楊芳,袁海彬,賈洪鋒,鄧?guó)P琳,王珍妮

(四川旅游學(xué)院 食品學(xué)院,四川 成都,610100)

氣相色譜-離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)是一種近年來出現(xiàn)的新型氣相分離和檢測(cè)技術(shù),具有分辨率高、靈敏度高等特點(diǎn),特別適合于揮發(fā)性有機(jī)化合物(volatile organic compounds, VOCs)的痕量檢測(cè),在果蔬[1]、香辛料[2-3]、調(diào)味油[4]和菌類[5]等VOCs的檢測(cè)分析方面得到了廣泛的應(yīng)用[6]。

辣椒(CapsicumannuumL.)屬茄科一年或多年生植物。辣椒中含有豐富的辣椒素、辣椒紅素、維生素C、多酚、類黃酮等物質(zhì)[7-9],因而具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤等生物活性[8-12]。不同品種的辣椒在辣椒素含量、VOCs的種類及含量上有明顯差異[13-14]。辣椒油是用干辣椒和植物油制成的有獨(dú)特風(fēng)味的調(diào)味油,具有香味濃郁、辣度適口的特點(diǎn),在川菜的加工中具有舉足輕重的地位,深受人們的喜愛[15]。張洪新等[16]采用GC-MS對(duì)14種不同品種辣椒制成的辣椒油制品的揮發(fā)性香氣成分、辣椒素含量等進(jìn)行了對(duì)比,結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品的香氣成分和辣椒素含量均存在差異。何小龍等[17]對(duì)4種辣椒和大豆油制備的辣椒油進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),辣椒品種對(duì)辣椒油中辣椒素和二氫辣椒素的含量影響顯著。石自彬等[18]對(duì)10種辣椒和花生油制備的辣椒油進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),辣椒油的揮發(fā)性風(fēng)味成分中,酯類化合物含量最高;辣椒油的抗氧化效果隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而減弱,反復(fù)熬煮會(huì)使辣椒油的抗氧化效果減弱。然而,上述研究主要采用常規(guī)的GC-MS技術(shù),對(duì)一些含量少但對(duì)風(fēng)味至關(guān)重要的物質(zhì)卻無法分析鑒定[4,19]。目前,采用GC-IMS分析辣椒品種對(duì)辣椒油中VOCs的影響的研究較少。

本研究通過HPLC和GC-IMS等檢測(cè)技術(shù)和方法,對(duì)5種辣椒(子彈頭、龍脊椒、涮涮辣、七星椒、干線椒)制備的辣椒油中辣椒素類物質(zhì)含量、色差、過氧化值、VOCs進(jìn)行檢測(cè)和分析,結(jié)合主成分分析(principal component analysis, PCA)、偏最小二乘-判別分析(partial least squares-discrimination analysis, PLS-DA)及熱圖聚類分析等多元統(tǒng)計(jì)方法,分析辣椒品種對(duì)辣椒油的理化性質(zhì)和VOCs的影響,以對(duì)辣椒油的理化性質(zhì)和風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行更為科學(xué)、系統(tǒng)的評(píng)價(jià),這將為不同品種辣椒制備辣椒油的品質(zhì)評(píng)定和合理加工提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒品種:子彈頭、龍脊椒、涮涮辣、七星椒、干線椒;金龍魚玉米油,益海嘉里(重慶)糧油有限公司;精制食用鹽,四川省鹽業(yè)總公司。

冰乙酸、二氯甲烷、KI、Na2S2O3、可溶性淀粉、KIO3,均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Flavor Spec?型GC-IMS儀:含CTC自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、Laboratory Analytical Viewer(LAV)分析軟件、GC×IMS Library Search軟件及軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析,德國(guó)G.A.S公司;戴安Ultimate 3000型HPLC儀,賽默飛世爾科技有限公司;IS128型萬分之一分析天平,上海西塘生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 辣椒油制備

