肖 月,易杏盈,張東華,劉 麗,閆曉慧,伍建榕,2

(1.西南林業(yè)大學(xué) 生物多樣性保護(hù)學(xué)院 云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650224; 2.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650224)

天然免疫是廣泛存在于各類生物體內(nèi)用于對(duì)抗外來(lái)入侵物的重要防御體系,其進(jìn)化地位古老且保守[1]。相關(guān)膜受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及下游效應(yīng)物在植物、昆蟲(chóng)、脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中被認(rèn)為是十分保守的。但哺乳動(dòng)物、線蟲(chóng)和植物的膜受體接受信號(hào)刺激后也呈現(xiàn)一定的差異,哺乳動(dòng)物通常會(huì)激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,而植物則激活轉(zhuǎn)錄因子WRKY,線蟲(chóng)中未發(fā)現(xiàn)以上兩種轉(zhuǎn)錄因子的同源類似物,這表明動(dòng)物和植物的天然免疫可能起源于一個(gè)共同的祖先,但很早就各自獨(dú)立進(jìn)化[2-3]。

油茶炭疽病是油茶種植產(chǎn)業(yè)中重要病害之一,引起該病的主要病原菌為膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)[4]。膠孢炭疽菌還可侵染核桃、蘋果、橡膠等多種經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種,危害植物種類較多,嚴(yán)重威脅各國(guó)林業(yè)生產(chǎn)[5]。Yang等[6]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析揭示膠孢炭疽菌感染油茶在酪氨酸代謝、苯丙烷生物合成、黃酮類生物合成和異喹啉生物堿生物合成途徑中顯著富集。膠孢炭疽菌不是專性寄生菌,有學(xué)者已建立希金斯炭疽菌(Colletotrichumhigginsianum)與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、膠孢炭疽菌與煙草(Nicotianatabacum)的互作模型[7-8],由于擬南芥等植物培養(yǎng)周期長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)條件控制難度大等因素制約,致病機(jī)制以及互作關(guān)系的深入研究難度較大。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)炭疽病的研究主要集中在化學(xué)防治、生物學(xué)特性等方面,而關(guān)于炭疽病菌與寄主間互作關(guān)系及致病機(jī)制的分子水平研究較少,限制了該病防治技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展[9]。

秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)具有身體透明易觀察、生命周期短、已知全基因序列等優(yōu)點(diǎn),作為模式生物在病原致病機(jī)制等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[10]。其能被人類致病菌在內(nèi)的大量動(dòng)物病原菌以及植物病原菌感染[11]。因而,利用植物病原菌跨越其自然寄主作用于動(dòng)物,很可能揭示出天然免疫中最保守和最古老的部分,而此部分可能成為防治該植物病原菌的廣譜作用靶點(diǎn)。

研究應(yīng)用秀麗隱桿線蟲(chóng)評(píng)估膠孢炭疽菌對(duì)其基本生物學(xué)特性的影響,以此探尋膠孢炭疽菌誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲(chóng)天然免疫應(yīng)答中最為保守和古老的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及孢子菌懸液制備

膠孢炭疽菌從西南林業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室獲得,經(jīng)PDA平板培養(yǎng)。孢子菌懸液以PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng),接入膠孢炭疽菌后25 ℃,180 r/min培養(yǎng)15 d,無(wú)菌紗布過(guò)濾菌絲,收集分生孢子,M9緩沖液稀釋獲得相應(yīng)孢子濃度,血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子濃度計(jì)數(shù)[12]。

1.1.2 線蟲(chóng)的培養(yǎng)及同步化

線蟲(chóng)為野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)(N2),采用固體線蟲(chóng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(NGM),大腸桿菌OP50作為食物源,25 ℃恒溫培養(yǎng)[13]。

M9緩沖液收集產(chǎn)卵期成蟲(chóng)置于15 mL尖底離心管中,離心清洗2～3次。收集的成蟲(chóng)中加入1～2 mL裂解液(0.5 mol/L氫氧化鈉溶液和體積分?jǐn)?shù)2.5%次氯酸溶液),裂解約5 min,2 000 r/min離心2 min,棄上清液,M9緩沖液反復(fù)清洗5～6次,收集管底蟲(chóng)卵,清洗后的蟲(chóng)卵置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中,加入M9緩沖液,25 ℃恒溫孵化16～24 h,獲得L1期幼蟲(chóng),備用[13]。

