢子懸浮液。

1.3 桫欏孢子誘導(dǎo)配子體

將無(wú)菌孢子懸浮液接種至1/8 MS(大量元素濃度為MS的1/8,鐵鹽、微量元素、有機(jī)物濃度與MS等量)基本培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中添加蔗糖20 g/L,瓊脂10 g/L,6-BA(0.5,1.0,1.5 mg/L),NAA(0.05,0.10,0.20,0.30 mg/L),以不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為空白,每皿接種無(wú)菌懸浮液400 μL,每個(gè)處理接種3皿,重復(fù)3次。

培養(yǎng)條件:溫度(25±2) ℃,光照強(qiáng)度為3 000 lx,12 h/d,每周觀察1次(下同),30 d后記錄誘導(dǎo)率。在OLYMPUS SZ體式顯微鏡(奧林巴斯(深圳)工業(yè)有限公司)下任取10個(gè)視野觀察、記錄桫欏孢子誘導(dǎo)配子體情況。

1.4 桫欏配子體誘導(dǎo)PGGB

把處于蝶形原葉體時(shí)期的配子體切割成4 mm×4 mm方塊,鮮重約0.102 g接種至1/2 MS培養(yǎng)基中,添加6-BA(0.2,0.3,0.5 mg/L),NAA(0.2,0.4,0.6 mg/L),兩兩對(duì)應(yīng)組合,蔗糖30 g/L,瓊脂6 g/L,以不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為空白,pH 5.8。

每組處理接種10瓶,每瓶接種4個(gè)配子體,重復(fù)3次。培養(yǎng)2個(gè)月后,統(tǒng)計(jì)PGGB的誘導(dǎo)率、鮮重、直徑以及球狀體的顏色與長(zhǎng)勢(shì)情況。

1.5 桫欏PGGB分化

將誘導(dǎo)成功的PGGB分割成直徑約為1.2 cm的小球接種于1/2 MS培養(yǎng)基,加入KT(0.3,0.5,0.7 mg/L)、IBA(0.1,0.2,0.3,0.4 mg/L)、蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L,以不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為空白,pH 5.8。每隔15 d用消毒后的噴壺在PGGB表面噴施無(wú)菌水0.3 mL。每組接種10瓶,每瓶接種3個(gè),重復(fù)3次。培養(yǎng)1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)PGGB分化率、分化的莖芽數(shù),孢子體長(zhǎng)勢(shì)與顏色。

1.6 桫欏孢子體生根

將孢子體接種在1/2 MS培養(yǎng)基中,添加蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L、IAA(0.3,0.5,0.7,1.0 mg/L)和IBA(0.3,0.5,0.7,1.0 mg/L),以不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為空白,pH 5.8。每組接種30瓶,每瓶接種1個(gè),重復(fù)3次,培養(yǎng)1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)生根情況。

1.7 桫欏組培苗練苗、移栽培養(yǎng)

將高為5 cm以上的桫欏再生植株在人工氣候室進(jìn)行馴化,練苗1周后移栽至不同滅菌后基質(zhì)(表1)中,并用保鮮膜覆蓋。每組移栽30株,重復(fù)3次。每周觀察桫欏組培苗的生長(zhǎng)情況,培養(yǎng)30 d,統(tǒng)計(jì)組培苗成活率。煉苗培養(yǎng)條件:溫度(24±2) ℃,濕度(89±2)%,光質(zhì)為白光,光照周期為16 h/d。

3.大數(shù)據(jù)管理決策能力。 “互聯(lián)網(wǎng)+”時(shí)代，政府治理主體和對(duì)象數(shù)據(jù)信息呈爆發(fā)式增長(zhǎng)，局限于傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)、管理、應(yīng)對(duì)手段無(wú)法摸清經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展及政府行政真實(shí)情況，更難做出科學(xué)有效的治理決策，只有借助大數(shù)據(jù)技術(shù)獲取、處理和分析海量信息，支撐經(jīng)濟(jì)管理、政務(wù)服務(wù)和社會(huì)關(guān)系塑造等治理活動(dòng)，才能夠保障政府行為的精確度和科學(xué)性。

表1 不同的土壤基質(zhì)及體積比例

1.8 數(shù)據(jù)收集與統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2021和SPSS統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù),Origin作圖。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,采用單因素檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析,顯著性水平P<0.05。

