徐蒙，李首綱，董雨豪，劉永杰

(南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)廣泛分布于水體環(huán)境，是引起魚類出血性敗血癥的主要病原，同時也是危害兩棲類、爬行類以及哺乳類動物的重要病原。隨著水產養(yǎng)殖業(yè)集約化和規(guī)?；潭鹊脑黾?，該病害的持續(xù)發(fā)生，給我國的水產養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失[1- 2]。近年來，由嗜水氣單胞菌引起的食物中毒、感染性腹瀉以及繼發(fā)感染等頻繁發(fā)生，世界衛(wèi)生組織將其列入飲用水病原體的檢測范圍，其致病作用已成為公共衛(wèi)生所關注的重要問題[3-4]。

碳代謝是細菌最基礎的代謝之一。碳源的獲取對于病原菌在體內外環(huán)境中的生存尤為重要，不僅能為病原菌的生命活動提供能量，而且能為其生長提供物質基礎[5-7]。病原菌可利用宿主內多種碳源，但由于特定棲居位點共存的其他微生物競爭，迫使入侵的病原菌通過基因水平轉移獲得新的代謝能力，最大限度地獲取一切可利用的營養(yǎng)物質，以積極適應宿主體內的環(huán)境條件 (如低pH值、強氧化等)，并提高其在宿主體內的生存能力。前期研究證實，在嗜水氣單胞菌ST251型菌株中均存在一個特有的肌醇代謝基因簇，位于由基因水平轉移所獲得的基因島上，由12個基因組成[8]。李首綱等[9]已證實，肌醇代謝途徑的阻斷會嚴重降低嗜水氣單胞菌NJ-35在鯽魚體內的定殖能力以及對斑馬魚的致病力，推測肌醇代謝可能是決定嗜水氣單胞菌毒力增強的關鍵因素。

IolR是調控肌醇代謝通路的一個重要的負調控因子。前期研究發(fā)現(xiàn)IolR不僅參與肌醇的代謝，還參與葡萄糖對肌醇代謝基因簇的轉錄抑制作用[10]，推測IolR在不同碳源代謝方面發(fā)揮重要作用。本研究在前期工作的基礎上，測定ΔiolR缺失株對不同碳源的代謝能力，并且對ΔiolR缺失株的耐酸、耐氧化、耐高滲、抗吞噬以及耐藥能力進行測定，探究IolR對嗜水氣單胞菌碳源代謝以及環(huán)境適應性的影響，為進一步揭示IolR對嗜水氣單胞菌環(huán)境適應性的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與細胞

嗜水氣單胞菌NJ-35(氨芐青霉素抗性，Ampr)(GenBank登錄號：CP006870)、缺失株ΔiolR(Ampr)、互補株CΔiolR(Ampr)由本實驗室鑒定保存。小鼠巨噬細胞RAW264.7購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM限制性培養(yǎng)基購自Meilunbio公司，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖過氧化氫酶、藥敏片、Triton X-100、CytoTox 96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay 均購自北京鼎國生物技術有限公司，氨芐青霉素購自Invitrogen公司，DMEM購自Gibco公司。

恒溫搖床和恒溫培養(yǎng)箱均為Thermo公司產品，微型離心機為Eppendorf公司產品，紫外分光光度計為Bio-Rad公司產品。

1.3 生長曲線測定

將野生株、ΔiolR和CΔiolR培養(yǎng)至對數(shù)期，調整各菌株濃度至OD600=1.0，按1∶100(體積比)轉接至含不同碳源(終濃度為1%的葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖)的DMEM限制性培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)，每間隔1 h用分光光度計測量OD600值，繪制生長曲線。

1.4 抗氧化應激能力檢測

分別挑取野生株、ΔiolR和CΔiolR單菌落于Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)，待液體渾濁后轉接至新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，5 000g離心5 min，棄上清液，用無菌PBS緩沖液3次，調節(jié)細菌濃度至OD600=0.1。加入H2O2至終濃度為2 mmol/L，吹打混勻，在28 ℃孵育1 h，加入2 000 U過氧化氫酶作用10 min終止氧化。用PBS進行10倍比稀釋，取100 μL稀釋液涂布含Amp (100 μg/mL)抗性的LB平板上，28 ℃培養(yǎng)16 h，選取菌落數(shù)在30～300個之間的平板進行菌落計數(shù)。