1.2 方法

1.2.1 菌-蟲(chóng)共培養(yǎng)體系的建立

炭疽菌與線蟲(chóng)培養(yǎng)的培養(yǎng)基差別較大,感染模型需兼顧二者均能較好生長(zhǎng),制定4種培養(yǎng)基:(1) NGM下-PDA上雙層板:培養(yǎng)皿底部倒一層NGM培養(yǎng)基,待凝固后再倒一薄層PDA培養(yǎng)基;(2) NGM上-PDA下雙層板,方法同上;(3) NGM+PDA混合平板:NGM培養(yǎng)基中分別加入1/50、1/30和1/20 PDA培養(yǎng)基;(4)NGM平板。

取相應(yīng)濃度膠孢炭疽菌孢子懸浮液200 μL均勻涂布于處理板上,超凈臺(tái)內(nèi)吹干后加入50 μL經(jīng)離心濃縮的OP50菌液;以滅活的膠孢炭疽菌孢子懸浮液平板為對(duì)照組,將平板放置25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。對(duì)照板和處理板接入約50條L1期幼蟲(chóng),每組設(shè)3個(gè)平行,25 ℃下恒溫培養(yǎng),每12 h進(jìn)行線蟲(chóng)存活率測(cè)定[14]。

1.2.2 線蟲(chóng)存活率測(cè)定

分別將L1期、L4期約50條線蟲(chóng)接種至對(duì)照組和處理組各板中,每組設(shè)3個(gè)平行,25 ℃共培養(yǎng),每12 h測(cè)定線蟲(chóng)存活率。

1.2.3 膠孢炭疽菌孢子濃度與線蟲(chóng)存活率關(guān)系的測(cè)定

分別設(shè)置106、105、104孢子/mL 等3個(gè)不同濃度的孢子菌懸液,將約50條L1期線蟲(chóng)分別接于處理組和對(duì)照組培養(yǎng)板上,每組設(shè)3個(gè)平行,每12 h測(cè)定線蟲(chóng)存活率。

1.2.4 膠孢炭疽菌對(duì)線蟲(chóng)體長(zhǎng)大小影響的測(cè)定

約100條L1期線蟲(chóng)置于對(duì)照組和處理組各培養(yǎng)板上,分別在12、24、36、48和60 h等5個(gè)時(shí)間點(diǎn),隨機(jī)挑取15條線蟲(chóng),適量10%福爾馬林固定后,進(jìn)行顯微鏡形態(tài)觀察和體長(zhǎng)大小的測(cè)量[13]。

1.2.5 膠孢炭疽菌對(duì)線蟲(chóng)繁殖能力影響的測(cè)定

線蟲(chóng)繁殖能力通過(guò)所產(chǎn)后代數(shù)目評(píng)價(jià)[13]。L1期線蟲(chóng)在NGM板25 ℃下培養(yǎng)至L4末期,挑取一只L4末期線蟲(chóng)放入新鮮處理板和對(duì)照板,每組處理設(shè)3個(gè)平行,48 h后統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)后代數(shù)目[15]。

1.2.6 膠孢炭疽菌對(duì)線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力影響的測(cè)定

將約50條L1期線蟲(chóng)分別接至處理組和對(duì)照組平板,25 ℃培養(yǎng)48 h,測(cè)定1 min內(nèi)線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)次數(shù)和身體彎曲次數(shù),每組處理測(cè)定15條線蟲(chóng)[16]。

1.2.7 膠孢炭疽菌對(duì)線蟲(chóng)咽泵速率影響的測(cè)定

將L1期幼蟲(chóng)在處理板和對(duì)照板上培養(yǎng),分別在48、72和96 h統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)每分鐘咽泵活動(dòng)次數(shù),每組處理測(cè)定15條線蟲(chóng)[17]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用 GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用t檢驗(yàn)法分析組間差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌-蟲(chóng)共培養(yǎng)體系的建立

2.1.1 NGM-PDA雙層培養(yǎng)板

無(wú)論P(yáng)DA處于上層還是下層,膠孢炭疽菌菌絲均生長(zhǎng)迅速,PDA位于上層,36 h時(shí)菌絲密布全板[圖1(a)];PDA位于下層,菌絲在48 h時(shí)覆蓋全板[圖1(b)],菌絲密度均過(guò)大,難以觀察線蟲(chóng)。