配子體誘導(dǎo)率=視野里誘導(dǎo)形成的配子體數(shù)/視野里總的孢子數(shù)×100%;PGGB誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)形成的PGGB數(shù)/接種總數(shù)×100%;PGGB分化率=分化的PGGB數(shù)/接種總數(shù)×100%;生根率=生根的孢子體數(shù)/接種的孢子體總數(shù)×100%;成活率=成活的桫欏試管苗/移栽的桫欏試管苗×100%;增殖倍數(shù)=PGGB的鮮重/0.102,0.102是配子體誘導(dǎo)PGGB前的初始鮮重(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 桫欏孢子組織培養(yǎng)過(guò)程的形態(tài)特征

桫欏孢子(圖1,A)接種于培養(yǎng)基上20 d后變綠,誘導(dǎo)形成配子體。首先是綠色細(xì)胞增殖發(fā)育成絲狀體(圖1,B),絲狀體不斷生長(zhǎng)發(fā)育形成片狀體(圖1,C)、蝶形原葉體(圖1,D)、成熟配子體(圖1,E)。

A.孢子;B.絲狀體;C.片狀體;D.蝶形原葉體;E.成熟配子體;F.PGGB;G.精子器;H.頸卵器;I.配子體分化;J.孢子體;K.孢子體的根;L.幼苗移栽。

配子體后期誘導(dǎo)成PGGB團(tuán)(圖1,F),隨PGGB增殖,其配子體腹面上的精子器(圖1,G)與生長(zhǎng)點(diǎn)上的頸卵器(圖1,H)不斷發(fā)育成熟,經(jīng)噴施無(wú)菌水后,促進(jìn)受精過(guò)程,而生長(zhǎng)出無(wú)拳卷的葉、葉脈呈二叉狀分枝形成孢子體(圖1,I),在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)孢子體生根,并將桫欏再生植株移栽在基質(zhì)中(圖1,J、圖1,K和圖1,L)。

2.2 桫欏孢子誘導(dǎo)配子體

不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)配子體誘導(dǎo)率、誘導(dǎo)時(shí)間差異顯著(P<0.05)(表2)。同一NAA濃度下,配子體誘導(dǎo)率隨6-BA濃度升高逐漸下降,誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)。同一6-BA濃度下,配子體誘導(dǎo)率隨NAA濃度升高整體上呈先升高后降低的趨勢(shì),在高濃度6-BA中誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng),然而,在L2中誘導(dǎo)率最高(64.62%),誘導(dǎo)時(shí)間最少(23 d),均與CK差異顯著(P<0.05)。

表2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)桫欏孢子誘導(dǎo)配子體的影響

2.3 配子體誘導(dǎo)PGGB

將處于蝶形原葉體時(shí)期的配子體接種于Z1～Z9培養(yǎng)基中誘導(dǎo)PGGB(圖2),PGGB誘導(dǎo)率(100%)不具顯著性差異(P>0.05),均顯著高于CK(P<0.05),其增殖倍數(shù)、鮮重差異顯著(P<0.05),PGGB直徑差異不顯著(P>0.05)。同一6-BA濃度下,隨著NAA濃度上升,PGGB鮮重、PGGB直徑、PGGB增殖倍數(shù)均整體下降;同一NAA濃度下,6-BA的濃度上升,PGGB鮮重、PGGB直徑、PGGB增殖倍數(shù)整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。其中,Z5組PGGB鮮重、PGGB直徑、PGGB增殖倍數(shù)最高,并且與CK有顯著差異(P<0.05,見(jiàn)表3)。因此,選取1/2 MS+ 0.3 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA作為配子體誘導(dǎo)PGGB適宜培養(yǎng)基。

圖2 Z1～Z9對(duì)應(yīng)不同培養(yǎng)基下誘導(dǎo)成功的PGGB

表3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)PGGB誘導(dǎo)增殖的影響

2.4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)PGGB分化的影響

將PGGB轉(zhuǎn)接至H1～H12分化培養(yǎng)基中,其分化率、總莖芽數(shù)、株高、莖葉長(zhǎng)以及寬均具顯著差異(P<0.05)(圖3、表4)。隨著KT濃度增加,分化率、分化莖芽數(shù)、株高、莖葉的長(zhǎng)及寬總體上呈現(xiàn)先增加后減少。當(dāng)KT濃度小于0.5 mg/L時(shí),PGGB分化率、分化莖芽數(shù)隨著IBA濃度升高而增加;相反,當(dāng)KT濃度大于0.5 mg/L時(shí),其隨IBA濃度升高而降低。綜上所述,PGGB在H4組(1/2 MS+0.3 mg/L KT +0.4 mg/L IBA)培養(yǎng)基中的分化率、總莖芽數(shù)、株高、莖葉的長(zhǎng)及寬是最好的,并且與CK均有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 H1～H12對(duì)應(yīng)不同的培養(yǎng)基的PGGB分化

