胡閃閃，胡紅杰，徐艷萍，何靈芝，盧玉潔，黃伊芹，程明，李恭賀，司紅彬

(廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004)

肝臟對(duì)生命至關(guān)重要，是許多生理過(guò)程關(guān)鍵的樞紐，具有血容量調(diào)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)素代謝、免疫系統(tǒng)支持、脂質(zhì)和膽固醇穩(wěn)態(tài)、外源性化合物的分解等重要功能[1-2]。急性肝損傷是與高死亡率相關(guān)的一種嚴(yán)重綜合征，多是由于脂多糖(LPS)和醋氨酚(APAP)等藥物過(guò)量引起的[2]。過(guò)量藥物在肝臟的代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)，從而使谷胱甘肽還原酶(GSH)含量降低[3-4]，使肝臟產(chǎn)生大量的白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等促炎因子，這些促炎因子又可與炎性信號(hào)通路上的相關(guān)蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合，如與核轉(zhuǎn)錄因子p65(NF-κBp65)的特異性位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合，促使NF-κBp65磷酸化發(fā)生核轉(zhuǎn)移與DNA相應(yīng)結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游促炎因子轉(zhuǎn)錄，使炎性反應(yīng)不斷加強(qiáng)，炎性細(xì)胞因子不斷釋放導(dǎo)致細(xì)胞因子失衡和免疫功能障礙，進(jìn)而損害肝功能[5-9]，危及生命健康。

紫丁香苷從刺五加中提取，現(xiàn)有研究表明紫丁香苷具有抗癌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝臟、腎以及肺等藥理功能[10-12]。作用機(jī)制均與消除氧化自由基、提高抗氧化物酶的活性、抑制機(jī)體炎性信號(hào)通路的激活、炎性因子的產(chǎn)生有關(guān)[13-15]，但有關(guān)紫丁香苷保肝作用的機(jī)制研究目前較少。本研究旨在通過(guò)建立藥物性急性肝損傷模型，來(lái)探究紫丁香苷對(duì)于肝損傷小鼠的保護(hù)作用，并探究其發(fā)揮作用的潛在機(jī)制，為紫丁香苷的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

紫丁香苷(純度98%，成都埃法生物科技有限公司)；LPS、D-半乳糖胺鹽酸鹽(D-GalN)購(gòu)于阿拉丁；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、GSH、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)均購(gòu)于南京建成生物科技有限公司；鼠源IL-1β、IL-6、TNF-α、ELISA試劑盒購(gòu)于南京博研生物科技有限公司；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)于索萊寶；一抗(兔抗NF-κBp65)、二抗(山羊抗兔)，DAB顯色液均購(gòu)于賽維爾生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只SPF級(jí)昆明雄性小鼠，體重(22±2)g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，在清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)鼠房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，12 h晝夜循環(huán)，飲水清潔充足，每天給予新鮮鼠糧，平均4 g/只，室溫維持為(25±2)℃。

1.3 方法

1.3.1 分組與處理

隨機(jī)將40只小鼠分為4組，每組10只：對(duì)照組(NC)、模型組(LD)、紫丁香苷低劑量(LSY+LD)組、紫丁香苷高劑量(HSY+LD)組。低、高劑量紫丁香苷組每天以25 mg/kg、50 mg/kg劑量通過(guò)腹腔注射給藥，NC、LD組以同樣的方式注射等量的生理鹽水。在第3天腹腔給藥1 h后，LD組、LSY+LD組、HSY+LD組腹腔給予LPS/D-GalN(30 μg/kg+250 mg/kg)，NC組給予生理鹽水。LPS/D-GalN給藥6 h后，小鼠眼球靜脈采血，全血室溫靜置2 h后移置-4 ℃冰箱放置12 h，-4 ℃、3 000g離心機(jī)分離血清，分裝并保存于-80 ℃；采取組織肝臟，稱(chēng)重，并在無(wú)菌生理鹽水中快速?zèng)_洗，采取肝臟左側(cè)小葉放入4%甲醛中固定，剩余肝臟分割放入EP管中，置于-80 ℃保存，以備后用。