參考文獻(xiàn)[17]的方法并稍作修改。

不同品種干紅辣椒→微波(功率1 000 W)加熱1 min→涼至室溫→粉碎→過篩(18目)→稱重(24 g)→加入食鹽(1 g)→混勻辣椒面,備用。玉米油(100 g)→熬制(180 ℃)→加入至辣椒面中→攪拌(約35 s)→自然降溫浸提(24 h)→編號(hào)(樣品編號(hào)PZ1、PZ2、PZ3、PZ4、PZ5,分別對(duì)應(yīng)子彈頭、龍脊椒、涮涮辣、七星椒、干線椒5種辣椒制備的辣椒油樣品)→待測(cè)

自然浸提完成后,每個(gè)樣品取上層清油液,分別用于辣椒素類物質(zhì)含量、色差值、過氧化值、VOCs的檢測(cè),各平行測(cè)定3次。

1.3.2 辣椒素類物質(zhì)含量的測(cè)定

參照GB/T 21266—2007《辣椒及辣椒制品中辣椒素類物質(zhì)測(cè)定及辣度表示方法》[20],采用高效液相色譜法對(duì)辣椒油中辣椒素含量、二氫辣椒素含量、辣椒素類物質(zhì)總量、斯科維爾指數(shù)和辣度進(jìn)行測(cè)定,平行測(cè)定3次。

色譜柱Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)石英毛細(xì)管柱;流動(dòng)相65%的甲醇水溶液;紫外光波長(zhǎng)280 nm;流速1 mL/min;柱溫30 ℃。

1.3.3 色差的測(cè)定

利用色差儀測(cè)定不同樣品的亮度(L*)、紅度(a*)、黃度(b*)值,平行測(cè)定3次。

1.3.4 過氧化值的測(cè)定

參照GB 5009.227—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》中的滴定法[21],對(duì)辣椒油的過氧化值進(jìn)行測(cè)定,平行測(cè)定3次。

1.3.5 VOCs的檢測(cè)

取1.5 g辣椒油樣品于20 mL頂空瓶中,80 ℃下孵化20 min后,頂空進(jìn)樣,用GC-IMS儀進(jìn)行測(cè)定;分析時(shí)間40 min;平行測(cè)定3 次,盲測(cè)1次。

自動(dòng)進(jìn)樣條件:孵化溫度80 ℃;孵化時(shí)間20 min;進(jìn)樣方式頂空進(jìn)樣;進(jìn)樣體積500 μL;進(jìn)樣針溫度85 ℃;振蕩方式加熱;孵化轉(zhuǎn)速500 r/min;不分流;清洗時(shí)間5 min。

GC條件:色譜柱WAX(30 m×0.53 mm×1 μm)石英毛細(xì)管柱;色譜柱溫度60 ℃;載氣N2(純度≥99.999%);IMS溫度45 ℃;載氣流速0～10 min,2 mL/min;10～20 min,10 mL/min;20～40 min,100 mL/min。

IMS條件:漂移管長(zhǎng)度9.8 cm,漂移管溫度45 ℃,漂移氣為N2(純度≥99.999%),漂移氣流速150 mL/min。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

利用Flavor Spec?配備的 Laboratory Analytical Viewer(LAV)分析軟件及GC×IMS Library Search定性軟件對(duì)辣椒油樣品的VOCs進(jìn)行采集和分析;利用軟件內(nèi)置的 NIST數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

采用Excel和Origin進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和繪圖;采用SPSS 26.0對(duì)樣品間差異采用ANOVA檢驗(yàn)分析,利用Duncan方法進(jìn)行顯著性差異分析,P<0.05,差異顯著;采用SIMCA 14.1進(jìn)行PLS-DA;用R語(yǔ)言進(jìn)行熱圖聚類分析;結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒品種對(duì)辣椒油中辣椒素類物質(zhì)含量的影響

