何 媛,錢俊超,3

(1.中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院,合肥 230031; 2.中國科學技術(shù)大學研究生院科學島分院,合肥 230026; 3.中國科學院合肥腫瘤醫(yī)院,合肥 230031)

原發(fā)性肝癌是全球第六大最常見的癌癥,也是2020年全球癌癥死亡的第三大原因[1]。肝細胞癌(HCC)是一種由肝細胞癌變引起的原發(fā)性肝癌,約占原發(fā)性肝癌組織學類型的90%以上,是世界上發(fā)病率最高的癌癥之一[2]。HCC的推薦治療方案包括腫瘤切除或肝移植、腫瘤放療、化療、消融和栓塞等[3]。其中,放療在肝癌治療中的應用越來越多,因為電離輻射(IR)具有安全無創(chuàng)的特性[4-5]。放射治療的新方式,如立體定向放療(SBRT),可以在有效遞送消融劑量的同時保留正常肝細胞,因此,接受放射治療的HCC患者數(shù)量正在逐步增加[6]。雖然通過先進的照射技術(shù),如借助呼吸門控強度調(diào)制和圖像引導的放射治療,可以在不損傷正常組織的情況下對腫瘤給予更適形的治療和更高的輻射劑量[7],但由于腫瘤固有的放射抵抗性和周圍正常肝臟的低輻射耐受性,放療對HCC的治療效率較低[8]。因此,迫切需要能增加腫瘤的放射敏感性和減少正常組織并發(fā)癥的策略。

放射治療中存活下來的癌細胞表現(xiàn)出放射抗性,能夠促進腫瘤再生長和腫瘤復發(fā)。放療抗性的原因主要是癌細胞激活補償性存活信號,包括損傷修復信號、DNA 修復和自噬的誘導等[9]。自噬是一個分解代謝過程,在各種應激刺激下被證明可以促進腫瘤生長和進展,包括饑餓、缺氧、氧化還原應激、化療藥物和輻射等[10]。自噬還可以作為細胞重要的修復途徑之一,通過這種途徑細胞可以降解蛋白質(zhì)和受損細胞器來回收營養(yǎng)物質(zhì)從而繼續(xù)生存[11]。此外,自噬抑制劑可通過誘導更明顯和更長時間的DNA雙鏈斷裂(DSB)對某些腫瘤細胞起到放射增敏的作用[12]。

谷氨酰胺代謝增加是癌癥的標志,許多研究強調(diào)了谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酰胺在HCC發(fā)展中的關(guān)鍵作用[13]。GS是一種代謝酶,通過谷氨酸和氨合成谷氨酰胺,參與肝臟中氨的解毒作用,相關(guān)研究表明,抑制 GS 會降低細胞存活、增殖和腫瘤發(fā)生[14]。以往的研究表明,GS在部分HCC中過度表達且與HCC患者的轉(zhuǎn)移預后密切相關(guān)[15],因此,靶向GS和相關(guān)通路可能為具有固有和獲得性輻射抵抗的患者提供治療益處。然而,GS在HCC的腫瘤發(fā)生和治療反應中的作用仍不清晰,目前還沒有批準用于臨床試驗的安全且特異性靶向 GS 的藥物[16-17]。L-蛋氨酸亞砜亞胺(MSO)是一種特殊氨基酸,可作為谷氨酸類似物抑制多種谷氨酸代謝酶。在哺乳動物中,MSO是GS和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的抑制劑,對GS有良好的且不可逆的抑制作用[16-18]。盡管在一些與HCC相關(guān)的研究中,MSO已被用作GS的抑制劑[19-21],但少有關(guān)于MSO或GS對HCC放療敏感性影響的報道。因此,本研究探討了GS活力對HCC細胞系HepG2體外放療敏感性的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞系HepG2購自Procell生命科學與技術(shù)公司(CL-0103);MSO(Sigma-Aldrich,M5379);基礎培養(yǎng)基(MEM;Procell,PM150410);胎牛血清(Clark,FB25015);青霉素-鏈霉素溶液(Procell,PB180120);抗體(GS:Abcam;LC3:武漢賽維爾,GB11124) ;X射線輻照儀(PXI,Connecticut,USA;源-面距:40 cm);MDC染液(Solarbio,G0170);GS活力檢測試劑盒(上海生工,D799578);TransZol Up Plus RNA 分離試劑(Transgen Biotech,ER501-01);HiScript?II Q Select RT SuperMix(+gDNA wiper)(Vazyme,R233); ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme,Q711);細胞活力檢測試劑盒(CCK-8,上海生工,E606335),Bafilomycin A1(思科捷,SJ-MA0035)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞系HepG2用基礎培養(yǎng)基(MEM)輔以10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液,并在37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2空氣中培養(yǎng)。實驗時,GS抑制劑MSO以0.001 mol/L的濃度溶于培養(yǎng)基中使用。

