施勝鈺，王旭文，趙良偉，杜燕青，江明，劉重斌

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院普外科，浙江 湖州 313000

2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院泌尿外科，浙江 湖州 313000

3. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院麻醉科，浙江 湖州 313000

4. 湖州師范學(xué)院，浙江 湖州 313000

2020 年全球肺癌新發(fā)病例超220 例，死亡病例達(dá)179 萬例，肺癌是全球癌癥致死的首位原因[1]。盡管肺癌的診斷方法、手術(shù)技術(shù)和化療方案不斷進(jìn)展，但由于腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高，其5 年生存率仍然較低[2]。微小RNA（miRNA）是在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用的小型非編碼RNA，研究報(bào)道m(xù)iRNA 異常表達(dá)與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程相關(guān)，是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[3]。胃癌中miR-4316 表達(dá)降低，上調(diào)miR-4316 通過降低血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）表達(dá)可抑制胃癌遷移和集落形成能力[4]。膀胱癌中miR-4316 具有抑癌作用，長鏈非編碼RNA（lncRNA）鈣調(diào)素類蛋白樣3 基因反義RNA1（CALML3-AS1）通過抑制miR-4316 表達(dá)促進(jìn)膀胱癌發(fā)生[5]。然而，miR-4316 在肺癌中的作用仍有待闡明。石榴皮多酚廣泛存在于石榴的皮、果肉和籽中，具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、抗炎等有益作用[6-7]。研究報(bào)道石榴皮多酚具有抵抗前列腺癌及乳腺癌的作用，可能與石榴皮多酚對細(xì)胞生長具有一定抑制作用有關(guān)，且可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8-9]。但石榴皮多酚在肺癌中的抗癌作用未見報(bào)道。本研究首先分析了miR-4316 在肺癌中的表達(dá)作用，并探索石榴皮多酚是否通過調(diào)控miR-4316 表達(dá)在肺癌中發(fā)揮抗肺癌功能。

1 材料與方法

1.1 組織來源將浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院2018 年1 月—2019 年12 月行手術(shù)切除的45 例肺癌患者及癌旁組織納入研究（男25 例，女20 例；年齡48～75 歲，中位年齡57 歲），排除術(shù)前進(jìn)行放射治療及化學(xué)治療的患者。所有組織保存在液氮中直到使用。樣本采集和使用均獲得書面知情同意。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理編號：2021-041-A）。

1.2 細(xì)胞及試劑肺癌A549 細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）、RPMI-1640 培養(yǎng)基、RIPA 緩沖液購自北京索萊寶生物公司；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA 熒光定量專用預(yù)混劑購自南京諾唯贊生物公司；miRNA 模擬物（mimics）、miRNA 抑制物（anti-miRNA）及各自陰性對照（miR-NC、anti-miR-NC）、Trizol 試劑購自上海生工生物公司；Transwell 小室購自美國BD 公司；脂質(zhì)體2000 購自美國Invitrogen 公司；一抗和酶標(biāo)二抗購自美國Abcam 公司。

1.3 方法

1.3.1 RT-qPCR 檢測miR-4316 表達(dá)用Trizol 試劑從肺癌組織中提取總RNA，以總RNA 為模板通過miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 反轉(zhuǎn)錄。采用miRNA 熒光定量專用預(yù)混劑進(jìn)行RT-qPCR。U6 作為miR-4316 的內(nèi)參，用相對定量方法（2-ΔΔCt）計(jì)算miR-4316 表達(dá)量。miR-4316 上游引物5′-AAC GAG ACG ACG ACA GAC-3′，下游引物5′-GGT GAG GCT AGC TGG TG-3′；U6 上游引物5′-AAC GAG ACG ACG ACA GAC-3′，下游引物5′-GCA AAT TCG TGA AGC GTT CCA TA-3′。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組A549 細(xì)胞在含10%胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)基置于含5%CO2、95%濕度、37 ℃溫箱孵育，細(xì)胞80%匯合時(shí)1∶3 傳代。取對數(shù)期A549 細(xì)胞按照2×104個(gè)/孔接種24 孔板，在細(xì)胞50%匯合時(shí)用脂質(zhì)體2000 將miR-NC、miR-4316 mimics 分別轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞以上調(diào)miR-4316 表達(dá)，分為miR-NC 組、miR-4316 組。同時(shí)，將antimiR-NC、anti-miR-4316 分別轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染48 h 細(xì)胞備用。參照王春梅等[9]實(shí)驗(yàn)方法制備石榴皮多酚，用含0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL 石榴皮多酚的培養(yǎng)液分別孵育A549 細(xì)胞72 h，依次記為對照組、石榴皮多酚-低組、石榴皮多酚-中組、石榴皮多酚-高組。用含2 mg/mL 石榴皮多酚的培養(yǎng)液分別孵育轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、antimiR-4316 的A549 細(xì)胞72 h，依次記為石榴皮多酚+anti-miR-NC 組、石榴皮多酚+anti-miR-4316 組。

