何旭峰,易良鍵,鄭容,王圣開(kāi),周祥德,熊雙,黃小蘭*,冉光榮

1(重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所,重慶,404100)2(重慶市萬(wàn)州區(qū)伴神釀造有限公司,重慶,404130)

辣椒(CapsicumannuumL.)為一年生茄科草本植物,在我國(guó)四川、貴州、重慶、河南、湖南、寧夏、新疆等地均有大量種植,總面積超2 000萬(wàn)畝,占全球的1/3,總產(chǎn)量4 000萬(wàn)t,占世界辣椒總產(chǎn)量的一半以上[1]。辣椒含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),是維生素的主要來(lái)源,尤其是維生素C含量特別突出,具有開(kāi)胃消食、驅(qū)寒除濕、抗氧化、降血壓等作用[2-3],辣椒加工品主要有干辣椒、辣椒粉、泡椒、剁椒、辣椒醬等[4]。其中剁椒是辣椒的加工制品之一,在嗜辣群體集中、調(diào)味品市場(chǎng)豐富的川渝地區(qū),剁椒憑借其獨(dú)特的口感與風(fēng)味及其潛在的消費(fèi)市場(chǎng),成為調(diào)味品市場(chǎng)中的后起之秀。傳統(tǒng)剁椒以辣椒為原料,經(jīng)清洗、剁碎、腌制等前處理,再按比例加入蒜末、姜末、食鹽、白酒及白砂糖等輔料,攪拌混勻,入壇密封,由天然附著菌種自然發(fā)酵而成?？捎糜谥貞c小面、羊肉米粉、剁椒魚(yú)頭、萬(wàn)州烤魚(yú)、涼粉等餐飲食品,也可直接拌飯食用,亦是萬(wàn)州烤魚(yú)調(diào)料的重要原料,香氣突出,風(fēng)味獨(dú)特,深受人們喜愛(ài)[5]。

剁椒風(fēng)味是評(píng)價(jià)其質(zhì)量?jī)?yōu)劣、影響消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)的重要指標(biāo)[6],其形成過(guò)程受眾多因素的影響,如辣椒品種[7-9]、腌制鹽度[10-12]、發(fā)酵方式及菌種[4,13]等,是復(fù)雜而微妙的。同時(shí)剁椒作為微生物發(fā)酵產(chǎn)品,發(fā)酵環(huán)境、發(fā)酵時(shí)間也是影響風(fēng)味的關(guān)鍵因素,羅鳳蓮[14]發(fā)現(xiàn)湖南剁椒自然發(fā)酵1～4周,其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)和含量差異顯著;崔桂娟[15]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵第18天時(shí),剁椒揮發(fā)性組分多達(dá)148種,酯類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)最多,烯烴類(lèi)含量最高;肖何等[6]揭示了湖南不同產(chǎn)地農(nóng)家剁辣椒的品質(zhì)和風(fēng)味存在明顯差異性;這說(shuō)明發(fā)酵環(huán)境和時(shí)間對(duì)自然發(fā)酵剁椒的風(fēng)味影響較大。而川渝地區(qū)近年來(lái)受三峽庫(kù)區(qū)的影響,形成了高溫高濕的自然環(huán)境,自然發(fā)酵過(guò)程中傳統(tǒng)剁椒的風(fēng)味變化未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

因此,本研究選取具有代表性的萬(wàn)州傳統(tǒng)剁椒為研究對(duì)象,采用頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)[16-17],對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間自然發(fā)酵剁椒的揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定分析,篩選出關(guān)鍵性香氣物質(zhì),并進(jìn)行相關(guān)性分析,旨在為萬(wàn)州傳統(tǒng)剁椒的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供依據(jù),同時(shí)為川渝地區(qū)剁椒質(zhì)量分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萬(wàn)州傳統(tǒng)剁椒,重慶市萬(wàn)州區(qū)伴神釀造有限公司;色譜純仲辛醇,上海麥克林生化科技有限公司;其余試劑為分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;水為實(shí)驗(yàn)室自制純水。

1.2 儀器與設(shè)備

7000C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國(guó)安捷倫公司;PAL3自動(dòng)進(jìn)樣平臺(tái),CTC分析儀器股份公司;50 μm膜厚的Divinylbenzenne/Carboxen/PDMS頂空固相微萃取頭,美國(guó)Supelco公司;Milli-Q Advantage A10型超純水機(jī),密理博中國(guó)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 傳統(tǒng)剁椒工藝流程

