許晴雨，夏蘇干，蔡國棟，鄒輝，顧建紅，袁燕，劉學(xué)忠，劉宗平，卞建春*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

霉菌毒素主要是指霉菌在其污染的飼料和食品中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界上每年大約有20%～25%的谷物遭受多種霉菌的污染，尤以高溫高濕的季節(jié)和地區(qū)受污染最為嚴(yán)重[1]。動物食用霉菌毒素污染的飼料后會產(chǎn)生一系列的不良反應(yīng)，如免疫抑制、采食量降低、不孕流產(chǎn)等[2-3]。玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)在我國飼料中較為常見，是影響我國養(yǎng)殖業(yè)的主要霉菌毒素，近年來二者污染呈上升趨勢[4]，而且它們常常是同時存在于被污染飼料及其產(chǎn)品中。研究顯示，ZEA和DON中毒皆能產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫毒性[5-6]，但相關(guān)研究采取的毒素作用劑量常較大[7-8]，且多以研究單一毒素的中毒較為多見，而研究二者的聯(lián)合作用下對機(jī)體影響的研究相對較少[9-10]。

李斯特菌(Listeria)是環(huán)境和飼料中常見的病原微生物，免疫功能正常的動物對這些細(xì)菌的入侵具有一定的抵御能力。動物感染李斯特菌后，體內(nèi)免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平將發(fā)生變化，進(jìn)一步誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[11]?？梢栽O(shè)想，如果動物在受到ZEA、DON等霉菌毒素影響的前提下再遭遇李斯特菌等病菌威脅，情況會變得復(fù)雜。因此，搞清ZEA、DON及其聯(lián)合作用背景下動物對李斯特菌等細(xì)菌感染防御能力的影響及其機(jī)制顯得尤為重要和迫切。細(xì)胞因子是一類小分子多肽因子，由各種免疫細(xì)胞合成、分泌，在免疫系統(tǒng)中起調(diào)控作用[12]。為此，本試驗(yàn)應(yīng)用抗體芯片技術(shù)，研究了低劑量的ZEA、DON及其聯(lián)合作用下李斯特菌誘導(dǎo)的血清中多種白介素、集落刺激因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白表達(dá)水平，以揭示ZEA、DON及其聯(lián)合作用對細(xì)菌感染動物防御能力的影響及其機(jī)制，為更全面地認(rèn)識ZEA與DON免疫毒性的特征及其防控研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑

SPF級 C57BL/ 6小鼠，雌性，6～8周齡，體重(20±2)g，購自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。所有涉及動物的試驗(yàn)(包括安樂死)均經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)動物保護(hù)與利用委員會批準(zhǔn)，ID：SYXK(SU)2017-0044。

李斯特菌參考菌株(EGD 編號BAA-679，血清型1/2b)由浙江大學(xué)方維煥教授饋贈。ZEA、DON購自美國 Sigma公司。小鼠炎癥抗體陣列G1系列(AAM-INF-G1)試劑盒購自廣州瑞博奧生物科技有限公司。

1.2 動物分組與處理

將 90只 C57 BL/ 6小鼠隨機(jī)均分為5組，分別為對照組(Con)、李斯特菌組(Lis)、ZEA+Lis組、DON+Lis組、ZEA+DON+Lis組。小鼠置于聚丙烯籠中飼養(yǎng)，每籠 3只?；\子放置在通風(fēng)架上，均設(shè)獨(dú)立的空氣循環(huán)系統(tǒng)，無化學(xué)污染和病原體污染。溫度為 (22±2)℃，濕度為 (55±15)%，每日自8：00至20：00照明12 h。每千克體重灌胃劑量為：ZEA=10 mg，DON=1 mg，ZEA+DON聯(lián)合=10 mg ZEA+1 mg DON。

先對ZEA組、DON組和 ZEA+DON組小鼠用對應(yīng)劑量毒素進(jìn)行連續(xù)7 d的灌胃處理。Con組和Lis組用相同容積的雙蒸水灌胃。于第 8天通過尾靜脈注射 5×104CFU的李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株以建立小鼠感染模型，Con組注射生理鹽水，感染期間持續(xù)對小鼠進(jìn)行毒素灌胃。在感染第7天時將小鼠麻醉進(jìn)行心臟采血，后脫頸椎處死。

