王從玉,李鵬飛,王思文,鮑思潔,石海紅,管懷進

0 引言

白內(nèi)障是全球致盲性眼病的主要原因,表現(xiàn)為晶狀體透明度喪失,嚴(yán)重影響患者的視力[1]。而手術(shù)干預(yù)是目前治療白內(nèi)障唯一有效的治療方法。因此,探討白內(nèi)障的發(fā)病機制就顯得尤為重要。白內(nèi)障的病因較為復(fù)雜,包括基因突變引起的晶狀體先天發(fā)育異常、衰老引起的氧化損傷、糖尿病引起的糖代謝異常以及術(shù)后炎癥因子刺激導(dǎo)致晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells,LECs)增生等因素,都與白內(nèi)障的形成有關(guān)。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)自噬流的調(diào)控可通過改變LECs的狀態(tài),參與白內(nèi)障的病理生理過程。因此,為了系統(tǒng)地了解自噬流調(diào)控對白內(nèi)障眼病的影響,本文對其展開綜述。

1 自噬流及其調(diào)控通路

1.1自噬流細胞自噬是一系列自噬膜結(jié)構(gòu)逐漸成熟的動態(tài)過程。目前將自噬雙層膜形成、自噬體形成、自噬溶酶體形成以及自噬溶酶體降解的動態(tài)過程定義為自噬流(autophagic flux),亦稱為“自噬潮”[2]。主要包括:(1)自噬起始:含Atg1/ULK1的復(fù)合物啟動自噬。(2)自噬體形成:Beclin1/Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(PI3KⅢ)復(fù)合物、Atg9-Atg2-Atg18復(fù)合物和Atg5-Atg12-Atg16L1復(fù)合物、以及依賴于Atg3、Atg4和Atg7的LC3,介導(dǎo)自噬體的延長和成熟[3-4]。(3)自噬體和溶酶體的運輸和融合:此過程需要Rab7[5-6],EPG5[6-7],HOPS[8-9],PLEKHM1[10]和SNAREs的參與[11-12]。(4)自噬完成:此過程需要溶酶體內(nèi)的水解酶降解自噬體,并通過轉(zhuǎn)運體將降解產(chǎn)物釋放到細胞質(zhì)中,重新合成新的生物大分子或參與其他代謝途徑[13-14]。

1.2調(diào)控自噬流的信號通路mTOR通路是目前白內(nèi)障自噬流調(diào)控通路研究最多的一條通路,它是多條信號通路的匯聚點,如下所示:(1)PI3K-AKT-mTOR信號通路:PI3K激活的結(jié)果是活化AKT,AKT磷酸化mTOR分子并激活mTOR,進而抑制自噬,或通過磷酸化TSC1/2,阻止其對小G蛋白Rheb的負調(diào)控,進而使Rheb累積,而后上調(diào)mTOR,抑制自噬啟動。(2)AMPK-mTOR信號通路:生理狀態(tài)下,細胞內(nèi)AMPK處于失活狀態(tài),環(huán)境刺激因素,如缺氧、饑餓等可引起細胞內(nèi)能量降低,導(dǎo)致AMP/ATP的比值增高,從而激活A(yù)MPK;當(dāng)細胞內(nèi)能量下降時,LKB1可磷酸化激活A(yù)MPK,活化的AMPK通過抑制mTORC1的活性,進而誘導(dǎo)自噬。AMPK/mTOR/ULK1通路作為調(diào)控自噬的重要路徑而備受關(guān)注,在營養(yǎng)缺乏時,激活的AMPK通過抑制mTOR,來催化ULK1磷酸化從而激活自噬,是一種正向調(diào)控機制;相反,在營養(yǎng)充足時,PI3K-AKT活化下游的mTOR磷酸化ULK1,抑制自噬。(3)MAPK信號通路:包括ERK、JNK和p38激酶家族通路,在許多細胞活動中起作用,如生長增殖、細胞分化、細胞運動或死亡。在這一過程中改變自噬信號通路會影響自噬進程,參與白內(nèi)障的發(fā)生[15]。

2 自噬流調(diào)控在白內(nèi)障眼病中的作用機制

2.1先天性白內(nèi)障先天性白內(nèi)障(congenital cataract,CC)的發(fā)生機制:晶狀體主要由未分化的單層立方上皮細胞以及其分化而來的纖維細胞組成,在上皮細胞分化為成熟的纖維細胞過程中會伴隨著線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等膜性細胞器的降解,形成無細胞器區(qū)(organell-free-zone, OFZ),細胞器的異常降解會導(dǎo)致晶狀體細胞發(fā)育異常,影響其透明度,從而引發(fā)CC的形成[16]。而自噬不僅能回收利用LECs中受損細胞器和錯誤折疊蛋白,而且在LECs分化成晶狀體纖維細胞過程中參與細胞器的降解中同樣發(fā)揮重要作用[17]。