2.1.2 NGM+PDA混合板

在NGM中加入不同濃度PDA(1/50、1/30、1/20)后,膠孢炭疽菌均處于快速生長(zhǎng)狀態(tài),且PDA含量越高,菌絲生長(zhǎng)越茂密[圖1(c)～(e)],從而對(duì)線蟲(chóng)觀察造成干擾。

2.1.3 NGM板

膠孢炭疽菌在NGM板上生長(zhǎng)緩慢,產(chǎn)生的菌絲對(duì)線蟲(chóng)觀察干擾最小[圖1(f)]。因而,膠孢炭疽菌感染秀麗隱桿線蟲(chóng)的培養(yǎng)體系采用NGM培養(yǎng)基。

2.2 膠孢炭疽菌對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)存活率的影響

線蟲(chóng)與膠孢炭疽菌孢子共培養(yǎng),與對(duì)照組相比,其存活率顯著下降(P<0.05)。48 h后處理組L1期和L4期線蟲(chóng)開(kāi)始死亡,存活率下降。不同蟲(chóng)齡線蟲(chóng)接觸膠孢炭疽菌孢子后半數(shù)致死時(shí)間呈現(xiàn)不同,L1期為108 h[圖2(a)],L4期則為144 h[圖2(b)],表明L1期線蟲(chóng)更易受膠孢炭疽菌感染。此外,在處理組部分死亡的線蟲(chóng)體內(nèi)可顯微觀察到蟲(chóng)體周圍有菌絲破壞蟲(chóng)體表皮的現(xiàn)象[圖2(c)和(d)],有20%的線蟲(chóng)有菌絲形成。

(a)和(b)膠孢炭疽菌侵染L1期、L4期線蟲(chóng)的生存曲線; (c)和(d)菌絲從線蟲(chóng)表皮穿出。

2.3 膠孢炭疽菌孢子濃度對(duì)線蟲(chóng)存活率的影響

分別設(shè)置104～106孢子/mL的孢子菌懸液進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明,對(duì)照組中3個(gè)濃度的滅活孢子沒(méi)有顯著差異。與對(duì)照組比,處理組104孢子/mL的炭疽菌侵染線蟲(chóng)后,線蟲(chóng)存活率無(wú)顯著差異(P>0.05);而105、106孢子/mL的炭疽菌侵染線蟲(chóng)后,線蟲(chóng)存活率顯著下降(P<0.05)。從圖3還可以得出,線蟲(chóng)在104～106孢子/mL的孢子菌懸液的半數(shù)致死時(shí)間分別為156、132和108 h,表明線蟲(chóng)的半數(shù)致死時(shí)間與孢子濃度有關(guān)。并且膠孢炭疽菌孢子濃度與線蟲(chóng)存活率呈負(fù)相關(guān)性,孢子濃度越大,線蟲(chóng)存活率越低。

圖3 膠孢炭疽菌孢子濃度對(duì)線蟲(chóng)存活率的影響

2.4 膠孢炭疽菌對(duì)線蟲(chóng)體長(zhǎng)大小的影響

如圖4所示,線蟲(chóng)與膠孢炭疽菌共培養(yǎng)36 h后,處理組線蟲(chóng)的體長(zhǎng)明顯小于對(duì)照組(P<0.05)。表明膠孢炭疽菌可顯著影響線蟲(chóng)身體發(fā)育過(guò)程,從而影響蟲(chóng)體大小。

* 為兩組線蟲(chóng)顯著相關(guān)(P<0.05)。

2.5 膠孢炭疽菌對(duì)線蟲(chóng)繁殖能力的影響

后代數(shù)目是評(píng)價(jià)線蟲(chóng)繁殖能力的重要指標(biāo),如圖5所示,與膠孢炭疽菌共培養(yǎng)后,對(duì)照組統(tǒng)計(jì)后代幼蟲(chóng)約110個(gè),而處理組則約50個(gè),線蟲(chóng)后代數(shù)目顯著下降(P<0.01),表明膠孢炭疽菌顯著影響線蟲(chóng)的繁殖能力。

** 表示兩組線蟲(chóng)極顯著相關(guān)(P<0.01)。

2.6 膠孢炭疽菌對(duì)線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的影響

如表1所示,與對(duì)照組相比,線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率和身體彎曲頻率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),表明膠孢炭疽菌對(duì)線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力并未產(chǎn)生影響。