1.3 抗體芯片對血清樣本的檢測

根據(jù)試劑盒說明書的方法，將玻片芯片室溫平衡20～30 min，然后將芯片室溫干燥2 h。 每個芯片孔中加入100 μL的1×封閉液，室溫?fù)u床上孵育1 h，避免產(chǎn)生氣泡；1 h后抽去封閉液，每個孔中添加100 μL樣品(血清2倍稀釋上樣)，一個陣列一個樣品(4 ℃振蕩過夜孵育)。使用Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板機(jī)清洗玻片，先用1×洗液Ⅰ進(jìn)行清洗，每孔250 μL的1×洗液Ⅰ，清洗10次，每次震蕩10 s，震蕩選擇高強(qiáng)度，用去離子水稀釋20×洗液Ⅰ。后換用1×洗液Ⅱ通道進(jìn)行清洗，每孔250 μL的1×洗液Ⅱ，清洗6次，每次震蕩10 s，震蕩選擇高強(qiáng)度，用去離子水稀釋20×洗液Ⅱ。每孔加入70 μL生物素標(biāo)記抗體；室溫孵育2 h后再次清洗，方法同上。每孔加入70 μL的1 500倍稀釋的熒光劑-鏈霉親和素，用密封條貼住玻片，然后用鋁箔紙包住玻片避光4 ℃過夜孵育。再次清洗，方法同上。

將玻片框架拆掉，小心不要用手接觸到玻片印制抗體的一面。使用InnoScan 300，采用Cy3通道，激發(fā)頻率=532 nm。熒光檢測白細(xì)胞介素IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-17、IL-10、IL-3、IL-13、IL-4、IL-9、IL-12p40/p70、IL-2，基質(zhì)金屬蛋白酶TIMP-1、TIMP-2，趨化因子KC、LIX、MIG、BLC，集落刺激因子GCSF、MCSF、GM-CSF等40種免疫相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平。采用芯片分析軟件提取數(shù)據(jù)，采用AAM-INF-G1的數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)以 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用 Grahpad Prism 8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用配對t檢驗(yàn)，P<0.05有差異且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白細(xì)胞介素表達(dá)水平變化

各試驗(yàn)組白細(xì)胞介素的表達(dá)水平見圖1。與Con組相比，Lis組IL-1β與IL-12P40/P70顯著升高(P<0.05)。與Lis組相比，ZEA+Lis、DON+Lis組和ZEA+DON+Lis組的IL-1β顯著下降(P<0.05)；DON+Lis組和ZEA+DON+Lis組IL-12P40/P70顯著下降(P<0.05)。與ZEA+Lis處理組相比，ZEA+DON+Lis組IL-6顯著上升(P<0.05)。與DON+Lis處理組相比，ZEA+DON+Lis組白介素均無顯著差異(P>0.05)。

與空白組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與Lis組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01；與ZEA+DON+Lis組相比，^表示P<0.05，^^表示P<0.01。下同

2.2 集落刺激因子表達(dá)水平變化

各試驗(yàn)組集落刺激因子的表達(dá)水平見圖2。與Con組相比，Lis組GM-CSF顯著下降(P<0.05)，MCSF顯著升高(P<0.05)。與Lis組相比，ZEA+Lis處理組集落刺激因子均無顯著差異(P>0.05)；DON+Lis處理組MCSF顯著下降(P<0.05)；ZEA+DON+Lis組GCSF顯著升高(P<0.05)。與ZEA+Lis處理組相比，ZEA+DON+Lis組集落刺激因子均無顯著差異(P>0.05)。與DON+Lis處理組相比，ZEA+DON+Lis組GCSF顯著升高(P<0.05)，MCSF極顯著升高(P<0.01)。

2.3 趨化因子表達(dá)水平變化

各試驗(yàn)組趨化因子的表達(dá)水平見圖3和圖4。由圖可知，與Con組相比，Lis組MIG顯著升高(P<0.05)。與Lis組相比，ZEA+Lis處理組趨化因子均無顯著差異(P>0.05)；DON+Lis組和ZEA+DON+Lis組BLC顯著升高(P<0.05)；ZEA+DON+Lis組MIG極顯著升高(P<0.01)。與ZEA+Lis處理組相比，ZEA+DON+Lis組MIG與MIP-1α顯著升高(P<0.05)，LIX顯著下降(P<0.05)。與DON+Lis處理組相比，ZEA+DON+Lis組MIP-1α極顯著升高(P<0.01)。