將辣椒洗凈、晾干,剁成2 mm×2 mm的顆粒,將二青條和小米辣以7∶3的質(zhì)量比混合,再加入輔料(食鹽10%,大蒜10%,姜10%,白糖2.5%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))攪拌均勻,裝壇密封,發(fā)酵。

分別于密封發(fā)酵0、10、20、30、40、50和60 d后采集樣品,依次編號(hào)為F0、F10、F20、F30、F40、F50、F60,樣品經(jīng)均質(zhì)后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 感官評(píng)價(jià)

選擇8位經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的人員組成感官評(píng)價(jià)小組,分別對(duì)剁椒的色澤、脆度、香氣、滋味4個(gè)方面按照表1的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分,結(jié)果取平均值。

1.3.3 揮發(fā)性成分的測(cè)定

固相萃取條件:精密稱(chēng)取剁椒樣品2 g(精確至0.000 1 g)置于20 mL頂空瓶中,加入3 mL飽和NaCl溶液,加入200 μg/mL仲辛醇內(nèi)標(biāo)溶液40 μL后密封,于保溫套中以50 ℃加熱平衡15 min。將已老化好的萃取頭插入頂空瓶中,頂空吸附20 min,保溫和吸附期間時(shí)時(shí)振搖,振搖速度為700 r/min。吸附完成后將萃取頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口,250 ℃解吸5 min。

氣相條件:色譜柱為安捷倫石英毛細(xì)管柱DB-heavyWAX(30 m×250 μm×0.32 μm);升溫程序:初始溫度40 ℃,保持2 min,以2 ℃/min升溫至120 ℃,120 ℃保持10 min,以2 ℃/min升溫至200 ℃,后以5 ℃/min升溫至240 ℃,保持10 min。載氣:高純氦氣(純度≥99.999%);流速2.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度250 ℃。

質(zhì)譜條件:離子源為電子轟擊源(electron ionization,EI),電子能量70 eV,離子源溫度300 ℃,傳輸線溫度250 ℃,質(zhì)量掃描范圍為m/z40～500。

定性:利用安捷倫MassHunter Workststion Software對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析,結(jié)合NIST20(National Institute of Standards and Technology 2020)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行初步鑒定,再結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行圖譜解析完成揮發(fā)物的最終定性。

定量:以仲辛醇為內(nèi)標(biāo),采用內(nèi)標(biāo)法按公式(1)計(jì)算每個(gè)組分的絕對(duì)含量:

(1)

式中:w,單一成分絕對(duì)含量,mg/kg;A1,單一成分峰面積;A2,內(nèi)標(biāo)峰面積;ρ2,內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度,μg/mL;V2,內(nèi)標(biāo)體積,μL;m,樣品質(zhì)量,g。

1.3.4 揮發(fā)性成分香氣活度值(odor activity value, OAV)計(jì)算

待確定每個(gè)揮發(fā)性成分絕對(duì)含量后,通過(guò)化合物嗅覺(jué)閾值匯編[18]檢索每個(gè)揮發(fā)性成分的香氣閾值,按公式(2)計(jì)算揮發(fā)性成分的OAV:

OAVi=wi/Ti

(2)

式中:wi,某一化合物的含量,mg/kg;Ti,某一化合物氣味閾值,mg/kg。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用MassHunter Workststion Software Qualitative Analysis(B.07.00 SP 2,美國(guó)安捷倫),Microsoft Excel 2016和SPSSPro在線分析軟件(https://www.spsspro.com/)對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳統(tǒng)剁椒感官分析

在發(fā)酵過(guò)程中,剁椒感官特征發(fā)生了較為明顯的變化,由表2可知,發(fā)酵初期F0樣品綜合評(píng)分最低為58.6分,此時(shí)辣椒剛粉碎,水分含量高、色澤艷麗、口感清脆,但發(fā)酵尚未開(kāi)始,剁椒中酸味物質(zhì)含量低,姜蒜的呈味物質(zhì)也未充分釋放,因此氣味單一,辛辣沖鼻,滋味不協(xié)調(diào)。F50樣品的感官評(píng)分最高為81.4分,香氣、滋味表現(xiàn)最好,發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)對(duì)剁椒香氣和滋味影響較大,隨著發(fā)酵的深入,辣椒、生姜和大蒜中的揮發(fā)性物質(zhì)得到了充分釋放,剁椒發(fā)出豐富的果香、蒜香和乳酸發(fā)酵香氣;滋味咸度適中、酸甜協(xié)調(diào),爽口宜人;色澤和脆度的下降,可能與辣椒細(xì)胞脫水、果膠含量下降有關(guān)[19]。