辣椒素類物質(zhì)是辣椒堿類化合物的總稱,是辣椒油中的辛辣成分,屬于酰胺類化合物[22]。辣椒素具有調(diào)味、清除自由基、抗氧化、抗癌等活性[8-12],但大量攝入辣椒素會(huì)產(chǎn)生毒性,局部刺激導(dǎo)致呼吸道感染,并可能會(huì)增加某些癌癥的發(fā)生[12]。5種辣椒油的辣椒素類化合物含量如表1所示。

表1 辣椒油樣品的辣椒素類物質(zhì)含量Table 1 Content of capsaicinoids in chili oil samples

由表1可知,5種辣椒油的辣椒素含量、二氫辣椒素含量、辣椒素類物質(zhì)總量、斯科維爾指數(shù)、辣度順序均為PZ3>PZ4>PZ2>PZ5>PZ1;均為涮涮辣制備的辣椒油樣品(PZ3)顯著高于其余4種樣品(P<0.05)。PZ3辣椒素類物質(zhì)總量高達(dá)(10.41±0.02) g/kg、辣度高達(dá)1 069.81±1.91,這與辣椒素等辣味物質(zhì)的含量多少直接影響辣度[23]的結(jié)論一致。產(chǎn)生這些差異的原因,可能主要是辣椒品種的不同。因此,在選擇制作辣椒油的辣椒品種時(shí),應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品對(duì)辣椒素類物質(zhì)總量和辣度的不同需求來選擇。

2.2 辣椒品種對(duì)辣椒油色差的影響

由圖1可知,5種辣椒油的亮度(L*)依次為PZ3>PZ2>PZ5>PZ4>PZ1,PZ3最大,為45.57±1.49;PZ2次之,為45.11±0.01。PZ5紅度(a*)最高,PZ3黃度(b*)最高且與其余樣品間存在顯著性差異(P<0.05)。產(chǎn)生這些差異的原因,可能與不同品種辣椒自身所富集的辣椒紅素、β-胡蘿卜素等含量不同有關(guān)[7]。

圖1 辣椒油樣品的色差值Fig.1 Chromatic aberration value of chili oil samples 注:小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.3 辣椒品種對(duì)辣椒油過氧化值的影響

油脂的過氧化值是評(píng)價(jià)油脂氧化程度的關(guān)鍵指標(biāo)[24]。由圖2可知,5種辣椒油的過氧化值依次為:PZ3

圖2 辣椒油樣品的過氧化值Fig.2 Peroxide value of chili oil samples

2.4 辣椒品種對(duì)辣椒油VOCs的影響

2.4.1 辣椒油VOCs的定性分析

對(duì)照GC×IMS Library Search內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS數(shù)據(jù)庫(kù),根據(jù)辣椒油VOCs的保留指數(shù)、保留時(shí)間和遷移時(shí)間進(jìn)行定性分析,結(jié)果如表2所示。部分VOCs出現(xiàn)了二聚體,它們具有相近的保留時(shí)間和不同的遷移時(shí)間,這是GC-MS所檢測(cè)不出的[26]。5種樣品中共檢測(cè)出73種VOCs,94個(gè)信號(hào)峰,分別為醇類12種(二聚體3種)、醛類19種(二聚體5種)、酮類12種(二聚體3種)、羧酸類4種(二聚體3種)、酯類18種(二聚體5種)、雜環(huán)類6種(二聚體2種)、硫醚類2種。其中醛類(二乙醇縮乙醛、己醛、3-甲基丁醛、丙烯醛等)種類最多且含量高,閾值低[27],對(duì)辣椒油風(fēng)味貢獻(xiàn)大;其中,己醛主要來源于植物油的氧化[28],可為辣椒油提供青香和脂肪香;來源于異亮氨酸的Strecker降解[29]的3-甲基丁醛可為辣椒油提供果香。酯類物質(zhì)主要來源于醇類和酸類化合物所發(fā)生的酯化反應(yīng)[30],如乙酸乙酯、異戊酸己酯等酯類物質(zhì),可為辣椒油提供果香、青香。脂肪氧化的另一產(chǎn)物酮類[31]在辣椒油中含量也較高。此外,乙酸、丙酸等具有酸味的物質(zhì)是辣椒油中的“異味”物質(zhì),降低“異味”物質(zhì)的含量可使辣椒油風(fēng)味得到提升[15]。