圖3 ZEA、DON及其聯(lián)合作用對李斯特菌感染小鼠血清的趨化因子1含量的影響

2.4 基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)水平變化

各試驗(yàn)組基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)水平見圖5。由圖5可知，與Con組相比，Lis組基質(zhì)金屬蛋白酶均無顯著差異(P>0.05)。與Lis組相比，ZEA+Lis組、DON+Lis組和ZEA+DON+Lis組TIMP-1均顯著升高(P<0.05)。與ZEA+Lis處理組相比，ZEA+DON+Lis組TIMP-1顯著升高(P<0.05)。與DON+Lis處理組相比，ZEA+DON+Lis組MIP-1α基質(zhì)金屬蛋白酶均無顯著差異(P>0.05)。

圖5 ZEA、DON及其聯(lián)合作用對李斯特菌感染小鼠血清的基質(zhì)金屬蛋白酶含量的影響

3 討論

研究表明，ZEA與DON都會影響動物的免疫細(xì)胞和基本免疫功能[13-14]。攝入一定量的ZEA時機(jī)體抵抗力會有所下降，脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，甚至部分會發(fā)生凋亡[15]。細(xì)胞因子能在細(xì)胞間傳遞信息，是具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽，為非特異性免疫效應(yīng)物質(zhì)。在機(jī)體受到某些外界或內(nèi)部刺激時，細(xì)胞因子的平衡便會被打破，從而激發(fā)一系列的免疫反應(yīng)[16-17]。Ren等[9，18]分別報道了DON和ZEA聯(lián)合染毒可降低小鼠血清IL-4和IFN-γ的濃度，但對血清中其他細(xì)胞因子特別是集落刺激因子和趨化因子等研究較少。另外，自然條件下霉菌毒素常常載飼料中混合存在，因此研究不同霉菌毒素的聯(lián)合毒性作用意義更大。不同霉菌毒素共同存在下的毒性情況不能簡單根據(jù)其各自的毒性來預(yù)測，它們之間可以有拮抗作用、相加作用或協(xié)同作用[19]。為此，本試驗(yàn)通過研究低劑量ZEA、DON及其聯(lián)合作用對李斯特菌感染小鼠血清免疫相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響，來更深入地探討ZEA及DON的免疫毒性。

李斯特菌的清除主要依賴于CD4+T細(xì)胞，很多細(xì)胞因子例如IL-4[20-21]會影響CD4+T細(xì)胞的活化，當(dāng)血清中的相關(guān)細(xì)胞因子受到抑制時，會使得CD4+T細(xì)胞活化受阻或功能造成破壞，機(jī)體對李斯特菌的免疫抵抗能力會急劇下降，動物會發(fā)生嚴(yán)重的感染甚至死亡[22]，造成一定的生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)損失。

抗體芯片技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)芯片技術(shù)的一種，其技術(shù)原理是有序的將各種抗體固定在濾膜、載玻片等載體上，利用抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)來捕捉樣本中待檢測的抗原，然后用標(biāo)記的有特定熒光物質(zhì)的抗體與芯片上對應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合，抗體上的熒光將指示對應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。該技術(shù)利用少量樣本可篩選多項(xiàng)指標(biāo)，具有微型化、集成化、高通量的特點(diǎn)，在研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常、蛋白質(zhì)組學(xué)、腫瘤標(biāo)志物、免疫和細(xì)胞周期調(diào)控等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。

