徐 佳，魏婉娥，吳秋一，釋曉純，王 爍，陳 兵，3，4

（1.揚(yáng)州大學(xué) 學(xué)報(bào)編輯部，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；4.揚(yáng)州大學(xué) 教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

齒狀基因1（Jag1）編碼的細(xì)胞膜表面蛋白齒狀蛋白1（Jagged1），是缺刻蛋白（Notch）受體的主要功能性配體之一，目前已發(fā)現(xiàn)哺乳類動(dòng)物有4 種不同的Notch，均屬于單次跨膜蛋白，其結(jié)構(gòu)由胞外區(qū)（ECN）、跨膜區(qū)（TM）及胞內(nèi)區(qū)（NICD/ICN）三部分組成。相鄰細(xì)胞間Notch 受體與配體相互作用引發(fā)2次Notch 受體蛋白水解反應(yīng)，從而將Notch 細(xì)胞膜內(nèi)區(qū)域（NICD）從質(zhì)膜中釋放出來(lái)。NICD 進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，結(jié)合效應(yīng)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活蛋白，調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化與凋亡有著重要作用[1-3]。

1997 年，人類第1 次在Alagille 綜合征（ALGS）中發(fā)現(xiàn)了Jag1基因突變[4]。此后，便不斷出現(xiàn)Jag1基因突變引發(fā)相關(guān)人類疾病的報(bào)道，其中除了多系統(tǒng)發(fā)育異常的常染色體顯性遺傳病ALGS之外[5]，還有一部分法洛四聯(lián)癥（TOF）[6-7]。此外，Jag1基因變異與多種類型的惡性腫瘤相關(guān)，包括乳腺癌、腦癌、結(jié)腸直腸癌和卵巢癌等[2，8-11]。也有報(bào)道Jag1基因敲除可引起小鼠眼畸形（包括角膜?。12-14]，但未對(duì)其角膜病變特點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步分析。

乙烷基亞硝基脲（ENU）是人工合成的高效烷化劑，通過(guò)將ENU 注射小鼠及后代表型篩選可獲得多種突變表型，從而建立多種模擬人類和其他動(dòng)物疾病的小鼠模型[15-18]。角膜位于眼球壁最外層，由于其特定的生理位置，使得角膜疾病成為動(dòng)物臨床上最為常見的眼科疾病之一。宋怡文等[19]于2016年4 月至2017 年12 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院共接診223 例犬角膜病病例，說(shuō)明該病在犬中多見。廖詩(shī)英等[20]研究發(fā)現(xiàn)，壞死性角膜炎是貓較為常見的角膜疾病。在貓科動(dòng)物中也報(bào)道過(guò)有關(guān)彼得異常（Peters anomaly）的眼部疾病，患貓角膜混濁并伴有青光眼，經(jīng)證實(shí)，該眼病為遺傳性眼病，可能與晶狀體泡從表層外胚層分離不全有關(guān)[21]。馬屬動(dòng)物也易患角膜病，患馬表現(xiàn)為角膜變白且混濁、視力減弱等，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致馬匹失明[22]。除上述動(dòng)物常見角膜病外，角膜病也是人類第四大致盲眼病[23]。鑒于此，通過(guò)ENU 誘變獲得眼畸形（含角膜病變）小鼠模型，以期為人和動(dòng)物角膜病致病同源基因的鑒定及防治等奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試動(dòng)物及飼養(yǎng)條件

成年清潔級(jí)C57BL/6J（B6）小鼠由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究院提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（蘇）2022-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（蘇）2022-0044。

飼養(yǎng)條件：試驗(yàn)小鼠均在屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)，溫度為（23±2）℃，濕度為（55±5）%，晝夜12 h/12 h明暗交替。小鼠飲食和采水自由，飼料購(gòu)買于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司，經(jīng)過(guò)60Co 照射。定期更換鼠籠和墊料并且進(jìn)行環(huán)境消毒。

1.2 主要試劑及儀器

ENU（#3385-1G，美國(guó)Sigma 公司）；一抗：抗Keratin10（K10）抗體（#ab76318，英國(guó)Abcam 公司）、抗Keratin12（K12）抗體（#ab185627，英國(guó)Abcam 公司）、抗Keratin14（K14）抗 體（#ab181595，英 國(guó)Abcam 公司）；二抗：山羊抗兔IgG（#BA-1000，美國(guó)Vector labs公司）；SABC（#PK-6100，美國(guó)Vector labs公司）；DAB 顯色試劑盒（#SK-4100，美國(guó)Vector labs 公司）；Mayor’s 蘇木素（#AR0005，武漢博士德生物工程有限公司）；蛋白酶K[#9034，寶生物工程（大連）有限公司]。