表4 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)PGGB分化率、總莖芽、株高、莖長(zhǎng)及莖寬的影響

2.5 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)桫欏孢子體生根及生長(zhǎng)發(fā)育的影響

將分化的的桫欏孢子體接種于F1～F8生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,其生根率均為100%(表5),顯著高于CK(33.3%)(P<0.05)。隨著IBA濃度增加,桫欏植株的根數(shù)、根長(zhǎng)、株高、葉片數(shù)量、葉長(zhǎng)、葉寬呈現(xiàn)上升趨勢(shì),均在F4中最高;而隨著IAA濃度增加,桫欏植株的根數(shù)、根長(zhǎng)、株高、葉片數(shù)量、葉長(zhǎng)、葉寬呈現(xiàn)下降趨勢(shì),但其根長(zhǎng)、生根數(shù)、株高、葉片數(shù)量、葉長(zhǎng)及寬無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表6)。由此可知,H4組(1/2 MS+1.0 mg/L IBA)是桫欏孢子體最適合的生根誘導(dǎo)及生長(zhǎng)發(fā)育培養(yǎng)基(圖4)。

F3、F4孢子體誘導(dǎo)根有分支、有根毛。

表6 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)桫欏孢子體葉片數(shù)量、株高、葉長(zhǎng)以及葉寬的影響

2.6 桫欏組培苗練苗、移栽培養(yǎng)

將高為5 cm以上的桫欏組培苗移栽至不同基質(zhì)中,結(jié)果(圖5)表明不同基質(zhì)對(duì)桫欏組培苗成活率具有顯著性差異(P<0.05)。

A.黃壤∶泥炭土(1∶1)∶桫欏幼苗葉片邊緣變黃;B.紅壤基質(zhì)的桫欏幼苗;C.紅壤∶泥炭土∶腐殖土(2∶1∶1)的桫欏幼苗。

其中,桫欏組培苗在C8基質(zhì)中成活率最高達(dá)96.3%(表7),顯著高于C2基質(zhì),與CK、C1、C3～C9無(wú)顯著差異(P>0.05),但其葉片翠綠,生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)。因此,選擇C8中紅壤∶腐殖土∶泥炭土(2∶1∶1)的基質(zhì)作為桫欏組培苗適宜的移栽基質(zhì)。

表7 不同基質(zhì)對(duì)桫欏組培苗移栽的影響

3 討 論

研究利用PGGB途徑與組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合的繁殖方式,以桫欏孢子為外植體進(jìn)行優(yōu)化,并構(gòu)建桫欏快繁體系,提高配子體誘導(dǎo)率、PGGB誘導(dǎo)率、PGGB分化率、孢子體生根率,最后進(jìn)行移栽。前人研究表明,桫欏孢子誘導(dǎo)配子體、配子體誘導(dǎo)PGGB及分化、孢子體生根等過(guò)程受諸多外部因素影響,如溫度、濕度、光照強(qiáng)度、光周期、培養(yǎng)基種類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽濃度、糖的種類(lèi)以及濃度、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)以及濃度、pH值等[10-13]。其中,植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)蕨類(lèi)植物孢子組織培養(yǎng)過(guò)程中的發(fā)育及生長(zhǎng)具有重要作用。