1.3.2 血清及肝臟生化指標(biāo)檢測(cè)

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中AST、ALT活性；肝臟組織中GSH水平，SOD、CAT活性。

1.3.3 ELISA法檢測(cè)肝臟組織炎癥因子水平

將相同質(zhì)量的肝組織進(jìn)行勻漿處理，并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)將勻漿進(jìn)行相同倍數(shù)的稀釋?zhuān)缓髾z測(cè)肝組織中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。

1.3.4 肝臟組織病理切片

從固定液中取出肝組織，分割成小組織塊，置于燒杯中流水過(guò)夜，并在梯度酒精中進(jìn)行脫水，包埋，切片機(jī)連續(xù)切割5 μm厚的切片，60 ℃烘箱中烤片2 h，二甲苯中脫蠟，在梯度酒精中進(jìn)行復(fù)水，采用蘇木精伊紅(HE)染色，分別在95%，100%的酒精中脫色1 min，二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ中分別透明兩分鐘，將切片放于通風(fēng)箱中風(fēng)干30 min，封片。

1.3.5 免疫組織化學(xué)分析

將組織切片進(jìn)行上述的脫蠟操作后，在梯度酒精中進(jìn)行復(fù)水；使用檸檬酸抗原修復(fù)緩沖溶液(pH = 7.4)加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，3%雙氧水溶液避光孵育25 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；BSA封閉、一抗4 ℃孵育過(guò)夜，并用PBS洗滌3次(每次5 min)，二抗孵育50 min(HRP標(biāo)記)；DAB顯色、蘇木素復(fù)染胞核3 min、自來(lái)水反藍(lán)，封片。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)；P<0.05表示差異顯著；通過(guò)GraphPad Prism 8軟件、ImageJ軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 紫丁香苷對(duì)小鼠血清AST、ALT活性的影響

由圖1A可見(jiàn)，LD組小鼠與NC相比AST活性升高，且差異極顯著(P<0.01)，LSY+LD、HSY+LD組與LD組相比AST活性顯著降低(P<0.01)。由圖1B可見(jiàn)，LD組與NC相比ALT極顯著升高(P<0.01)，LSY+LD、HSY+LD組與LD組相比ALT降低，差異極顯著(P<0.01)；HSY+LD組與LSY+LD組相比ALT差異極顯著(P<0.01)，AST無(wú)明顯差異。

LD組與NC組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01；LSY+LD組或HSY+LD組與模型組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；

2.2 小鼠肝臟生化指標(biāo)

SOD、GSH、CAT水平如圖2所示。LD組與NC組相比小鼠肝組織中SOD和CAT活性、GSH含量降低，差異顯著(P<0.05)；LSY+LD、HSY+LD組與LD組相比，SOD和CAT活性、GSH含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)；HSY+LD組與LSY+LD組相比SOD、GSH活性差異極顯著或顯著(P<0.05，P<0.01)，CAT活性無(wú)明顯差異。

圖2 SOD(A)、GSH(B)、CAT(C)在肝組織中的活性

2.3 小鼠肝臟組織中IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子的水平

小鼠肝臟組織中IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子的水平如圖3所示。LD組與NC組相比小鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，差異極顯著(P<0.01)；LSY+LD、HSY+LD組與LD組相比，IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，差異顯著或極顯著(P<0.05，P<0.01)；HSY+LD組與LSY+LD組相比IL-1β差異極顯著(P<0.01)，IL-6、TNF-α無(wú)顯著差異。

圖3 IL-1β(A)、 IL-6(B)、TNF-α(C)在肝組織中的表達(dá)水平

2.4 小鼠肝臟病理組織切片

小鼠肝臟病理組織切片觀察結(jié)果如圖4所示。NC組小鼠肝臟，肝細(xì)胞在肝竇，肝靜脈周?chē)史派錉睿遗帕姓R；LD組小鼠肝臟細(xì)胞間出現(xiàn)嚴(yán)重瘀血，肝索紊亂，在肝管周?chē)写罅康牧馨图?xì)胞；LSY+LD、HSY+LD組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)隨SY濃度增加逐漸趨于正常，淤血以及炎性浸潤(rùn)減少。