石蠟切片機(jī)（RM2235，德國(guó)Leica公司）；光學(xué)顯微鏡（DM1000，德國(guó)Leica 公司）；PCR 儀（T100 Thermal Cycler，美國(guó)Bio-Rad 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDoc XRS+，美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 ENU 誘變、突變表型篩查及遺傳試驗(yàn) 用pH 值6.0 的磷酸鹽緩沖液配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的ENU。然后將ENU 以100 mg/kg 劑量腹腔注射野生型B6雄鼠（G0），每周注射1次，共注射3次。ENU誘變的雄鼠會(huì)有一段時(shí)間的不育期，因此最后1 次腹腔注射B6 雄鼠（G0）后，約2 個(gè)月之后以1∶3 的比例配種同品系野生型雌鼠，獲得子代小鼠（G1）。在G1小鼠斷奶時(shí)，主要針對(duì)其眼部等表型進(jìn)行篩查。將獲得的異常表型小鼠與野生型B6小鼠配種，觀察并記錄后代小鼠中是否出現(xiàn)相同表型以及出現(xiàn)的比例。

1.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色 舒泰麻醉后頸椎脫臼法處死小鼠，取8 周齡小鼠混濁眼球及同齡對(duì)照組眼球各3 只，置于4%多聚甲醛中于4 ℃固定24 h 以上。固定后組織按常規(guī)方法進(jìn)行石蠟切片的制作，HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色 將眼球組織切片脫蠟、脫水等處理后采用常規(guī)步驟進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

（1）內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的滅活：利用3%的過(guò)氧化氫溶液于室溫條件下處理組織切片10 min，用PBS 緩沖液（pH 值7.4）洗滌3 次；（2）抗原修復(fù)：將組織切片浸入pH 值為6.0 的檸檬酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）中，置于微波爐中加熱至沸騰后停止，間隔5 min 后進(jìn)行二次修復(fù)，冷卻至室溫，用PBS 緩沖液（pH 值7.4）洗滌3 次；（3）封閉：滴加5% BSA 封閉液，于室溫條件下封閉20 min，輕輕甩去封閉液；（4）加 一 抗：滴 加 稀 釋 的K10（1∶4 000）、K12（1∶300）、K14（1∶4 000）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，次日用PBS 緩沖液（pH 值7.4）洗滌2 次，每次4 min；（5）加二抗：滴加稀釋后的生物素化二抗（1∶400），于37 ℃條件下孵育25 min，用PBS 緩沖液（pH 值7.4）洗滌2次，每次3 min；（6）加SABC：滴加SABC（1∶100），于37 ℃條件下孵育25 min，用PBS 緩沖液（pH 值7.4）洗滌3次，每次4 min；（7）DAB 染色：使用DAB顯色試劑盒于室溫條件下顯色10 min，蒸餾水洗滌3 次，每次2 min；（8）復(fù)染細(xì)胞核：用Mayor’s 蘇木素染色液復(fù)染2 min，蒸餾水洗滌3 次，自然晾干后用中性樹膠封片并觀察。

1.3.4 微衛(wèi)星定位標(biāo)記體系的選擇 小鼠基因組有19 對(duì)常染色體，為了對(duì)小鼠進(jìn)行全基因組掃描，選擇的微衛(wèi)星要平均分布于各條染色體上，在同一染色體上的遺傳距離不超過(guò)40 cM，并且B6和C3之間的差異盡量在10 bp 以上。根據(jù)以上方式選擇定位所需微衛(wèi)星標(biāo)記，共挑選出49個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記用來(lái)定位眼畸形小鼠的突變基因，其中45個(gè)微衛(wèi)星用于初 步 定 位（D1Mit373、D1Mit415、D1Mit291、D2Mit369、 D2Mit249、 D2Mit311、 D2Mit200、D3Mit49、D3Mit127、D4Mit111、D4Mit42、D5Mit356、D5Mit168、D6Mit274、D6Mit15、D7Mit56、D7Mit145、D7Mit66、D8Mit190、D8Mit271、D9Mit191、D9Mit11、D10Mit194、 D10Mit233、 D11Mit20、 D11Mit333、D12Mit46、 D12Mit233、 D13Mit3、 D13Mit224、D13Mit76、 D14Mit259、 D14Mit165、 D15Mit63、D15Mit245、 D16Mit88、 D16Mit76、 D16Mit106、D17Mit66、D17Mit123、D18Mit149、D18Mit187、D19Mit41、D19Mit91、D19Mit33），4 個(gè)微衛(wèi)星則是用于 精 確 定 位（D2Mit336、D2Mit258、D2Mit107、D2Mit423）。