1.3.3 CCK-8 檢測未轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-4316 mimics、anti-miR-NC 或antimiR-4316 的A549 細(xì)胞接種96 孔板，貼壁后，按照1.3.2 分組，首先進(jìn)行72 h 的石榴皮多酚的培養(yǎng)液孵育，然后進(jìn)行2 h CCK-8（濃度10%）培養(yǎng)液孵育，吸光度（A）用分光光度計(jì)在450 nm 下測定。抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)A/對照A）×100%。

1.3.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)每組取5×102個(gè)細(xì)胞接種6 孔板，37 ℃培養(yǎng)2 周后，用甲醇固定細(xì)胞集落，結(jié)晶紫染色20 min，計(jì)數(shù)大于50 個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)。

1.3.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)將各組細(xì)胞接種于6 孔板，細(xì)胞單層采用移液槍頭劃傷（10 μL），然后細(xì)胞采用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）進(jìn)行2 次清洗，清洗完畢在培養(yǎng)基（無血清）中孵育48 h。在測量開始及24 h 后以顯微鏡對劃痕寬度進(jìn)行拍照測量，劃痕愈合率（%）=（初始劃痕寬度-24 h 劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。

1.3.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)侵襲實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)備好無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞懸液（2×105個(gè)細(xì)胞）后進(jìn)行細(xì)胞接種，并將劑量為200 μL 的血清培養(yǎng)液置入其下室，共同置入培育箱，持續(xù)24 h 后完成培養(yǎng)液丟棄操作后將濃度為4%多聚甲醛置入并完成固定，染色劑采用結(jié)晶紫染色液，染色劑使用劑量為400 μL，濃度為0.5%，顯微鏡儀器對被侵襲的細(xì)胞進(jìn)行觀察并記錄數(shù)量。

1.3.7 Western Blot 檢測MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)向各組細(xì)胞中加入RIPA 緩沖液，在冰上反應(yīng)30 min，蛋白離心和定量后，將上清液按照30 μg/泳道在SDS-PAGE 凝膠上分離進(jìn)行蛋白檢測。將蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF 膜，用5%脫脂牛奶在37 ℃下阻斷1 h，并暴露于MMP-2 兔多克隆抗體（ab37150）、MMP-9兔多克隆抗體（ab73734）、GAPDH 兔多克隆抗體（ab9485）中4 ℃孵育過夜。用山羊抗兔IgG 酶標(biāo)二抗（ab205718）在37 ℃下孵育1 h。洗膜3 次后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色，相對灰度值的檢測采用Image J 軟件。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以SPSS25.0 對本研究中所有統(tǒng)計(jì)資料進(jìn)行分析，確定符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，t檢驗(yàn)2 組間數(shù)據(jù)，單因素方差檢驗(yàn)多組間數(shù)據(jù)，LSD-t檢驗(yàn)組間數(shù)據(jù)比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-4316 在肺癌組織中的表達(dá)見表1。肺癌組織中miR-4316 表達(dá)較癌旁組織低（P＜0.05）。

表1 miR-4316 在肺癌組織中的表達(dá)（）

表1 miR-4316 在肺癌組織中的表達(dá)（）

注：①與癌旁組織比較，P＜0.05

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2.2 miR-4316 過表達(dá)對肺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響見圖1～2、表2。與miR-NC 組比較，miR-4316 組A549 細(xì)胞抑制率、miR-4316 表達(dá)水平更高，克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)、MMP-2蛋白水平及MMP-9蛋白水平表達(dá)更低（P＜0.05）。

圖1 miR-4316 過表達(dá)對肺癌A549 細(xì)胞克隆形成數(shù)、劃痕愈合率及侵襲數(shù)的影響（×100）

圖2 miR-4316 過表達(dá)對肺癌A549 細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表2 miR-4316 過表達(dá)對肺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（）

表2 miR-4316 過表達(dá)對肺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（）

注：①與miR-NC 組比較，P＜0.05

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2.3 石榴皮多酚對肺癌A549 細(xì)胞增殖的影響見表3。石榴皮多酚-低、中、高組A549 細(xì)胞抑制率均較對照組高，克隆形成數(shù)較對照組低（P＜0.05），且具有劑量依賴性。

表3 石榴皮多酚對肺癌A549 細(xì)胞增殖的影響（）

表3 石榴皮多酚對肺癌A549 細(xì)胞增殖的影響（）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與石榴皮多酚-低組比較，P＜0.05；③與石榴皮多酚-中組比較，P＜0.05

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2.4 石榴皮多酚對肺癌A549 細(xì)胞遷移侵襲的影響見圖3、表4。石榴皮多酚-低、中、高組較對照組A549 細(xì)胞劃痕愈合率、侵襲數(shù)、MMP-2 蛋白水平、MMP-9 蛋白表達(dá)水平低（P＜0.05）。

圖3 石榴皮多酚對肺癌A549 細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表4 石榴皮多酚對肺癌A549 細(xì)胞遷移侵襲的影響（）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與石榴皮多酚-低組比較，P＜0.05；③與石榴皮多酚-中組比較，P＜0.05