表2 辣椒油樣品已定性揮發(fā)性有機(jī)化合物Table 2 Identified VOCs in chili oil samples

2.4.2 辣椒油VOCs的GC-IMS二維差異圖

圖3是以PZ1為參照,其余譜圖扣除PZ1中的信號(hào)峰,得到的GC-IMS二維平面差異譜圖。

圖3 辣椒油樣品的GC-IMS二維差異圖Fig.3 GC-IMS two-dimensional qualitative topographic diffence plots

整個(gè)二維譜圖背景為藍(lán)色,橫坐標(biāo)1.0處為反應(yīng)離子(reactive ion peak,RIP)峰,RIP峰兩側(cè)的每一個(gè)點(diǎn)均代表一種VOC,白色表示VOC濃度較低,紅色表示濃度較高,顏色越深表示濃度越大。由圖3可知,矩形區(qū)域紅色VOCs的含量相對(duì)于PZ1高,橢圓形區(qū)域藍(lán)色VOCs的含量相對(duì)于PZ1低;PZ3、PZ4和PZ5的VOCs種類及含量與PZ1差異較大,PZ1和PZ2的VOCs種類和含量相近。

2.4.3 辣椒油VOCs的GC-IMS指紋圖譜

指紋圖譜(圖4)可以直觀地呈現(xiàn)5種辣椒油VOCs之間的差異,整個(gè)圖背景為藍(lán)色,Y軸為樣品編號(hào)(每1行為1個(gè)樣品的指紋圖譜),X軸為VOCs的名稱或編號(hào),圖中點(diǎn)的顏色深淺和點(diǎn)的面積表示VOCs含量的高低,顏色越深面積越大則含量越高,即白色點(diǎn)表示VOCs含量低,紅色點(diǎn)表示含量高[1]。

圖4 辣椒油樣品的指紋譜圖Fig.4 Fingerprint spectra of chili oil samples注:21種未定性的VOCs以阿拉伯?dāng)?shù)字進(jìn)行編號(hào)(下同)。

結(jié)合表2和圖4可知,5種樣品共有且含量較高的VOCs集中在A(A1～A4)區(qū)域,包括3-甲基丁醛、2-甲基丙醛、庚醛、2,3-戊二酮、環(huán)己酮、1-辛烯-3-酮、2,5-二甲基吡嗪、甲基吡嗪、(Z)-3-己烯醇、二氫-2(3H)-呋喃酮等,為辣椒油貢獻(xiàn)辛辣味、脂肪香、青香、果香、花香等總體風(fēng)味特征。B(B1～B2)區(qū)域,包括異戊酸己酯、異丁酸己酯、己酸異戊酯、丁酸己酯、異戊酸異戊酯、2-甲基丁酸丁酯、異戊酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸葉醇酯、丙酸異戊酯、苯甲醛、丙烯醛、糠醛、壬醛、糠醇、1-己醇等,多數(shù)為酯類,在PZ3中含量高且與其余4種樣品間存在顯著性差異(P<0.05),所以PZ3果香味濃,風(fēng)味最為特別。C區(qū)域的乙酸丁酯、丙酸乙酯、乙酸乙酯在PZ4中含量高且與其余樣品間存在顯著性差異(P<0.05),可能為PZ4與其余樣品香氣的差異所在。D區(qū)域的(E)-2-戊烯醛、乙酸甲酯、丁酸乙酯、辛醛在PZ5中含量高,可能為PZ5的主要差異VOCs。PZ1和PZ2的VOCs接近。