PGGB途徑作為蕨類(lèi)植物組織培養(yǎng)中特有的繁殖路徑,具有用材少、繁殖效率高和增殖系數(shù)大等特點(diǎn)。通過(guò)PGGB途徑來(lái)構(gòu)建桫欏的組培體系,在桫欏配子體誘導(dǎo)PGGB、分化、生根的過(guò)程中,生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)與濃度對(duì)其誘導(dǎo)、分化、生根有重要作用。赤霉素(gibberellins,GA)、成精子囊素(anteridiogen,An)、細(xì)胞分裂素(cytokinin,CK)、生長(zhǎng)素(auxin,AUX)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、乙烯(ethylene,Eth)、脫落酸(abscisic acid,ABA)、油菜素內(nèi)脂(Brassinolide,BR)等不同種類(lèi)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能不同程度地影響蕨類(lèi)植物孢子萌發(fā)、配子體的生長(zhǎng)發(fā)育、孢子體的形成等過(guò)程[14-16]。生長(zhǎng)素激活細(xì)胞,促進(jìn)有絲分裂;細(xì)胞分裂素能刺激細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)過(guò)程;赤霉素協(xié)調(diào)細(xì)胞分裂的過(guò)程、性別決定,促進(jìn)了蕨類(lèi)植物配子體腹面的精子器形成[17]。細(xì)胞分裂素6-BA、生長(zhǎng)素NAA在蕨類(lèi)植物組培中常搭配使用于孢子萌發(fā)與配子體的增殖。王陽(yáng)[18]在研究東北對(duì)開(kāi)蕨(Phyllitisscolopendrium)的組培中發(fā)現(xiàn)6-BA對(duì)孢子萌發(fā)、原葉體增殖中有明顯促進(jìn)作用,特別是0.5 mg/L 6-BA的增殖效果最好;但是,6-BA的濃度越大、原葉體增殖效果不佳、鮮重越小。陳朋等[19]的研究表明6-BA濃度低于1.5 mg/L可觀察到粵紫萁(Osmundamildei)孢子萌發(fā),并且6-BA在0.5～1.0 mg/L范圍與低濃度NAA組合有利于原葉體增殖,6-BA大于1.5 mg/L時(shí)則抑制其增殖,這與本研究桫欏孢子誘導(dǎo)配子體結(jié)果一致,表明低濃度6-BA與NAA組合對(duì)孢子誘導(dǎo)配子體的誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)時(shí)間具有顯著促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)KT、ZT雖然都能使孢子誘導(dǎo)配子體,但存在誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng),誘導(dǎo)時(shí)會(huì)出現(xiàn)有絨毛狀假根,原葉體增殖停滯,顏色黃綠。然而,0.5 mg/L 6-BA與0.1 mg/L NAA或者0.1 mg/L 2,4-D組合時(shí),都能一定程度上縮短了誘導(dǎo)時(shí)間;但是,6-BA與 NAA配合時(shí),配子體顏色碧綠、長(zhǎng)勢(shì)好;而6-BA與2,4-D組合時(shí),配子體顏色變淡,不僅出現(xiàn)假根現(xiàn)象,且部分出現(xiàn)褐化;這與Bonomo等[20]對(duì)樹(shù)蕨(Alsophilaodonelliana)的孢子萌發(fā)、配子體發(fā)育研究結(jié)果相似,在6-BA的濃度為0.01,0.1,1.0 mg/L時(shí),促進(jìn)了原葉體的形成;0.1 mg/L的2,4-D會(huì)縮短絲狀體蛋白的形成而促進(jìn)了絲狀體的形成。就PGGB誘導(dǎo)而言,與朗月婷等[8]研究陰生桫欏GGB誘導(dǎo)結(jié)果一致,低濃度的6-BA與NAA組合能夠緩解PGGB的原葉體碎小、假根現(xiàn)象,PGGB誘導(dǎo)率為100%,特別是0.3 mg/L 6-BA與0.4 mg/L NAA組合使PGGB直徑、增殖倍數(shù)和鮮重達(dá)到最佳,這可能與不同蕨類(lèi)植物誘導(dǎo)GGB或者PGGB時(shí),對(duì)激素種類(lèi)及濃度適應(yīng)度不同有關(guān)。

在研究蕨類(lèi)植物的世代交替的繁殖過(guò)程中,配子體向孢子體轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵是成熟配子體上的精子器與頸卵器能夠進(jìn)行受精作用,故PGGB進(jìn)行分化前,受精是分化的關(guān)鍵。過(guò)去研究表明,赤霉素、成精子囊素、光等因素會(huì)影響精子器的形成[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)KT是影響PGGB分化的主要因子,與張艷琴等[23]研究鐵線蕨(Adiantumcapillus-veneris)孢子體的產(chǎn)生以及朗月婷等[8]研究陰生桫欏GGB分化的結(jié)果相似,KT的濃度越大,分化率降低。前人研究表明,不加任何激素也會(huì)誘導(dǎo)孢子體的分化。比如粵紫萁[19]、大葉黑桫欏[24]。還有研究表明,波斯頓蕨(Nephrolepisexaltata‘Bostoniensis’)的GGB在1.2 mg/L 6-BA與0.4 mg/L NAA的濃度下能分化出大量孢子體[25],而桫欏配子體在0.1 mg /L NAA 與0.5 mg /L BA組合下分化出大量孢子體[12],這可能與分化前配子體增殖或者PGGB誘導(dǎo)使用的激素不同有關(guān),也與不同物種其內(nèi)部激素的差異有關(guān)。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),除了KT能促進(jìn)PGGB的分化外,ZT也能影響PGGB的分化,不過(guò)ZT誘導(dǎo)分化時(shí),會(huì)使PGGB增大、分化莖葉少、孢子體不長(zhǎng)高、孢子體的葉片變黃。低濃度KT與IBA組合時(shí),IBA的濃度越高,越能促進(jìn)PGGB分化以及莖葉、莖芽的長(zhǎng)及寬、孢子體株高的伸長(zhǎng)。