表2 傳統(tǒng)剁椒感官評(píng)分Table 2 Sensory evaluation of traditional chopped peppers

2.2 揮發(fā)性成分分析

傳統(tǒng)剁椒揮發(fā)性成分通過(guò)GC-MS分析,總離子流圖如圖1所示,物質(zhì)出峰時(shí)間主要在1～110 min,部分鑒定結(jié)果見(jiàn)表3(完整數(shù)據(jù)見(jiàn)電子增強(qiáng)出版附表https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036204)。

圖1 傳統(tǒng)剁椒發(fā)酵60 d后揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components of traditional chopped pepper after 60 d of fermentation

在剁椒發(fā)酵期間共分離鑒定出106種揮發(fā)性成分,其中烯類(lèi)38種、酯類(lèi)22種、醇類(lèi)10種、醛類(lèi)7種、硫化物15種、其他類(lèi)(包括醚類(lèi)、酮類(lèi)、酚類(lèi)、酸類(lèi)、烷烴類(lèi))14種。

烯類(lèi)為揮發(fā)性成分中含量最高的物質(zhì),這與崔桂娟[15]對(duì)湖南剁椒的研究結(jié)果一致,主要來(lái)自辣椒和姜,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)占比下降并穩(wěn)定在61.3%左右。姜烯含量最高,約占烯類(lèi)物質(zhì)的23.2%,這與石華治等[20]的研究一致。姜烯是一種源自生姜的單環(huán)倍半萜烯,具有神經(jīng)保護(hù)潛能、保護(hù)心臟和抗癌活性[21-22]。β-倍半水芹烯、α-姜黃烯、β-水芹烯在發(fā)酵完成后含量分別增加了27%、23%、33%,而檸檬烯則下降了95%,γ-萜品烯下降至未檢出。檸檬烯易發(fā)生氧化降解和微生物轉(zhuǎn)化,能轉(zhuǎn)化為香氣更濃郁的氧化單環(huán)單萜[23]。發(fā)酵過(guò)程中,烯類(lèi)由32種增加到33種。

酯類(lèi)主要由發(fā)酵過(guò)程中的酸類(lèi)與醇類(lèi)脫水酯化和氨基酸降解而來(lái)[24],在發(fā)酵初期占總揮發(fā)性成分的3.8%,發(fā)酵結(jié)束后增加并穩(wěn)定在7.3%左右。酯類(lèi)以乙酯為主,其中反式-4-癸烯酸乙酯含量最高,約占22.1%,是具有白蘭地風(fēng)味和梨香的天然香料。反式-4-癸烯酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯和8-甲基壬酸乙酯的含量發(fā)酵完成后分別增加了120%、169%、117%和171%。發(fā)酵過(guò)程中,酯類(lèi)由18種增加到21種。

硫化物類(lèi)主要來(lái)自大蒜[25],發(fā)酵初期占比為19.8%,隨后增加并穩(wěn)定在25.3%左右,其中二烯丙基二硫醚與烯丙基(E)-1-烯基二硫化物互為同分異構(gòu)體,發(fā)酵結(jié)束時(shí)共占硫化物類(lèi)的53%。二烯丙基二硫醚存在于洋蔥、大蒜等中,呈大蒜特殊氣味,可作為食品添加劑,具有抗腫瘤、抗菌作用[26]。發(fā)酵過(guò)程中烯丙基(E)-1-烯基二硫化物、二烯丙基三硫醚、1,2-二硫酚發(fā)酵完成后含量分別增加了20%、138%、56%。發(fā)酵過(guò)程中,硫化物類(lèi)由11種增加到15種。

醛類(lèi)在發(fā)酵初期占總揮發(fā)性成分的2.7%,隨后減少并穩(wěn)定在1.5%左右。檸檬醛在醛類(lèi)揮發(fā)成分中占比最高,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)其占比由87.2%下降到了75.0%。檸檬醛存在于多種植物的葉和果實(shí)中[27],在酸性條件下易發(fā)生系列轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化為單萜醇和芳香化合物。發(fā)酵過(guò)程中除反式-2,4-癸二烯醛含量增加外,其他醛類(lèi)成分含量呈下降趨勢(shì),如2-己烯醛、香茅醛最終未檢出。反式-2,4-癸二烯醛主要來(lái)自姜,具有堅(jiān)果和脂肪香氣,對(duì)食物的香氣起著重要的作用。發(fā)酵過(guò)程中,醛類(lèi)由6種減少到5種。