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2.5 石榴皮多酚對肺癌A549 細(xì)胞miR-4316 表達(dá)的影響見表5。石榴皮多酚-低、中、高組A549細(xì)胞miR-4316 較對照組高（P＜0.05）。

表5 石榴皮多酚對肺癌A549細(xì)胞miR-4316表達(dá)的影響（）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與石榴皮多酚-低組比較，P＜0.05；③與石榴皮多酚-中組比較，P＜0.05

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2.6 下調(diào)miR-4316 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了石榴皮多酚（2mg/mL）對肺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用見圖4、表6。石榴皮多酚+anti-miR-4316 組A549 細(xì)胞抑制率、miR-4316 表達(dá)水平較石榴皮多酚+anti-miR-NC組低（P＜0.05），克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)、MMP-2 蛋白水平、MMP-9 蛋白表達(dá)水平較石榴皮多酚+anti-miR-NC 組高（P＜0.05）。

圖4 下調(diào)miR-4316表達(dá)逆轉(zhuǎn)了石榴皮多酚對肺癌A549細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

表6 下調(diào)miR-4316表達(dá)逆轉(zhuǎn)了石榴皮多酚對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用（）

表6 下調(diào)miR-4316表達(dá)逆轉(zhuǎn)了石榴皮多酚對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用（）

注：①與石榴皮多酚+anti-miR-NC 組比較，P＜0.05

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3 討論

研究表明miR-4316 在乳腺癌組織表達(dá)降低，沉默環(huán)狀RNA 肌凝蛋白9B（circMYO9B）通過增加miR-4316 表達(dá)能夠延緩腫瘤生長，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[10]。甲狀腺癌組織中miR-4316 水平表達(dá)低，有利于甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、周期進(jìn)展及侵襲[11]。在肝癌中miR-4316 低表達(dá)還參與細(xì)胞的增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移[12]。此外，結(jié)直腸癌患者外周血中miR-4316 表達(dá)升高可能是其早期診斷標(biāo)志物[13]。本研究檢測到肺癌組織中miR-4316 表達(dá)下調(diào)，這暗示miR-4316 低表達(dá)可能參與肺癌進(jìn)展。功能測定顯示，過表達(dá)miR-4316 可降低肺癌細(xì)胞克隆形成能力，抑制細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。MMP-2 和MMP-9 是Ⅳ型膠原降解酶，其能破壞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲，MMP-2 和MMP-9 表達(dá)上調(diào)與肺癌等多種人類癌癥的高轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)[14-15]。本研究中過表達(dá)miR-4316 顯著抑制MMP-2 和MMP-9 表達(dá)，這與其抗轉(zhuǎn)移作用吻合，表明miR-4316 在肺癌中發(fā)揮抑癌功能。

石榴皮多酚具有抗增殖、抗血管生成、抗炎、抗轉(zhuǎn)移等抑癌活性，研究報(bào)道從石榴中提取的多種多酚可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞侵襲和遷移能力[16]。石榴皮多酚通過調(diào)節(jié)雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/S6K 信號通路來抑制前列腺癌細(xì)胞遷移和集落形成[17]。石榴皮多酚還通過阻斷肝癌細(xì)胞周期進(jìn)展和誘導(dǎo)線粒體凋亡，抑制細(xì)胞生長[18]。此外，有報(bào)道稱低劑量的石榴皮多酚對卵巢癌細(xì)胞亦具有較強(qiáng)抗增殖作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)石榴皮多酚以劑量依賴方式降低肺癌細(xì)胞克隆形成能力，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時(shí)下調(diào)MMP-2 和MMP-9 表達(dá)水平，這提示石榴皮多酚具有抗肺癌功能。近年研究表明，miRNA 與中藥有效成分的抗腫瘤作用密切相關(guān)[20-21]。例如，氧化苦參通過促進(jìn)miR-367-3p 表達(dá)來抑制肺癌進(jìn)展[22]。黃芩苷通過影響miR-126 的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[23]。本研究發(fā)現(xiàn)石榴皮多酚處理后肺癌細(xì)胞miR-4316 表達(dá)顯著增加，提示miR-4316 可能是石榴皮多酚防治肺癌的新靶標(biāo)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-4316 表達(dá)顯著減弱石榴皮多酚處理對肺癌細(xì)胞克隆形成、MMP-2 及MMP-9表達(dá)，還可以抑制細(xì)胞的遷移、增殖及侵襲，說明抑制肺癌的發(fā)展可以通過石榴皮多酚上調(diào)miR-4316表達(dá)來完成。但是否有其他miRNA 介導(dǎo)石榴皮多酚的抗癌作用仍需要不斷探索。

綜上所述，石榴皮多酚通過上調(diào)miR-4316 表達(dá)來抑制肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，這些發(fā)現(xiàn)確定了石榴皮多酚和miR-4316 之間的新關(guān)系，為石榴皮多酚在肺癌治療中的應(yīng)用提供重要依據(jù)，也可能為抗肺癌藥物開發(fā)提供新思路。