白介素是白細(xì)胞或免疫細(xì)胞間相互作用的淋巴因子，它和血細(xì)胞生長因子同屬細(xì)胞因子。兩者相互協(xié)調(diào)，相互作用，共同完成造血和免疫調(diào)節(jié)功能。白介素在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。白介素IL-1β主要刺激機(jī)體B細(xì)胞分化生長以及刺激CD4+T細(xì)胞活化[23]；IL-12P40/P70促進(jìn)活化的T細(xì)胞增殖與CD56分子的表達(dá)；白介素IL-6會刺激機(jī)體內(nèi)T細(xì)胞增殖并發(fā)生CTL的活化[24]。本研究結(jié)果顯示，Lis組與Con組相比，血清中的IL-1β與IL-12P40/P70顯著升高；ZEA+Lis組與Lis組相比，IL-1β顯著下降；DON+Lis組與Lis組相比，IL-1β與IL-12P40/P70水平顯著下降；ZEA+DON+Lis組與Lis組相比，IL-1β，IL-12P40/P70顯著下降；ZEA+DON+Lis組與ZEA+Lis組相比，IL-6顯著上升；ZEA+DON+Lis組與DON+Lis組相比白介素?zé)o顯著差異。研究表明，低劑量的ZEA、DON單獨(dú)處理皆可導(dǎo)致白介素降低，引起機(jī)體的免疫抑制；而ZEA+DON+Lis組的處理與單獨(dú)的低劑量ZEA+Lis組相比所造成的的免疫抑制減少，而與低劑量DON+Lis相比無明顯差異。鐘昉等[25]研究由CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，用低劑量的ZEA+DON+Lis處理小鼠，T細(xì)胞活化信號CD44的表達(dá)顯著高于DON+Lis處理組，CD223的表達(dá)顯著高于ZEA+Lis處理組。本試驗(yàn)結(jié)果與之類似，證實(shí)了在低劑量的ZEA與DON聯(lián)合作用下造成的免疫抑制確實(shí)具有一定的拮抗作用。

集落刺激因子可刺激不同的造血干細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中形成細(xì)胞集落。集落刺激因子GM-CSF能夠刺激機(jī)體T細(xì)胞增殖，加強(qiáng)造血功能，誘導(dǎo)前體細(xì)胞增殖[26]。GCSF刺激造血細(xì)胞分化，活化。MCSF刺激機(jī)體破骨細(xì)胞的生成且可加強(qiáng)趨化活性和刺激吞噬。本研究結(jié)果顯示，Lis組與Con組相比，GM-CSF顯著下降，MCSF顯著上升；DON+Lis組與Lis組相比，MCSF顯著下降；ZEA+DON+Lis組與Lis組相比，GCSF顯著上升；ZEA+DON+Lis組與DON+Lis組相比，GCSF顯著上升，MCSF極顯著上升。結(jié)果表明低劑量的DON會引起機(jī)體造血功能的減退，而ZEA+DON+Lis組與單獨(dú)的低劑量的ZEA+Lis和DON+Lis處理組相比造血功能有所上升且加強(qiáng)了趨化活性，表明了ZEA+DON+Lis組對于免疫抑制存在一定的拮抗作用。

機(jī)體在防御和清除入侵病原體等異物時，趨化因子誘導(dǎo)附近反應(yīng)細(xì)胞定向趨化。趨化因子MIG(CXCL9)作用于TH1細(xì)胞，刺激CD4+T細(xì)胞的活化。LIX(CXCL5)刺激CD8+T細(xì)胞。BLC(CXCL13)主要誘導(dǎo)CD8+效應(yīng)記憶細(xì)胞[27-28]。MIP-1α(CCL3)作用于TH1和TH2細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，Lis組與Con組相比，MIG顯著上升；DON+Lis組與Lis組相比，BLC顯著上升；ZEA+DON+Lis組與Lis組相比，BLC顯著上升，MIG極顯著上升；ZEA+DON+Lis組與ZEA+Lis組相比，MIG與MIP-1α顯著上升，LIX顯著下降；ZEA+DON+Lis組與DON+Lis組相比，MIP-1α顯著上升。結(jié)果表明低劑量的ZEA、DON及其聯(lián)合皆可引起機(jī)體趨化因子激活定向遷移從而產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障?；|(zhì)金屬蛋白酶TIMP-1主要降解ECM，是活性最強(qiáng)的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑。在正常細(xì)胞中TIMP-1表達(dá)比例處于平衡狀態(tài)，對組織重建、血管形成等具有重要作用[29-30]。本研究結(jié)果顯示，ZEA+Lis組與DON+Lis組分別與Lis組相比TIMP-1水平皆顯著升高；ZEA+DON+Lis組與ZEA+Lis組相比，TIMP-1也顯著上升。結(jié)果表明低劑量的ZEA、DON及其聯(lián)合皆會引起機(jī)體發(fā)生重塑。

綜上所述，低劑量的ZEA、DON及其聯(lián)合對于李斯特菌感染小鼠的免疫有不同程度的抑制作用，從而降低小鼠對李斯特菌感染的抵抗能力。然而低劑量的ZEA和DON聯(lián)合使用對于小鼠的免疫抑制存在一定的拮抗作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。