醇類(lèi)為含量較低的揮發(fā)性成分,主要由糖和氨基酸代謝而來(lái)[28],含量呈下降趨勢(shì),發(fā)酵結(jié)束時(shí)占總揮發(fā)性成分的1.0%。醇類(lèi)中左旋龍腦占比較大,約為36.8%,其發(fā)酵60 d時(shí)含量與發(fā)酵初期相比下降了37%。左旋龍腦主要來(lái)自姜,具有松香、樟腦樣氣味,具有抗細(xì)胞凋亡、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用。芳樟醇在辣椒、姜、蒜均含有,為重要的香料化合物,具有甜嫩新鮮的花香,為剁椒發(fā)酵初期的重要香氣成分,因芳樟醇易氧化,在發(fā)酵30 d后含量下降至未檢出。

其他類(lèi)包括醚、酸、烷烴、酮、酚類(lèi),這類(lèi)物質(zhì)發(fā)酵結(jié)束時(shí)約占總揮發(fā)性成分的3.3%。發(fā)酵結(jié)束時(shí)2-甲基十三烷和二甲醚含量較高,約占其他類(lèi)揮發(fā)成分的33%和30%。β-紫羅蘭酮為重要的天然香料,具有抗癌、抗炎、抗氧化等多種生物活性[29],它天然存在于辣椒和姜中,也可由檸檬醛轉(zhuǎn)化而來(lái),雖然僅占其他類(lèi)的5.4%,由于香氣閾值極低,使其成為剁椒中最為重要的香氣成分。

由圖2-a可知,揮發(fā)物總量呈先升高后下降的趨勢(shì),在發(fā)酵50 d時(shí)揮發(fā)物總量最大為506.25 mg/kg,在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中烯類(lèi)占比最高,硫化物、酯類(lèi)次之。從圖2-b可知,烯類(lèi)占比顯示出先下降再穩(wěn)定的特點(diǎn),在發(fā)酵第10天開(kāi)始穩(wěn)定在63%左右,硫化物類(lèi)和酯類(lèi)則呈現(xiàn)為先上升再穩(wěn)定情況,硫化物類(lèi)在發(fā)酵第10天開(kāi)始穩(wěn)定在25%,酯類(lèi)在第20天時(shí)開(kāi)始穩(wěn)定在6.9%左右。醇類(lèi)、醛類(lèi)和其他類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量較低,在0.9%～3.6%。

a-各類(lèi)揮發(fā)性成分的含量;b-各類(lèi)揮發(fā)性成分的相對(duì)含量

2.3 不同發(fā)酵時(shí)間香氣物質(zhì)的OAV分析

揮發(fā)性成分含量的多少并不能直接反映其對(duì)香氣貢獻(xiàn)的大小,一般通過(guò)計(jì)算該物質(zhì)的OAV反映其對(duì)香氣的貢獻(xiàn)。通常認(rèn)為OAV>1時(shí),該化合物對(duì)總體香氣可能有貢獻(xiàn)價(jià)值,OAV越大,則對(duì)香氣的貢獻(xiàn)就越大[30]。部分物質(zhì)香氣閾值和OAV見(jiàn)表4(詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)電子增強(qiáng)出版附件),其中OAV>1的關(guān)鍵香氣物質(zhì)有30種,包括酮、烯、硫化物、醇、酚、醛、酯、烷烴類(lèi)物質(zhì)。

表4 傳統(tǒng)剁椒香氣成分的氣味描述、香氣閾值及OAV Table 4 Odor description, aroma threshold and OAV of aroma components of traditional chopped pepper

在初期的原料中,OAV>1關(guān)鍵香氣物質(zhì)有23種,以β-紫羅蘭酮、反式-2,4-癸二烯醛、芳樟醇、2-己烯醛、月桂烯、檸檬烯等成分香氣貢獻(xiàn)較高,香氣特征主要以果香、花香為主;發(fā)酵20 d時(shí),OAV>1的關(guān)鍵香氣物質(zhì)有29種,與發(fā)酵初期比增加了二甲基三硫醚、丁香酚等成分,香氣特征以果香、花香為主,伴有辛辣香、蒜香;發(fā)酵40和60 d時(shí),OAV>1的關(guān)鍵香氣物質(zhì)有27種,芳樟醇和2-己烯醛含量下降至未檢出,香氣特征基本穩(wěn)定,表現(xiàn)為以果香、花香為主,兼有辛辣香、蒜香和焦香。