2.4.4 辣椒油樣品VOCs的PCA

利用Flavor Spec?配備的LAV軟件對(duì)5種辣椒油樣品所有的VOCs進(jìn)行PCA,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,第1主成分(58%)和第2主成分(19%)占方差的77%,能反映樣品的總體特征[32]。PZ3與其余樣品的距離非常遠(yuǎn),可以根據(jù)第1主成分進(jìn)行區(qū)分;其次,PZ5、PZ4分別與PZ1和PZ2的距離較遠(yuǎn),可以根據(jù)第2主成分將PZ5、PZ4與PZ1和PZ2進(jìn)行區(qū)分;PZ1和PZ2在第1與第2主成分上均接近,但各自成組;盲樣(圖中5個(gè)黑點(diǎn))均準(zhǔn)確地落在相應(yīng)的組別中。因此,使用GC-IMS結(jié)合PCA,可將5種辣椒油樣品的VOCs進(jìn)行較好地判別和區(qū)分。

圖5 辣椒油樣品的PCA結(jié)果Fig.5 PCA results of chili oil samples

2.4.5 辣椒油樣品VOCs的PLS-DA結(jié)果

PLS-DA是一種基于偏最小二乘回歸算法的有監(jiān)督的分析方法,可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜數(shù)據(jù)的可視化、判別分析和預(yù)測(cè)[33]。在PLS-DA中使用7倍交叉驗(yàn)證和200次隨機(jī)重分類對(duì)辣椒油VOCs進(jìn)行建模、因子載荷分析和變量重要性投影(variable importance in projection,VIP)計(jì)算。利用SIMCA 14.1軟件對(duì)5種辣椒油所有VOCs進(jìn)行PLS-DA,結(jié)果如圖6所示。

a-PLS-DA置換圖;b-因子載荷圖

由圖6-a可知,RX2=0.977,RY2=0.992,Q2=0.972,說明該模型較可靠,能對(duì)5種辣椒油樣品的風(fēng)味進(jìn)行較好的預(yù)測(cè)。根據(jù)PLS-DA因子載荷圖對(duì)5種辣椒油重要的香氣成分進(jìn)行分析,如圖6-b所示,PZ3的香氣物質(zhì)主要為酯類,包括E10(異戊酸己酯-D)、E13(異丁酸己酯)、E7(己酸異戊酯)、E12(丁酸己酯-D)等,因此PZ3果香味濃郁。PZ4的主要香氣成分有E1(乙酸丁酯)、A4(3-甲基-1-丁醇)、E21(丙酸乙酯)等;PZ5的主要香氣成分有B11[(E)-2-戊烯醛-M]、F6(2,5-二甲基吡嗪)、E5(乙酸甲酯)等;C11(1-戊烯-3-酮-D)、C7(2-庚酮)等是PZ1的主要香氣成分,PZ1和PZ2風(fēng)味相似。

VIP可用于篩選對(duì)香氣輪廓有重要影響的關(guān)鍵差異標(biāo)志物[33]。如圖7-a所示,26種VOCs的VIP>1.0(共32個(gè)峰),分別為E4(乙酸乙酯)、E10(異戊酸己酯)、B18(二乙醇縮乙醛)、D7(乙酸-D)、B14(己醛-D)、G2(二甲基硫醚)、B17(3-甲基丁醛)、E23(二氫-2(3H)-呋喃酮)、C2(1-羥基-2-丙酮)、C14(丙酮)、1、D2(丁酸-M)、B20(丙烯醛)、A4(3-甲基-1-丁醇)、D4(異丁酸-M)、E21(丙酸乙酯)、F1(糠醇-M)、B21(丙醛)、C11(1-戊烯-3-酮)、B19(丁醛)、A11(乙醇)、E7(己酸異戊酯-M)、C15(丁二酮)、E11(丁酸己酯-M)、B16(戊醛-D)、F4(糠醛-M),VIP值越大,則差異越顯著。由圖7-b可知,E9(異戊酸己酯-M)、E10(異戊酸己酯-D)、E11(丁酸己酯-M)、F1(糠醇-M)、E7(己酸異戊酯-M)、D7(乙酸-D)、B17(3-甲基丁醛)、B16(戊醛-D)等物質(zhì)對(duì)第1主成分貢獻(xiàn)較大;E21(丙酸乙酯)、A4(3-甲基-1-丁醇)、E4(乙酸乙酯)、B19(丁醛)、B18(二乙醇縮乙醛)對(duì)第2主成分貢獻(xiàn)較大。