1.5 耐酸能力檢測

將野生株、ΔiolR和CΔiolR培養(yǎng)至對數(shù)期，5 000g離心5 min，棄上清液，用pH值 5.0 的LB培養(yǎng)液重懸菌體，調節(jié)OD600=0.1，置于28 ℃ 搖床孵育30 min。PBS進行10×倍比稀釋，取100 μL作用的稀釋液涂布含Amp抗性的LB平板上，28 ℃溫箱過夜培養(yǎng)，選取菌落數(shù)在30～300個之間的平板進行菌落計數(shù)，并計算存活率。

1.6 抗高滲透壓能力檢測

將野生株、ΔiolR和CΔiolR培養(yǎng)至對數(shù)期，5 000g離心后棄上清液，用氯化鈉終濃度為0.2 mol/L的LB培養(yǎng)基重懸菌體并調整OD600=1[11]。向24孔細胞板每孔中加入1 mL上述培養(yǎng)液，按照1∶100(體積比)加入菌液，每株菌設置3個樣品重復，每間隔1 h測量1次OD600值，繪制生長曲線。

1.7 抗吞噬能力檢測

將野生株、ΔiolR和 CΔiolR培養(yǎng)至生長對數(shù)期，用PBS緩沖液洗滌3次，重懸于DMEM培養(yǎng)基中，以感染比(multiplicity of infection，MOI)為1∶1接種至形成單層的 RAW264.7細胞中，800g離心細胞板10 min。將細胞板置于28 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，用無菌PBS緩沖液洗滌5次，加入含有100 μg/mL慶大霉素的DMEM，置于28 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，用無菌PBS緩沖液洗滌5次，然后加入1 mL Triton X-100(濃度為0.1%)，室溫裂解細胞10 min，吹打混勻，10倍比梯度稀釋后涂LB固體平板，28 ℃培養(yǎng)18 h后，取菌落數(shù)在30～300個之間的平板進行計數(shù)。

1.8 細胞毒性檢測

采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測定細菌對 RAW264.7的細胞毒性。試驗參考CytoTox 96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega)試劑盒說明書，并根據(jù)Erova等[12]的方法進行適當修改。細胞培養(yǎng)如前所述，試驗在96孔細胞培養(yǎng)板中進行，共設置以下6個試驗組：①細菌感染細胞后LDH釋放組：以MOI=1∶1的比例加入制備的細菌懸液，每孔50 μL；②細胞LDH最大釋放組：每個細胞孔中加入50 μL DMEM培養(yǎng)基；③細胞LDH自發(fā)釋放組：每個細胞孔中加入50 μL DMEM培養(yǎng)基；④細菌LDH自發(fā)釋放組：每個空白孔加入中50 μL DMEM培養(yǎng)基以及50 μL細菌懸液；⑤體積校正組：每個空白孔中加入100 μL DMEM培養(yǎng)基；⑥培養(yǎng)基背景對照組：每個空白孔中加入100 μL DMEM培養(yǎng)基。將所有試驗組處理完后，25 ℃、800g離心細胞培養(yǎng)板10 min，將細胞培養(yǎng)板置于28 ℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)3 h，在培養(yǎng)結束前45 min，將10 μL裂解液加入到細胞LDH最大釋放組和體積校正組中。800g離心10 min，每孔取出50 μL培養(yǎng)上清液至新的96孔細胞板中，每孔加入50 μL配制好的底物，室溫避光孵育30 min。每孔中加入50 μL終止液，測定每孔液體的OD490值。按照公示計算細胞毒性：

細胞毒性=[(細菌感染組-細菌自發(fā)釋放組-細胞自發(fā)釋放組)OD值/(細胞最大釋放組-細胞自發(fā)釋放組)OD值]×100。

1.9 藥敏試驗

將細菌培養(yǎng)至對數(shù)期，調節(jié)至OD600=0.1。取200 μL菌液均勻涂布于LB瓊脂平板，用無菌鑷子夾取藥敏紙片貼在平皿表面并輕輕按壓。28 ℃溫箱培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。質控菌株為嗜水氣單胞菌ATCC 7966。

1.10 統(tǒng)計分析

GraphPad Prism 8.3.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理，使用t檢驗進行差異顯著性分析。當P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 在不同碳源限制性培養(yǎng)基中生長能力檢測