目前,研究顯示存在FYCO1、Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(Pik3c3)、CHMP4B、EPG5、ERCC6、TDRD7等基因的突變/敲除,通過影響自噬流的運行,導(dǎo)致CC的形成。FYCO1基因突變是導(dǎo)致常染色體隱性遺傳性CC的原因之一,其主要通過抑制自噬體向溶酶體轉(zhuǎn)運過程,導(dǎo)致晶狀體纖維細胞中細胞器降解失敗,從而使晶狀體發(fā)生混濁,形成CC[18]。Pik3c3又稱為Vps34,是唯一一個Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(PI3KⅢ),有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在特異性敲除Pik3c3的鼠模型中,自噬流的發(fā)生在胚胎時期即受到抑制[17]。CHMP4B是3個人類直系同源的哺乳動物Vps32基因之一,其在常染色體顯性遺傳性CC患者中發(fā)生基因突變,進而調(diào)控自噬流的降解過程參與白內(nèi)障的形成[19]。EPG5是特異性自噬基因epg-5的人類同系物,編碼一個關(guān)鍵的自噬降解階段的調(diào)節(jié)因子(異位P顆粒自噬蛋白5),與自噬溶酶體的形成有關(guān)。已有研究證實EPG5基因突變在Vici綜合征中具有致病作用,而Vici綜合征是一種隱形遺傳性多系統(tǒng)疾病,可表現(xiàn)為CC[20]。Cockayne綜合征是因ERCC6或ERCC8基因突變所導(dǎo)致的遺傳性疾病,多伴發(fā)CC,而ERCC6是DNA修復(fù)機制核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair,NER)的重要成員,因此,其表達的缺失與CC的形成密切相關(guān)。近來,有學(xué)者發(fā)現(xiàn),ERCC6與溶酶體膜蛋白VCP存在相互作用,進而影響自噬體與溶酶體的結(jié)合而導(dǎo)致LECs內(nèi)自噬流的降解異常。所以,ERCC6在CC中也可能通過調(diào)節(jié)自噬流的降解階段來參與白內(nèi)障的形成過程,但其在CC中具體的作用機制有待進一步探索[21]。此外,最近的一項研究發(fā)現(xiàn)在CC患者中存在TDRD7基因突變,TDRD7在眼組織中大量表達[22]。進一步研究發(fā)現(xiàn),TDRD7可能直接與自噬關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Tbc1d20 mRNA結(jié)合并下調(diào)其表達,抑制自噬體和溶酶體的融合,從而破壞自噬流,導(dǎo)致晶狀體纖維細胞中錯誤折疊蛋白質(zhì)和受損細胞器的降解異常,進而導(dǎo)致人和小鼠晶狀體發(fā)育異常[23]。

晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白對維持晶狀體透明度的重要性不言而喻,所以編碼晶狀體蛋白的基因點突變可導(dǎo)致CC形成。研究證實晶狀體縫隙連接蛋白α(Gja8b)基因突變會導(dǎo)致斑馬魚LECs中細胞器降解功能障礙,通過誘導(dǎo)自噬下調(diào)可能是導(dǎo)致CC發(fā)生的主要致病機制[24]。α晶狀體蛋白是晶狀體內(nèi)重要的伴侶蛋白,是兩種多肽αA-和αB-晶狀體蛋白的低聚物,其分子伴侶活性使其在維持晶狀體的透明過程中發(fā)揮重要的作用。Wignes等[25]研究發(fā)現(xiàn)αB-晶狀體蛋白R120G(aBR120G)突變小鼠LECs中持續(xù)存在錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集體,表明自噬清除功能受損,p62蛋白累積,最終導(dǎo)致CC形成。同樣,αA-R49C突變導(dǎo)致LECs中p62累積,蛋白質(zhì)聚集,細胞死亡以及突變蛋白質(zhì)在細胞核中錯誤定位,而增強自噬可促進LECs中蛋白質(zhì)降解,從而減少晶狀體混濁,提示自噬缺陷與CC的致病機制相關(guān)[26],通過激活自噬流來防止晶狀體中蛋白質(zhì)聚集的研究,將為后續(xù)揭示CC的發(fā)病機制提供明確方向。