表1 兩組線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力比較次/min)

2.7 膠孢炭疽菌對(duì)線蟲(chóng)咽泵速率的影響

線蟲(chóng)的咽泵速率與其攝食狀況密切相關(guān)[18],是反映其進(jìn)食能力的重要指標(biāo)。如表2所示,與對(duì)照組相比,經(jīng)與膠孢炭疽菌共培養(yǎng)后,線蟲(chóng)咽泵速率未發(fā)生明顯改變(P>0.05),表明膠孢炭疽菌并未對(duì)線蟲(chóng)的攝食行為造成顯著影響。

表2 兩組線蟲(chóng)咽泵速率比較次/min)

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明,膠孢炭疽菌孢子對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)存活率、繁殖能力、體長(zhǎng)大小均產(chǎn)生顯著影響,而對(duì)線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力和咽泵速率無(wú)明顯改變。膠孢炭疽菌可導(dǎo)致線蟲(chóng)存活率顯著下降,且該菌對(duì)線蟲(chóng)的傷害與線蟲(chóng)的蟲(chóng)齡密切相關(guān),于L1期接觸孢子的線蟲(chóng),死亡速度明顯快于L4期才接觸孢子的線蟲(chóng),原因與線蟲(chóng)天然免疫系統(tǒng)發(fā)育的完善程度相關(guān),蟲(chóng)齡越小其免疫系統(tǒng)發(fā)育越不完善,對(duì)逆境的抵抗力較弱,而進(jìn)入L4期,線蟲(chóng)天然免疫系統(tǒng)基本發(fā)育完善,因而對(duì)膠孢炭疽菌產(chǎn)生一定的抗性,這與Guo等[19]和盧偉偉等[20]的研究結(jié)果一致。膠孢炭疽菌孢子濃度與秀麗隱桿線蟲(chóng)存活率呈負(fù)相關(guān)性,孢子密度越高對(duì)線蟲(chóng)產(chǎn)生的傷害越大,這與膠孢炭疽菌菌絲生長(zhǎng)密度及代謝產(chǎn)物濃度相關(guān)。此外,經(jīng)顯微觀察發(fā)現(xiàn),部分死亡蟲(chóng)體周圍有菌絲破壞蟲(chóng)體表皮的現(xiàn)象,這與馬爾尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)、白色念珠菌(Candidaalbicans)和一種新發(fā)現(xiàn)的卵菌Myzocytiopsishumicola感染線蟲(chóng)后的現(xiàn)象相似[21-23]。除存活率外,在菌-蟲(chóng)共培養(yǎng)體系中,線蟲(chóng)的體長(zhǎng)大小顯著縮短,表明膠孢炭疽菌對(duì)線蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生顯著影響;該菌同時(shí)也明顯降低線蟲(chóng)的繁殖能力。由此可見(jiàn),作為典型的植物病原菌,膠孢炭疽菌也可在多個(gè)方面對(duì)線蟲(chóng)造成傷害,呈現(xiàn)出一定的致病作用,而該傷害究竟是由菌絲產(chǎn)生的機(jī)械性損傷還是菌體生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝物的毒性導(dǎo)致,亦或者為二者共同作用的結(jié)果,特別是植物病原菌產(chǎn)生的毒素對(duì)低等無(wú)脊椎動(dòng)物線蟲(chóng)產(chǎn)生危害的生物防治方法和線蟲(chóng)的天然免疫及相互關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

在植物中,膠孢炭疽菌感染油茶可引起落葉、落果、枝梢枯死,甚至造成整株、整片衰亡[24]。這與膠孢炭疽菌引起線蟲(chóng)死亡率上升及繁殖能力下降的現(xiàn)象具有一定的相似性?？梢?jiàn),膠孢炭疽菌可跨越自然植物寄主對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的基本生物學(xué)特性產(chǎn)生顯著影響,且不同蟲(chóng)齡響應(yīng)膠孢炭疽菌傷害的差異表明線蟲(chóng)的天然免疫在其中發(fā)揮著重要作用。因而該菌-蟲(chóng)共培養(yǎng)體系可能成為探索動(dòng)物和植物天然免疫系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系以及尋找天然免疫中最古老和保守部分的理想工具,由此可進(jìn)一步探索防治此類病害的廣譜性作用靶點(diǎn)。