1.3.5 DNA 提取及PCR 反應(yīng) 將B6背景眼畸形小鼠與野生型C3小鼠配種得到F1，再將F1小鼠與野生型B6小鼠回交獲得N2眼畸形小鼠，采用蛋白酶K 消化和酚氯仿法[18]提取每只具有突變表型N2小鼠的鼠尾DNA，用PCR 法對(duì)提取的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。微衛(wèi)星PCR反應(yīng)體系為25 μL，利用梯度PCR反應(yīng)，摸索所選微衛(wèi)星PCR 反應(yīng)的最佳退火溫度，根據(jù)試驗(yàn)需要選擇最合適的退火溫度，其中D2Mit107、D6Mit274、D14Mit165 的 退 火 溫 度 為55 ℃，D2Mit249 的退火溫度為60 ℃，其余的微衛(wèi)星引物的退火溫度均為58 ℃。

1.3.6 連鎖分析 因?yàn)槲⑿l(wèi)星是共顯性標(biāo)記，在分析［（B6×C3）F1×B6］N2小鼠的微衛(wèi)星PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果時(shí)，把攜帶突變表型且只伴有來(lái)源于B6微衛(wèi)星標(biāo)記的樣本記為親組合，把攜帶突變表型且同時(shí)伴有B6及C3微衛(wèi)星標(biāo)記的樣本記為重組合。采用優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)計(jì)分（Log odds score，LODs）法將致病基因定位于小鼠的特定染色體上。

1.3.7 候選基因信息搜集與引物設(shè)計(jì) 根據(jù)突變基因的精確定位結(jié)果，利用Mouse Genome Informatics（MGI）數(shù)據(jù)庫(kù)的信息資源，查詢定位區(qū)域間的各基因序列相關(guān)信息，再對(duì)這些基因進(jìn)行相關(guān)功能查詢并分析，最終確定了候選基因Jag1。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中信息查詢Jag1基因的DNA 或mRNA 序列信息，設(shè)計(jì)相關(guān)引物（表1），表1 中的引物覆蓋了Jag1基因整個(gè)編碼區(qū)序列。

1.3.8 PCR、RT-PCR 產(chǎn)物測(cè)序 分別提取野生型或眼畸形小鼠鼠尾DNA 及腦總RNA，采用表1 中的引物進(jìn)行PCR 或RT-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)膠回收后直接測(cè)序，將眼畸形小鼠直接測(cè)序結(jié)果與野生型及數(shù)據(jù)庫(kù)中B6小鼠的基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，逐一篩查突變位點(diǎn)。

1.3.9 T-A 克隆測(cè)序結(jié)果分析 由于突變雜合子RT-RCR 產(chǎn)物中出現(xiàn)連續(xù)重疊信號(hào)，故將該RTPCR 產(chǎn)物進(jìn)行T-A 克隆后再次測(cè)序并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，評(píng)估該突變對(duì)Jag1基因mRNA 剪接過(guò)程的影響。T-A 克隆及序列分析由上海生工生物工程有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 ENU誘導(dǎo)眼畸形小鼠及遺傳試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)ENU誘變B6雄鼠（G0）20只，待其恢復(fù)生殖能力后分別與野生型B6雌鼠配種，生產(chǎn)了G1小鼠共305 只，經(jīng)顯性突變篩選法篩選出眼部異常、卷尾、腹部白斑等突變表型的G1小鼠共33 只，其中1例小鼠突變表型為眼畸形。

將該小鼠（G1）與野生型B6雌鼠配種，得到G2小鼠，將篩選到有突變表型的G2小鼠繼續(xù)與野生型B6小鼠配種，得到G3小鼠，以此類推，持續(xù)傳代。在記錄的120 只后代小鼠中，有56 只小鼠出現(xiàn)虹膜缺損、角膜混濁或同時(shí)可見虹膜缺損及角膜混濁的眼部異常表型（圖1），其中角膜混濁小鼠22 只、虹膜缺損小鼠20只、同時(shí)可見角膜混濁及虹膜缺損表型小鼠14 只。在56 只攜帶突變表型的后代小鼠中記錄雌性小鼠30只，雄性小鼠26只。