1.2.2 蛋白免疫印跡

不同組別的細胞被清洗、收集和裂解。提取到的蛋白質(zhì)用10%～12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,然后轉(zhuǎn)移到處理好的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂奶阻斷1 h后,用GS抗體在4 ℃孵育過夜,以小鼠抗GAPDH蛋白作為內(nèi)參蛋白。接下來,對膜進行清洗,在室溫下孵育1 h。使用儀器顯影得到的印跡,并通過Image J軟件進行蛋白定量。

1.2.3 MDC染色

將對數(shù)生長期的HepG2細胞在12孔板(1×105個/孔)中培養(yǎng)至約60%融合,然后使用10 Gy的X射線照射,24 h后使用單丹磺酰(MDC)檢測自噬小體的形成。即先吸走培養(yǎng)基,用PBS洗兩次,然后在37 ℃的無血清條件下,用MDC染色40 min,用PBS沖洗掉多余的MDC,并立即在熒光顯微鏡下觀察細胞自噬情況。

1.2.4 細胞活力測試

HepG2細胞被清洗、胰蛋白酶消化、計數(shù)并接種到96孔板中,密度為每孔3×103,設置5個重復孔。細胞貼壁后,在含有或不含MSO的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h以上,使用X射線輻照儀以4.987 Gy/min的劑量率照射10 Gy的X射線。輻照后,細胞在37 ℃下培養(yǎng)72 h,用細胞活力檢測試劑盒(CCK-8)檢測細胞增殖。測量前2 h,在培養(yǎng)皿的每個孔中加入10 μL的CCK-8試劑。使用酶標儀在450 nm處測量細胞樣品的光密度(OD),然后計算相對增殖率。

1.2.5 集落形成實驗

參考文獻[22]所述方法進行集落形成實驗,即將細胞計數(shù)后,鋪板到6孔板(1×103/孔),根據(jù)是否添加MSO、是否進行IR分成4組。菌落成長10～14 d,更換培養(yǎng)基的頻率為每周2次,直到顯微鏡可以明顯觀察到菌落。菌落形成后吸走培養(yǎng)基用PBS洗滌2次,4%多聚甲醛固定30 min,再用PBS洗2次,使用1%結(jié)晶紫溶液染色15 min,用純水洗凈晾干。結(jié)果使用Image J軟件對菌落的數(shù)量進行計數(shù)、量化。

1.2.6 GS活力測試

根據(jù)GS檢測試劑盒的步驟,檢測不同條件下細胞的GS活力。谷氨酰胺合成酶在ATP和Mg2+的存在下,催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺進一步轉(zhuǎn)化為γ-谷氨?；愲克?在酸性條件下其與鐵形成紅色的絡合物,該絡合物在540 nm處有最大吸收峰,可在酶標儀下被檢測到。