2-己烯醛、檸檬烯具有濃郁的水果香氣和鮮橙子香氣,因其含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)快速下降,因此為發(fā)酵初期的主要香氣成分。月桂烯具有甜橘味和香脂氣,β-水芹烯具有焦香味,二甲基三硫醚呈強(qiáng)烈的薄荷氣味和濃烈辛辣香,二烯丙基二硫醚則具有大蒜特殊氣味,β-紫羅蘭酮和反式-2,4-癸二烯醛呈現(xiàn)濃郁的木香、水果香。綜上可知,成熟剁椒的關(guān)鍵香氣成分為β-紫羅蘭酮、反式-2,4-癸二烯醛、二甲基三硫醚、月桂烯、β-水芹烯、丁香酚、二烯丙基二硫醚,以上物質(zhì)是剁椒具有濃郁果香、花香和辛辣香的關(guān)鍵。

2.4 不同發(fā)酵期關(guān)鍵香氣物質(zhì)的相關(guān)性分析

將對(duì)香氣貢獻(xiàn)較大(OAV>100)的11種主要香氣成分進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,結(jié)果見(jiàn)表5。從表中可知,2-己烯醛與檸檬烯呈極顯著正相關(guān),與芳樟醇呈顯著正相關(guān),且含量變化趨勢(shì)均為減小,這可能是由于這3種物質(zhì)都主要來(lái)源于辣椒,辣椒含水量高、易粉碎,揮發(fā)成分較易析出,在發(fā)酵初期含量較高,隨著發(fā)酵的深入這些物質(zhì)不斷揮發(fā)、氧化降解[31],含量逐漸下降,這一現(xiàn)象與發(fā)酵初期香氣特征以果香、木香為主的情況相符。β-水芹烯與二烯丙基二硫醚呈極顯著正相關(guān),β-紫羅蘭酮與丁香酚呈顯著正相關(guān),含量同步增加,推測(cè)原因是這些成分主要來(lái)自姜和蒜。姜蒜結(jié)構(gòu)緊實(shí)、纖維豐富、含水量低,揮發(fā)成分需逐漸釋放,這也與發(fā)酵后期香氣特征以果香、辛香、蒜香為主的情況相符。β-紫羅蘭酮、丁香酚和檸檬醛都主要來(lái)自姜,但檸檬醛與β-紫羅蘭酮和丁香酚卻呈極顯著負(fù)相關(guān),這主要是因?yàn)闄幟嗜┰谒嵝詶l件下穩(wěn)定性差,易發(fā)生氧化降解,轉(zhuǎn)化為β-紫羅蘭酮等物質(zhì)。

表5 主要香氣成分相關(guān)系數(shù)表Table 5 Correlation coefficient table of main aroma components

3 結(jié)論

本研究利用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間萬(wàn)州傳統(tǒng)剁椒中揮發(fā)性成分進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性成分由烯類(lèi)、硫化物類(lèi)、酯類(lèi)和少量的醛類(lèi)、醇類(lèi)物質(zhì)組成,物質(zhì)種類(lèi)和含量在不同時(shí)間均有差異,在發(fā)酵初期最少,發(fā)酵50 d時(shí)揮發(fā)性成分種類(lèi)和含量達(dá)到最大并趨于穩(wěn)定。對(duì)結(jié)果分析可知,不同發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)的剁椒中香氣物質(zhì)、香氣特征均存在一定差異。通過(guò)計(jì)算OAV,篩選出不同發(fā)酵時(shí)間剁椒的關(guān)鍵香氣物質(zhì),發(fā)現(xiàn)β-紫羅蘭酮、反式-2,4-癸二烯醛為各發(fā)酵階段共有的關(guān)鍵香氣物質(zhì),未發(fā)酵時(shí)關(guān)鍵香氣成分還有芳樟醇、2-己烯醛、月桂烯、檸檬烯,發(fā)酵60 d后關(guān)鍵香氣物質(zhì)變?yōu)槎谆蛎?、月桂烯、?水芹烯、丁香酚,關(guān)鍵香氣物質(zhì)的改變導(dǎo)致香氣特征由木香、柑橘香、花香轉(zhuǎn)變?yōu)橐阅鞠?、果香為主伴有辛辣香、焦香和蒜香。發(fā)酵過(guò)程有利于剁椒中揮發(fā)性成分充分釋放,使剁椒的香氣更豐富。通過(guò)本研究,可為自然發(fā)酵下傳統(tǒng)剁椒的品質(zhì)提高和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。