圖1 眼畸形小鼠表型特征Fig.1 Phenotype picture of mice eye malformation

2.2 眼畸形小鼠眼球組織學(xué)分析

選擇8 周齡出現(xiàn)角膜混濁表型的眼畸形小鼠，制作小鼠眼球組織石蠟切片。

2.2.1 HE 染色結(jié)果 HE 染色后顯微鏡下觀察，可見野生型小鼠角膜結(jié)構(gòu)層次分明，上皮細(xì)胞層呈整齊排列，且上皮基部平整，膠原纖維呈平行排列，內(nèi)皮細(xì)胞完整且明顯（圖2A）；角膜混濁表型的突變小鼠角膜整體形態(tài)發(fā)生改變，分為2種情況：僅角膜上皮細(xì)胞層出現(xiàn)大量且明顯的空泡樣病變（圖2B）；角膜晶狀體黏連導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞層斷裂脫落且角膜上皮細(xì)胞層出現(xiàn)大量明顯的空泡樣病變（圖2C）。

圖2 小鼠角膜HE染色結(jié)果Fig.2 HE staining of mouse corneas

2.2.2 免疫組織化學(xué)分析 對(duì)眼球組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示，野生型小鼠K10 表達(dá)呈陰性（圖3A）；K12 表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，分布于角膜上皮層的所有細(xì)胞（圖3B）；K14 局部表達(dá)呈陽(yáng)性，主要集中在角膜上皮基底部細(xì)胞（圖3C）。角膜混濁表型的突變小鼠，K10 表達(dá)呈陰性（圖3D）；K12表達(dá)大多呈強(qiáng)陽(yáng)性，而角膜上皮的空泡病變部位表達(dá)明顯減弱（圖3E）；K14 在整個(gè)角膜上皮均有表達(dá)，并且呈強(qiáng)陽(yáng)性（圖3F）。

圖3 角膜混濁小鼠角膜上皮抗K10、K12、K14抗體免疫組化分析結(jié)果Fig.3 Immunohistochemistry staining using anti-keratin 10/12/14 antibodies of corneal epithelium in mice with corneal opacity phenotype

2.3 眼畸形小鼠突變基因的定位結(jié)果

采用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)常染色體進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，微衛(wèi)星D2Mit249（距著絲粒54.07 cM）在16個(gè)N2小鼠的DNA 樣品中只發(fā)生了1例交換（圖4），LODs為3.19，可以判定該突變基因與微衛(wèi)星D2Mit249 連鎖（表2）。

圖4 D2Mit249對(duì)部分［（B6×C3）F1×B6］N2小鼠檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection of some N2 mice with eye malformation［（B6×C3）F1×B6］by D2Mit249

表2 眼畸形突變基因與D2Mit249的連鎖分析過(guò)程Tab.2 Linkage analysis between eye malformation mutant gene and D2Mit249

為了進(jìn)一步縮小突變基因的位置范圍，在初步定位結(jié)果的基礎(chǔ)上增加N2小鼠的DNA樣品數(shù)至122例并且選擇較高密度的微衛(wèi)星標(biāo)記。定位結(jié)果顯示，122個(gè)N2樣品中突變基因與微衛(wèi)星D2Mit107（距著絲粒65.13 cM）處發(fā)生2例交換，LODs為32.27，與微衛(wèi)星D2Mit423（距著絲粒73.57 cM）處發(fā)生5例交換（圖5），LODs 為27.66，可以確定該突變基因位于小鼠第2號(hào)染色體D2Mit107與D2Mit423之間。

2.4 眼畸形小鼠候選基因的鑒定

利用MGI 數(shù)據(jù)庫(kù)的信息資源，對(duì)精確定位區(qū)域內(nèi)的基因逐一進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)定位區(qū)域內(nèi)的Jag1基因突變會(huì)出現(xiàn)眼部畸形表型，故確定了Jag1基因?yàn)檠刍涡∈蟮暮蜻x基因。采用所設(shè)計(jì)引物對(duì)Jag1基因PCR或RT-PCR，產(chǎn)物經(jīng)膠回收后直接測(cè)序，結(jié)果顯示，從外顯子25 開始，突變雜合小鼠測(cè)序信號(hào)圖出現(xiàn)連續(xù)的重疊信號(hào)，結(jié)果重復(fù)3 次（圖6A），初步推測(cè)存在mRNA剪接異常。