1.2.7 實時熒光定量PCR

使用TransZol Up Plus RNA Kit從5×106個不同組處理的HepG2細胞中提取總RNA,并根據(jù)試劑制造商的說明轉(zhuǎn)錄成cDNA。Q-PCR使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix在Roche LightCycler 96 Real-Time PCR系統(tǒng)上進行。在結(jié)果中,GS的相對mRNA表達水平通過GAPDH的表達水平來進行標準化處理。設計并使用GAPDH(F:5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′; R:5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′)和GS(F:5′-ATTTCAGATTGGACCTTGTG-3′; R:5′-GTGCCGCTTGCTTAGTT-3′)兩種引物通過以下步驟用于PCR擴增:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火和延伸30 s,共40個循環(huán)。2-ΔΔCt法用于目標基因的相對定量。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計分析使用GraphPad Prism 9軟件進行。采用非配對t檢驗比較兩組之間的差異,多組之間的差異用單因素或雙因素方差分析。每個數(shù)值以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 GS抑制劑對HepG2細胞的影響

我們探索了GS抑制劑MSO這種藥物對HepG2肝癌細胞系的作用,與以往的研究結(jié)果一致[23],MSO會引起細胞內(nèi)的負反饋調(diào)節(jié),如圖1(b)～(d)所示,輻照后72 h,GS-mRNA水平以及蛋白表達均顯著上升。但是,GS活力被MSO大幅抑制,具體如圖1(a)所示。

(a)MSO顯著降低細胞內(nèi)GS活力;(b)MSO對GS-mRNA表達的影響;(c)MSO對GS蛋白表達的影響;(d)LC3-II/GAPDH灰度值分析。MSO以0.001 mol/L 的濃度溶于培養(yǎng)基中,處理時間均為72 h。* 為P<0.05;** 為P<0.01。Con:對照組;MSO:MSO處理組。

2.2 GS抑制劑提高HepG2細胞放療敏感性

對輻照后72 h的HepG2細胞進行了CCK-8活力檢測,結(jié)果如圖2(a)所示,MSO單獨作用不會影響細胞活力,但是會進一步加強IR引起的活力下降。此外,使用集落形成實驗進一步確定MSO長期作用下對細胞增殖的影響,與CCK-8的結(jié)果一致,MSO可以在放療后抑制HepG2細胞的增殖,但是在未輻照情況下對細胞增殖并未產(chǎn)生顯著影響。

2.3 IR誘導HepG2細胞自噬

如圖3所示,通過MDC自噬體染料的染色結(jié)果觀察到,細胞內(nèi)自噬體會在IR后明顯增加,提示自噬的激活,而MSO的參與進一步增加了自噬的數(shù)量,表明自噬流受到MSO的影響。

10 Gy劑量單次輻照后24 h,使用MDC染料觀察HepG2細胞在不同處理條件下的自噬形成情況,MSO的濃度為0.001 mol/L。(a)對照組;(b)MSO處理組;(c)輻照組;(d)輻照與MSO共同處理組;倍數(shù):200×;標尺:100 μm。

2.4 GS抑制劑調(diào)節(jié)IR誘導的自噬

為確定MSO對自噬流的具體影響,對自噬相關(guān)蛋白的表達進行了測定。如圖4所示,研究結(jié)果表明,MSO的參與會引起放射治療后LC3蛋白含量的變化,尤其是與自噬流密切相關(guān)的LC3-II蛋白。IR后72 h,細胞內(nèi)LC3-II的水平大幅下降,這可能與IR誘導的自噬流水平的上升以及后續(xù)自噬體的順利降解有關(guān)。然而,MSO抑制GS活力之后,LC3-II蛋白大量堆積,提示自噬流可能被抑制。在輻照后48 h使用Bafilomycin A1 (Baf-A1)阻斷自噬降解以確定輻照和MSO對自噬的影響,結(jié)果表明,Baf-A1使得IR后的LC3-II蛋白堆積而對IR+MSO共同作用組無明顯影響,表明IR激活了自噬,而MSO抑制了IR誘導的自噬。

(a)10 Gy劑量單次輻照后72 h,Western Blot檢測不同條件下自噬相關(guān)蛋白的表達情況;(b)LC3-II/GAPDH的灰度值分析。MSO濃度:0.001 mol/L;Baf-A1濃度:0.000 000 05 mol/L。ns為無顯著差異;* 為P<0.05;** 為P<0.01。Con:對照組;MSO:MSO處理組;IR:輻照組;IR+MSO:輻照與MSO共同處理組。