2.2年齡相關(guān)性白內(nèi)障年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract,ARC)形成的確切發(fā)病機制尚未完全闡明[27]。自噬流調(diào)控LECs的凋亡是近年來研究的熱點話題,多項研究結(jié)果表明自噬流的增強或通暢可以減少LECs的凋亡,延緩ARC的發(fā)生發(fā)展。已有學(xué)者證實,晶狀體組織中自噬流起始階段的關(guān)鍵蛋白Atg5和Atg4a缺失導(dǎo)致自噬流起始階段異常,從而加速LECs的凋亡,最終導(dǎo)致小鼠ARC的發(fā)生[17,28]。此外,還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)自噬溶酶體降解通路降解錯誤折疊的氧化損傷修復(fù)蛋白MSH3和XRCC5,進而調(diào)控LECs的凋亡,參與ARC的發(fā)生發(fā)展[29-30]。

近年來多項研究證實,非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)在ARC的自噬流過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。ncRNA可以通過多種機制參與調(diào)控靶基因信使RNA(mRNA)的表達而得以廣泛運用,主要包括微小RNA(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)和環(huán)狀RNA(circRNA)。許多研究探索發(fā)現(xiàn)miRNA通過調(diào)控自噬流的靶基因來參與ARC的發(fā)生發(fā)展[31]。研究發(fā)現(xiàn),miR-23b-3p在LECs中顯著上調(diào),通過抑制SIRT1及其下游FOXO來抑制自噬流起始階段蛋白Atg7和Beclin1在LECs中表達,從而減弱自噬對錯誤折疊蛋白和損傷細胞器的清除,導(dǎo)致ARC的發(fā)生[32]。Let-7c-3p通過靶向沉默LECs中的自噬流起始階段基因Atg3表達,進而抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬和凋亡[33]。此外,let-7c-5p通過抑制NER基因ERCC6的表達阻止自噬溶酶體降解階段,通過減少ERCC6的表達之后導(dǎo)致自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin1和p62增加,表明自噬降解階段受阻,隨后該團隊深入研究發(fā)現(xiàn)ERCC6所編碼的蛋白CSB能夠與一種參與自噬溶酶體降解的標(biāo)記物VCP相互作用參與自噬降解。因此,let-7c-5p通過調(diào)控ERCC6/VCP通路影響自噬體的降解過程,參與ARC的發(fā)生發(fā)展[34]。此外,Has_circ_0004058通過miR-186/Atg7軸促進自噬小體的形成來抑制SRA01/04細胞凋亡[35]。有研究表明,自噬相關(guān)的lncRNA參與白內(nèi)障的形成,敲低lncRNA的晶狀體模型抑制了LC3BⅠ向LC3BⅡ的轉(zhuǎn)化,從而減弱LECs中的自噬活性[36]。lncRNA能否在白內(nèi)障體內(nèi)模型中調(diào)控自噬基因或者自噬通路來控制白內(nèi)障的發(fā)生,還有待進一步探索和研究。

然而,也有一些學(xué)者持相反觀點,認(rèn)為ARC的形成與自噬流的過度激活有關(guān),通過減弱自噬通量后,可減輕氧化應(yīng)激和DNA損傷誘導(dǎo)的LECs衰老[37]。同時,有研究發(fā)現(xiàn)自噬降解底物p62的缺失與衰老相關(guān)的疾病有關(guān),并證實p62可以通過延緩衰老來促進小鼠的壽命[38]。最近的一項研究中發(fā)現(xiàn)ARC患者的LECs中自噬水平顯著增高,而p62蛋白水平顯著降低,最終導(dǎo)致細胞存活率下降[39]。因此在氧化應(yīng)激下,晶狀體中過度活躍的自噬可能會導(dǎo)致細胞活力喪失,進一步促進ARC發(fā)生[40]。

最新的研究發(fā)現(xiàn),許多藥物可以調(diào)控自噬流的進程。在ARC衰老小鼠模型的LECs中,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)低劑量二甲雙胍通過激活A(yù)MPK途徑和加速自噬溶酶體的降解過程,抑制衰老小鼠晶狀體混濁,從而延緩ARC進程[41]。Xu等[42]研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖顯著增加自噬降解底物蛋白p62的表達,抑制成熟的自噬小體LC3的降解,通過損害自噬流和線粒體功能誘發(fā)LECs衰老,而二甲雙胍可以通過降低ROS含量、增加ATP和MMP水平來改善線粒體功能,抑制D-半乳糖誘導(dǎo)的LECs衰老。目前的研究可以證明,自噬流調(diào)控是ARC發(fā)生的重要機制,因此,開發(fā)調(diào)控自噬流通路的藥物可以為ARC的防治開辟新途徑。