將RT-PCR回收產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)重疊信號(hào)的序列條帶進(jìn)行T-A 克隆，然后隨機(jī)挑選8 個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果顯示，其中3 個(gè)克隆為野生型序列，5 個(gè)克隆從外顯子25 起出現(xiàn)7 個(gè)堿基的缺失（圖6B）。正常的Jagged1蛋白由1 218 aa構(gòu)成，蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該基因突變導(dǎo)致Jagged1 蛋白從1 016 aa 后開始發(fā)生移碼（圖6C），最終引起該突變蛋白質(zhì)翻譯提前終止（1 032 aa）。

繼續(xù)對(duì)外顯子25側(cè)翼序列測(cè)序發(fā)現(xiàn)，Jag1基因第24 號(hào)內(nèi)含子3′端堿基AG 被堿基GG 所替代，最終導(dǎo)致在mRNA剪接過(guò)程識(shí)別外顯子25中第6位及第7 位AG 堿基（圖6D），從而引起突變序列7 個(gè)堿基的缺失。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)比較大量的真核生物的內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)，它們的兩側(cè)邊界絕大部分有1 對(duì)保守GT-AG 內(nèi)含子序列，即5′端為GT，3′端為AG，這類稱為GT-AG 的內(nèi)含子均以相同的方式剪接。一般按照內(nèi)含子的方向從左到右依次稱為5′剪接點(diǎn)和3′剪接點(diǎn)，也叫作供體位點(diǎn)（Donor）和受體位點(diǎn)（Acceptor）[24]。ENU誘導(dǎo)小鼠引起的主要突變類型包括A/T顛換成T/A、A/T轉(zhuǎn)換成G/C、G/C顛換成C/G、A/T轉(zhuǎn)換成C/G及G/C轉(zhuǎn)換成T/A。這些類型的突變?cè)诘鞍踪|(zhì)水平上會(huì)導(dǎo)致10%的無(wú)義突變、26%的拼接錯(cuò)誤和64%的錯(cuò)義突變[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在DNA 水平上，由于Jag1基因第24 號(hào)內(nèi)含子的3′端AG 堿基被GG 堿基所替代（屬于A/T 轉(zhuǎn)換成G/C 型），導(dǎo)致在mRNA 剪接過(guò)程識(shí)別外顯子25中第6位及第7位AG堿基，從而引起mRNA 剪接異常，是導(dǎo)致眼畸形小鼠突變表型形成的分子基礎(chǔ)。該突變導(dǎo)致Jagged1 蛋白跨膜區(qū)與胞內(nèi)區(qū)完全缺失，屬于功能缺失型突變。

Jagged1 蛋白屬于Notch 受體的主要功能性配體之一，目前關(guān)于Jagged1 的研究主要在其與ALGS關(guān)系[5]。Jag1基因敲除可出現(xiàn)小鼠眼畸形表型，其中包括角膜病[14]，但未對(duì)角膜組織進(jìn)行進(jìn)一步組織學(xué)分析。角蛋白（Keratins）參與構(gòu)成細(xì)胞的骨架系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起著重要作用。角蛋白成對(duì)表達(dá)，其表達(dá)具有分化類型依賴性、組織特異性，故角蛋白可作為上皮細(xì)胞分化狀態(tài)或分化階段的重要生化標(biāo)記。K5/K14 在有絲分裂活躍的上皮細(xì)胞表達(dá)，即復(fù)層鱗狀上皮的基底層細(xì)胞；K3/K12 是成熟角膜上皮細(xì)胞分化的特征；K1/K10主要表達(dá)于皮膚上皮，被視為皮膚型分化晚期階段的特征[25]。本研究對(duì)Jag1基因突變小鼠角膜病變特點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)突變小鼠角膜上皮局部K12 免疫組化分析結(jié)果為陰性并且K14 表達(dá)增強(qiáng)，而K10 不表達(dá)。結(jié)果提示，該突變小鼠角膜上皮細(xì)胞分化發(fā)生異常，但未發(fā)生角質(zhì)化。

綜上，本研究通過(guò)ENU 誘變獲得1 例Jag1基因等位突變小鼠，該小鼠眼部表現(xiàn)出角膜混濁和虹膜缺損等眼部畸形，并對(duì)其病變特點(diǎn)進(jìn)行分析，為人和動(dòng)物相關(guān)眼病的研究奠定了基礎(chǔ)。