3 討論與結(jié)論

本研究使用MSO來抑制GS的活性,通過CCK-8和集落形成實驗分別測試了HepG2細胞在放療后短期和長期的增殖效率,分別使用MDC、Western Blot檢測輻照后細胞內(nèi)自噬水平。結(jié)果表明,放療誘導自噬產(chǎn)生,并且GS活力抑制能夠有效影響自噬調(diào)節(jié)從而提高HepG2細胞的放療敏感性。這是首次對肝癌細胞放療敏感性與其GS活性相關(guān)性的研究。

自噬起著多種病理生理作用,它有助于癌癥細胞的生存和死亡,其在癌癥中具有雙重作用[24-25]。據(jù)報道,缺乏自噬相關(guān)蛋白Atg5或Atg7的小鼠會發(fā)展為肝癌[26]。然而,越來越多的證據(jù)表明,自噬對正常細胞中的早期致癌過程具有抑制作用,但在癌癥細胞中,它有助于腫瘤生長、惡性轉(zhuǎn)化和治療抵抗[27]。在HCC相關(guān)研究中,FOXO3表達的抑制被證明可以通過加速自噬賦予HCC細胞對索拉菲尼的抵抗性[28],而自噬的抑制則會增強索拉非尼的敏感性[29]。

此外,自噬是具有放射抗性的癌細胞中一種保守的細胞生存策略,因為它在清除受損的細胞器和蛋白質(zhì)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,這對維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細胞健康至關(guān)重要[30]。多項研究結(jié)果表明,自噬的抑制可以進一步降低輻照后腫瘤的發(fā)生,例如膀胱癌[31]、結(jié)直腸癌[32]和前列腺癌[33]等。在食管癌癥中,肝激酶B1通過AMP激活的蛋白激酶途徑誘導的自噬亦被證明可以增強放射抗性[34]。此外,ATG5或Beclin 1 敲除的癌癥細胞由于自噬抑制而表現(xiàn)出更強的放射敏感性[35]。并且最近研究表明,肝癌細胞放療后的自噬通量會影響細胞的輻射抗性,GABARAP蛋白表達減少抑制了HCC細胞的自噬,并增強了其放射敏感性[36]。我們的結(jié)果也表明,放療后HepG2細胞內(nèi)的自噬水平會明顯增加,這也與其放療抗性密切相關(guān)。

谷氨酰胺合成酶 (GS) 是谷氨酰胺代謝中的一種關(guān)鍵酶,參與多種原核生物和真核生物的氮代謝、酸堿平衡和細胞信號轉(zhuǎn)導[37]。谷氨酰胺合成酶在放射治療中也發(fā)揮重要作用,有研究發(fā)現(xiàn)GS可以在輻照后促進腫瘤細胞的核苷酸代謝和隨后的 DNA 損傷修復[38]。此外,GS在調(diào)節(jié)自噬方面也發(fā)揮重要作用,FOXO3介導的GS表達誘導自噬對細胞存活十分重要[39],且在肝癌細胞中β-catenin也可以調(diào)節(jié)GS的表達并引發(fā)一系列的代謝變化從而誘導自噬[40]。我們的研究結(jié)果也證實了放療后GS對自噬的調(diào)節(jié)作用,GS活力的下降會抑制放療誘導的自噬,也暗示MSO可以通過抑制放療后肝癌細胞內(nèi)GS介導的自噬水平升高來降低細胞的自我修復能力,從而降低細胞增殖能力。

總之,實驗結(jié)果已經(jīng)證實,HepG2細胞放療后增殖能力與其自噬的誘導以及GS活力密切相關(guān)。由于細胞內(nèi)負反饋調(diào)節(jié),MSO雖然引起了GS-mRNA和蛋白表達的增加,但是其對GS活力的抑制能夠有效抑制放療后細胞自噬流的進行,從而提高HepG2細胞的放療敏感性。