通過測定ΔiolR缺失株在不同碳源限制性培養(yǎng)基中的生長情況來評估IolR對不同碳源的代謝能力的影響。如圖1所示，ΔiolR缺失株在以葡萄糖(圖1A)、果糖(圖1B)、甘露糖(圖1C)和半乳糖(圖1D)為單一碳源的培養(yǎng)基中生長速度均顯著降低，表明IolR有利于葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖的代謝。

A. 葡萄糖為碳源；B. 果糖為碳源；C. 甘露糖為碳源；D. 半乳糖為碳源

2.2 iolR缺失對細菌環(huán)境適應性的影響

2.2.1 耐氧化應激能力

在LB培養(yǎng)基中添加終濃度為2 mmol/L的 H2O2，模擬強氧化條件進行測定。 結果如圖2A所示，與野生株相比，ΔiolR缺失株的存活率降低58.98%(P<0.001)，且CΔiolR互補株的存活率恢復至野生株水平。表明IolR有利于嗜水氣單胞菌的耐氧化應激能力。

A. 耐氧化應激能力；B. 耐酸能力；C. 耐高滲透壓能力；

2.2.2 耐酸能力

采用LB培養(yǎng)基(pH=5)，模擬酸性環(huán)境進行測定。結果如圖2B所示，ΔiolR缺失株的存活率顯著低于野生株(P<0.05)，且CΔiolR互補株的耐酸能力恢復至野生株水平，說明IolR有利于嗜水氣單胞菌的耐酸能力。

2.2.3 耐高滲透壓能力

采用高滲透壓條件(0.2 mol/L NaCl)培養(yǎng)野生株、ΔiolR和CΔiolR，觀察生長情況。如圖2C所示，在正常滲透壓條件下，野生株和ΔiolR的生長速度基本一致；在高滲環(huán)境下，ΔiolR缺失株的生長速度略快于野生株(P<0.05)。說明IolR負向調控嗜水氣單胞菌的耐高滲透壓能力。

2.3 iolR缺失對細菌抗吞噬能力的影響

如圖3所示，RAW264.7巨噬細胞對ΔiolR缺失株的吞噬率顯著高于野生株，并且ΔiolR缺失株對巨噬細胞的毒性顯著降低，表明IolR不僅有助于細菌抵抗巨噬細胞的吞噬作用，還可以增強嗜水氣單胞菌對巨噬細胞的毒性作用。

圖3 野生株、ΔiolR和CΔiolR的抗吞噬能力(A)及細胞毒性(B)

2.4 藥物敏感性檢測

藥敏試驗結果見圖4。由圖4可以看出，ΔiolR缺失株對慶大霉素、妥布霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟的敏感性顯著強于野生株(P<0.001，圖4A、圖4B、圖4C、圖4D)，而對青霉素、恩諾沙星、復方新諾明、羅紅霉素、諾氟沙星、萬古霉素6種抗生素的敏感性均未改變(P<0.05)，見圖4E、圖4F、圖4G、圖4H、圖4I、圖4J，CΔiolR互補株的抗性均能恢復至野生水平，表明IolR的存在有助于嗜水氣單胞菌抵抗慶大霉素、妥布霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟4種抗生素的殺傷作用。

圖4 野生株、ΔiolR和CΔiolR的藥物敏感性

3 討論

由于環(huán)境中的營養(yǎng)限制以及在宿主體內的營養(yǎng)競爭壓力，迫使病原菌獲得特定的代謝能力，進而克服營養(yǎng)限制。越來越多的證據(jù)表明，病原體已經開發(fā)出特定的肌醇代謝策略來克服這些限制，從而增強其在不同環(huán)境中的適應能力[13-14]。