桫欏的孢子體分化后,需對(duì)其進(jìn)行生根誘導(dǎo),而生長(zhǎng)素IBA、NAA、IAA等是植物再生苗常用的生根誘導(dǎo)激素。葉秀仙等[26]與劉偲[27]等報(bào)道了生長(zhǎng)素NAA對(duì)鹿角蕨(Platyceriumwallichii)孢子體的生根有促進(jìn)作用,并且NAA的濃度越大,既能縮短生根時(shí)間,也能促進(jìn)生根率以及生根數(shù)。桂皮紫萁孢子體在IBA 0.5 mg/L中生根率最高,并且生根率隨IBA濃度升高呈先增加后減少趨勢(shì)[28]。大葉黑桫欏在IAA與NAA組合下的生根率最佳,而單一激素IAA的濃度越高,生根數(shù)越多、根長(zhǎng)越長(zhǎng)[8],這與本研究中IAA誘導(dǎo)桫欏孢子體生根的結(jié)果一致。許姍[29]在槲蕨(Drynariaroosii)組培中發(fā)現(xiàn),槲蕨在IBA激素下誘導(dǎo)的生根率、生根數(shù)、根長(zhǎng)有顯著差異,其濃度越高,效果越好與本研究桫欏孢子體在IBA誘導(dǎo)生根情況一致。本研究還表明,桫欏孢子體在IAA與IBA組合下誘導(dǎo)生根時(shí),其生根率低,莖芽不伸長(zhǎng),而莖芽下的配子體繼續(xù)增殖,不如單一的IBA或者IAA效果好,而質(zhì)量濃度為1 mg/L的IBA,生根率100%,根數(shù)、莖葉數(shù)、莖芽長(zhǎng)、寬以及株高都明顯增高,并且根毛豐富、有分支,為煉苗、移栽提供好的基礎(chǔ)。

前人研究表明,煉苗基質(zhì)對(duì)桫欏組培苗的成活率影響較大,加上桫欏喜潮濕環(huán)境,對(duì)其引種、移栽時(shí)對(duì)濕度、溫度的要求高。侯夢(mèng)丹等[9]使用泥炭土、菜園土、營(yíng)養(yǎng)土不同配比對(duì)桫欏組培苗進(jìn)行移栽煉苗,發(fā)現(xiàn)其移栽后幼苗成活率很低;朗月婷等[8]在泥炭土、菜園土中成功移栽陰生桫欏,其成活率達(dá)60%以上;而在同樣基質(zhì)上對(duì)大葉黑桫欏(A.gigantea)組培苗的移栽卻沒(méi)有成功。這可能因?yàn)椴煌蔫鴻蹇浦参锏膬?nèi)部輸水系統(tǒng)與根系對(duì)不同土壤基質(zhì)的敏感度不同,也可能與移栽時(shí)組培苗的質(zhì)量和移栽有關(guān)。然而,本試驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化移栽煉苗基質(zhì),采用赤水桫欏保護(hù)區(qū)原生境的紅壤與腐殖土和泥炭土進(jìn)行混合對(duì)桫欏再生苗進(jìn)行移栽,其成活率大大提高,這可能與紅壤作為桫欏生境土壤,其理化性質(zhì)和微生物類(lèi)型對(duì)桫欏組培苗的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用有關(guān),從而提高桫欏組培苗移栽成活率。

4 結(jié) 論

本研究中桫欏PGGB途徑不僅繁殖系數(shù)大,而且較穩(wěn)定、高效,出苗率大。(1)1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L是孢子誘導(dǎo)配子體的最適培養(yǎng)基;(2)1/2 MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.4 mg/L是誘導(dǎo)PGGB最合適的培養(yǎng)基;(3)PGGB分化最佳的培養(yǎng)基是1/2 MS+KT 0.3 mg/L+IBA 0.4 mg/L;(3)桫欏孢子體在1/2 MS+IBA 1.0 mg/L培養(yǎng)基里生根誘導(dǎo)效果最好;(4)桫欏組培苗移栽在基質(zhì)紅壤∶腐殖土∶泥炭土=2∶1∶1中成活率最高,且生長(zhǎng)良好。