2.3糖尿病性白內(nèi)障糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract,DC)是糖尿病的常見并發(fā)癥,是糖尿病患者視力受損和失明的主要原因。DC的潛在機制尚不清楚,氧化損傷和EMT機制比較公認(rèn)。研究顯示,在DC患者的前囊膜LECs中Atgs的表達、AMPK及其下游調(diào)節(jié)因子TFEB和FOXO3的活性受到抑制,初步表明自噬活性下降與DC發(fā)病機制密切相關(guān)[43]。

在DC的發(fā)病機制研究中,高糖會導(dǎo)致LECs氧化損傷,而自噬能夠顯著減輕高糖誘導(dǎo)的LECs氧化損傷[44]。例如,補清顆粒通過促進LECs內(nèi)Beclin1蛋白表達,減弱mTOR在小鼠晶狀體中對自噬流的抑制作用,從而促進自噬流的發(fā)生達到對DC小鼠起到治療作用;深入研究發(fā)現(xiàn),補清顆粒還通過影響線粒體自噬相關(guān)受體蛋白BNIP3/NIX、PINK1/PARKIN的表達,上調(diào)線粒體自噬活性以清除受損線粒體,減輕高糖誘導(dǎo)的LECs線粒體損傷,延緩DC的發(fā)展[45-47]。此外,Liu等[48]研究發(fā)現(xiàn)在DC的小鼠模型LECs中,伴隨著持續(xù)的高糖刺激下,LC3水平雖然顯著升高,但是自噬降解底物蛋白p62先降低后升高,表明自噬流雖然在早期高糖刺激下增強,但在持續(xù)高糖刺激后發(fā)現(xiàn)自噬流被阻斷。隨后的實驗發(fā)現(xiàn),超氧化物歧化酶2和過氧化氫酶先增加后降低,提示高糖誘導(dǎo)LECs中ROS生成增多,而隨著高糖刺激時間的延長,LECs內(nèi)抗氧化防御機制下調(diào),從而導(dǎo)致LECs發(fā)生氧化損傷導(dǎo)致自噬流降解階段異常,進而誘發(fā)DC。

據(jù)報道,LECs的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)也是DC的發(fā)病機制之一[49],在DC的發(fā)展過程中,自噬參與LECs的EMT過程,研究證實高糖促進EMT,而雷帕霉素不僅能夠激活自噬并且顯著抑制EMT通路,同時使參與EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail和p62水平下降,因此激活自噬可能改善DC中的晶狀體纖維化[50]。然而,過度活躍的自噬會加劇DC進展。程榮等[51]在1型糖尿病模型鼠LECs中檢測到自噬功能失調(diào),自噬水平明顯增高,表現(xiàn)為自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin1、p62水平升高。盡管糖尿病模型鼠LECs中自噬體明顯增加,但是自噬小體和溶酶體結(jié)合能力出現(xiàn)明顯異常,成為誘發(fā)DC的關(guān)鍵。Li[52]研究表明高糖會激活HLECs中的自噬,過度活躍的自噬促進HLECs遷移并增加TGF-β的表達,參與DC的發(fā)生發(fā)展。據(jù)報道,miR-30a在DC患者的LECs組織中表達下降,同時,miR-30a可以通過靶向自噬起始階段基因Beclin1降低高糖誘導(dǎo)的自噬水平[53]。

先前的研究表明抗氧化劑如甘氨酸、姜黃素、N-乙酰半胱氨酸(NAC)和谷胱甘肽乙酯(GSH-EE),能夠延緩DC的發(fā)生發(fā)展[54-56]。最新的研究表明,姜黃素類似物C1可以激活TFEB,增強溶酶體的生物合成和保護性自噬,從而減輕高糖誘導(dǎo)的DC[57]。此外,也有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇作為一種有效的抗氧化劑,通過激活p38激酶家族信號通路(MAPK)激活自噬,從而抑制高糖誘導(dǎo)的HLECs氧化損傷[44]。盡管已經(jīng)證明有藥物可以控制DC的進展,但這些藥物尚未應(yīng)用于人類眼科疾病的臨床,未來還需要更深入的研究。