a-VIP值圖;b-載荷圖;c-聚類熱圖

為了直觀區(qū)分特征差異標(biāo)志物(VIP>1.0)在5種辣椒油中的變化,根據(jù)篩選出的26種特征差異標(biāo)志物的峰強(qiáng)度繪制聚類熱圖(圖7-c)。由圖7-c可知,PZ3最先分組,風(fēng)味最為特別,E10(異戊酸己酯)、E11(丁酸己酯-M)、E7(己酸異戊酯-M)、B20(丙烯醛)、B16(戊醛-D)等物質(zhì)在PZ3中含量高;PZ5中 C11(1-戊烯-3-酮)、B21(丙醛)、C15(丁二酮)含量高而再分組;PZ4中E4(乙酸乙酯)、A4(3-甲基-1-丁醇)、E21(丙酸乙酯)含量高;PZ1和PZ2聚類而風(fēng)味相似。該結(jié)果與GC-IMS二維差異圖、指紋圖譜和PCA結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究采用HPLC和GC-IMS等檢測(cè)技術(shù),對(duì)5種辣椒(子彈頭、龍脊椒、涮涮辣、七星椒、干線椒)制備的辣椒油進(jìn)行了辣椒素類物質(zhì)含量、色差、過氧化值、VOCs的檢測(cè)和分析,辣椒的品種對(duì)制成的辣椒油中辣椒素類物質(zhì)含量、色差、過氧化值、VOCs均有影響。結(jié)果表明,5種辣椒油辣度有顯著性差異(P<0.05),其中PZ3的辣椒素類物質(zhì)總量、辣度顯著高于其他樣品,PZ4其次,PZ1最低;PZ3亮度L*和黃度b*最高;5種辣椒油的過氧化值呈現(xiàn)出隨著辣椒油中辣椒素類物質(zhì)總量的增加而降低的趨勢(shì),PZ3過氧化值最低,辣椒素類物質(zhì)總量最高;經(jīng)GC-IMS共分離鑒定出73種VOCs,包括醛類19種、酯類18種、酮類12種、醇類12種、雜環(huán)類6種、羧酸類4種和硫醚類2種;其中,GC-IMS二維差異圖和指紋圖譜顯示,PZ3樣品VOCs種類多含量高,風(fēng)味最為獨(dú)特,PZ1和PZ2風(fēng)味接近;通過PLS-DA進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),PZ3與其余樣品的特征差異香氣物質(zhì)主要為酯類,包括異戊酸己酯-D、異丁酸己酯、己酸異戊酯、丁酸己酯-D等;經(jīng)變量重要性投影分析篩選出5種辣椒油的26種關(guān)鍵差異標(biāo)志物(VIP>1.0),包括E4(乙酸乙酯)、E10(異戊酸己酯)、B18(二乙醇縮乙醛)、D7(乙酸-D)、B14(己醛-D)、G2(二甲基硫醚)、B17(3-甲基丁醛)等,其中E9(異戊酸己酯-M)、E10(異戊酸己酯-D)、E11(丁酸己酯-M)、F1(糠醇-M)、E7(己酸異戊酯-M)、D7(乙酸-D)、B17(3-甲基丁醛)、B16(戊醛-D)等物質(zhì),對(duì)第1主成分貢獻(xiàn)較大;E21(丙酸乙酯)、A4(3-甲基-1-丁醇)、E4(乙酸乙酯)、B19(丁醛)、B18(二乙醇縮乙醛)對(duì)第2主成分貢獻(xiàn)較大。PCA結(jié)果、聚類熱圖分析結(jié)果與GC-IMS二維差異圖和指紋圖譜結(jié)果一致。研究結(jié)果將為合理選用辣椒品種,工業(yè)化制備辣椒油提供一定的理論支撐。