前期研究發(fā)現(xiàn)在嗜水氣單胞菌ST251型菌株中鑒定到一個特有的肌醇代謝基因簇，可用于肌醇的代謝[8]。肌醇是一種多元醇，廣泛存在于機體的各種組織中，是維持機體正常生理功能必不可少的低分子有機物[15]。在水產養(yǎng)殖中，肌醇常作為營養(yǎng)促生長劑添加在飼料中，以提高飼料的利用率，降低魚類的餌料系數(shù)，加快其生長速度[16]。IolR是調控肌醇代謝通路的一種重要的負調控因子，廣泛存在于谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)[17]、沙門菌(Salmonella)[18]、產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)[19]、嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)[14]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[13]以及豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)[20]中。IolR屬于RpiR家族成員，該家族轉錄因子通常參與多種碳源的代謝。碳代謝是細菌最基本的代謝之一，碳源獲取對于病原菌適應宿主體內的環(huán)境條件 (如pH值、滲透壓等)，提高其在宿主體內的生存能力尤為重要。本研究結果顯示，IolR有利于嗜水氣單胞菌對葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等宿主體內常見碳源的利用。然而，Zhou等[17]研究表明，IolR的缺失可上調谷氨酸棒桿菌的葡萄糖激酶ppgk基因和glk基因表達，從而促進葡萄糖的利用。有研究表明IolR可以通過激活劑或抑制劑雙重身份參與靶基因的調控。例如，在谷氨酸棒狀桿菌中，IolR既可作為肌醇代謝基因的抑制因子參與肌醇的利用，也可作為pck基因的激活因子參與糖酵解過程[21]。因此，推測IolR可能通過直接調控糖代謝相關基因的表達，從而參與嗜水氣單胞菌對葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖的利用。

除了獲取營養(yǎng)物質外，病原菌在感染過程中還要應對宿主體內高滲透壓、強酸等不利環(huán)境的刺激。Zhu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，RpiR家族調控因子RpiRc的缺失可降低金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)對過氧化氫的敏感性。本研究對嗜水氣單胞菌在高滲透壓、強氧化以及強酸等環(huán)境的生存能力進行檢測，結果顯示iolR缺失后，嗜水氣單胞菌的耐酸能力和抗氧化能力均顯著下降，而耐滲透壓能力略有增強，表明IolR在調控嗜水氣單胞菌對不同脅迫環(huán)境的適應能力方面發(fā)揮重要作用。嗜水氣單胞菌對酸性應激和氧化應激的耐受能力，對于其抵抗巨噬細胞的吞噬具有重要意義。Ma等[23]研究發(fā)現(xiàn)，RpiR家族調控因子AsiR的缺失可導致鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)在巨噬細胞中的存活能力增強。本試驗檢測了野生株、ΔiolR缺失株和互補株的抗巨噬細胞吞噬能力以及對巨噬細胞的毒性作用，結果顯示，巨噬細胞對ΔiolR缺失株的吞噬能力顯著增強，且其對巨噬細胞的毒力顯著降低，表明IolR不僅有助于嗜水氣單胞菌抵抗巨噬細胞的吞噬作用，還可增強其對巨噬細胞的毒性作用。另外，通過差異轉錄組學分析發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，ΔiolR缺失株的耐酸、耐氧化以及抗吞噬相關基因的轉錄水平均顯著下調(待發(fā)表)，推測IolR可能直接參與耐酸、耐氧化以及抗吞噬相關基因的表達，但其具體作用機制有待進一步研究。

由于抗生素的濫用，水體環(huán)境已經成為自然環(huán)境中抗生素殘留的主要載體之一，這就導致細菌長期暴露在低濃度的抗生素環(huán)境中，對細菌在水體環(huán)境中的生存造成極大威脅。本研究對水體環(huán)境中殘留量較多的10種抗生素進行藥敏分析，結果表明IolR有助于嗜水氣單胞菌抵抗頭孢噻肟、頭孢曲松、妥布霉素、慶大霉素等4種抗生素的殺傷。細菌常見的耐藥機制主要包括藥物結合靶點突變、外排泵系統(tǒng)以及質粒介導的耐藥基因水平轉移等。差異轉錄組學分析發(fā)現(xiàn)，IolR的缺失可導致嗜水氣單胞菌耐藥相關基因的轉錄下調，并且凝膠遷移試驗(EMSA)結果證實，IolR可以直接結合外排泵基因的啟動子區(qū)域(待發(fā)表)，推測IolR可能直接調控外排泵基因的表達，從而降低藥物的外排。

目前，對于IolR功能的研究主要集中在其作為負調控因子參與肌醇代謝。然而，本研究結果證實，IolR轉錄調控因子參與嗜水氣單胞菌的耐酸、耐氧化、耐藥、抗巨噬細胞吞噬以及碳源利用等重要生物學過程，表明該調控因子在嗜水氣單胞菌的生存及環(huán)境適應性方面發(fā)揮重要作用。