2.4后發(fā)性白內(nèi)障后發(fā)性白內(nèi)障(posterior capsular opacification,PCO)是白內(nèi)障手術(shù)后最常見的術(shù)后并發(fā)癥,主要由術(shù)后晶狀體囊內(nèi)殘留LECs的增殖、遷移和EMT等形成[58]。防止PCO的有效方式是在白內(nèi)障摘除術(shù)中盡量消除晶狀體囊袋內(nèi)的LECs或抑制殘留的LECs增生和遷移。

近來,一些學(xué)者開發(fā)載藥人工晶狀體,通過加入藥物激活自噬,從而抑制LECs的增生和遷移[59]。據(jù)報道,環(huán)孢素A是一種免疫抑制劑,在體外可以抑制LECs增殖[60]。深入研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)環(huán)孢素A處理后的LECs中LC3Ⅱ表達顯著增加,而細胞存活率嚴(yán)重下降,隨后通過體外實驗發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素A誘導(dǎo)細胞自噬性死亡,防止PCO的形成,揭示自噬在PCO防治方面的重要作用[61]。同樣,在載藥人工晶狀體中注入聚氨基酰胺(PAMAM)聚合物后,發(fā)現(xiàn)自噬增強,LC3Ⅱ水平增加,有效地抑制白內(nèi)障術(shù)后PCO發(fā)生,并且不會對其他眼部組織造成損害[62]。

此外,有研究首次在ARC患者術(shù)后分析LECs凋亡的情況,發(fā)現(xiàn)1%臺盼藍誘導(dǎo)LECs自噬性細胞死亡,表明1%臺盼藍染色有助于降低白內(nèi)障術(shù)后PCO發(fā)生率[63]。Liu等[64]研究發(fā)現(xiàn)萊菔硫烷(sulforapgane,SFN)可誘導(dǎo)ROS,并激活MAPK信號通路,通過增加LC3Ⅱ和自噬囊泡的形成,促進HLECs自噬性死亡,從而延緩PCO進程。最近一項預(yù)防PCO的研究表明PP242在體外顯著抑制mTORC1和mTORC2介導(dǎo)的信號通路,抑制LECs的增殖和遷移,并誘導(dǎo)細胞凋亡,需要進一步研究確定自噬和mTOR信號通路在LECs死亡中的調(diào)節(jié)機制[65]。關(guān)于細胞死亡和自噬與PCO之間的聯(lián)系的研究將在未來引起人們的廣泛關(guān)注。

EMT是術(shù)后PCO形成的重要機制。而有研究發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障手術(shù)刺激導(dǎo)致房水中的TGF-β2顯著升高,是觸發(fā)EMT的關(guān)鍵因素[66],EMT導(dǎo)致后囊膜混濁,被稱為纖維性白內(nèi)障[67],抑制EMT可能是治療PCO的有效途徑之一。Sun等[68]研究證實TGF-β2促進LECs中初級自噬小體LC3Ⅰ向成熟自噬小體LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化和p62的降解,從而促進自噬小泡的形成和自噬溶酶體的融合降解過程,說明過度活躍的自噬將導(dǎo)致LECs發(fā)生EMT,進而誘發(fā)PCO。Atg7基因沉默通過降低LC3脂質(zhì)化,抑制TGF-β2在LECs中誘導(dǎo)的纖維化作用,延緩PCO的發(fā)展。此外,自噬抑制劑可通過抑制Smad2/3的磷酸化,減弱TGF-β2途徑,這表明調(diào)控TGF-β/Smad信號通路抑制自噬,可能延緩LECs中EMT。Li等[69]研究表明柚皮素(NRG)可通過減弱Smad2/3磷酸化,抑制HLECs自噬和EMT,為預(yù)防和治療PCO提供了自噬相關(guān)的見解。目前,對于自噬流調(diào)控與PCO關(guān)系的研究,主要是檢測自噬標(biāo)志物水平,具體的調(diào)控機制還有待進一步研究。

3 總結(jié)和展望

綜上所述,自噬在白內(nèi)障中起著雙重作用,良性自噬可以減少氧化應(yīng)激以維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),而在其他條件下,毒性自噬的上調(diào)導(dǎo)致自噬性細胞死亡。雖然自噬在白內(nèi)障中的作用得到了一定的研究,但其在白內(nèi)障中的具體作用機制、分子通路、相互作用等還有很多未知,有待進一步研究。同時,針對自噬流調(diào)控機制的藥物和非編碼RNA等干預(yù)靶標(biāo)值得早日在動物體內(nèi)模型中開展轉(zhuǎn)化實驗。因此,深入研究并了解自噬在白內(nèi)障眼病中的調(diào)控機制,可以為白內(nèi)障患者的防治提供針對性的選擇。