2.5 小鼠肝臟NF-κBp65免疫組化切片

小鼠肝臟NF-κBp65免疫組化檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。與正常組相比，LD組核內(nèi)NF-κBp65核表達(dá)量增加(P<0.01)，在LSY+LD組、HSY+LD組中核內(nèi)NF-κBp65表達(dá)量降低(P<0.01)；HSY+LD組與LSY+LD組相比差異極顯著(P<0.01)。

A.NC組；B.LD組；C.LSY+LD組；D.HSY+LD組

3 討論

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)是由一些傳統(tǒng)的化學(xué)藥物、草藥、膳食補(bǔ)充劑以及其他的外源性物質(zhì)，通過(guò)不同途徑進(jìn)入體內(nèi)；或藥物代謝產(chǎn)物及由于特殊體質(zhì)對(duì)藥物的超敏感性或耐受性降低而導(dǎo)致的肝臟損傷、慢性肝炎、急性肝衰竭等肝功能異常的總稱(chēng)[18-21]。LPS/D-GalN聯(lián)合給藥可在短時(shí)間內(nèi)引起嚴(yán)重的肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)和過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)，其病理特征與臨床上病毒性肝炎所造成的損傷相似，因此，由LPS/D-GalN聯(lián)合給藥建造小鼠肝損傷模型，被廣泛應(yīng)用于保肝藥物的研究。根據(jù)已有的文獻(xiàn)，在LPS/D-GalN(30～100 μg/kg LPS+600～700 mg/kgD-GalN)聯(lián)合給藥劑量的基礎(chǔ)上進(jìn)行給藥劑量的摸索[22-25]。研究結(jié)果表明，600～700 mg/kg的D-GalN藥物劑量造成的肝損傷無(wú)法逆轉(zhuǎn)，因此本試驗(yàn)降低D-GalN的給藥劑量進(jìn)行建模摸索。根據(jù)《藥物性肝損傷基層診療指南》中肝細(xì)胞損傷型、混合型以及肝血管損傷型的模型評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，血清生化學(xué)特征ALT≥3倍正常上限(ULN)即證明肝損傷模型建立成功，最終確定以LPS/D-GalN(30 μg/kg+250 mg/kg)給藥[26-29]。在本試驗(yàn)中，與NC組相比，LD組血清中AST、ALT的活性顯著升高，且ALT≥3 ULN，LSY+LD組與HSY+LD組的AST、ALT的活性得到逆轉(zhuǎn)，趨于正常水平；與LD組相比，紫丁香苷預(yù)防給藥組隨著給藥劑量的增加，肝細(xì)胞在中央靜脈周?chē)呐帕小⑿螒B(tài)逐漸恢復(fù)正常的放射狀，炎性細(xì)胞數(shù)目減少，淤血減輕。正常生理情況下機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)如SOD、CAT與GSH等可以消除過(guò)量ROS，避免肝臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)，維持肝功能正常；但當(dāng)肝功能受損時(shí)，抗氧化防御系統(tǒng)的激活受到抑制，過(guò)多的ROS無(wú)法被完全清除，從而在肝臟位置發(fā)生劇烈得脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)一步損害肝功能[30-32]。在本研究中，給予LPS/D-GalN后SOD、CAT活性降低，GSH含量降低，與現(xiàn)有研究結(jié)果相符合；與LD組相比，LSY+LD組、HSY+LD組的SOD、CAT活性升高，GSH含量上調(diào)，且具有劑量依賴(lài)性，證明SY可以通過(guò)激活機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)，從而刺激抗氧化酶的產(chǎn)生，減輕機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化。此外，LPS/D-GalN造成肝損傷另一主要原因是LPS與巨噬細(xì)胞表面的Toll-4(TLR4)受體相結(jié)合，通過(guò)TLR4/MYD88途徑使得NF-κBp65亞單位S536發(fā)生磷酸化反應(yīng)被激活，從而發(fā)生核轉(zhuǎn)位與靶向的DNA結(jié)構(gòu)域結(jié)合，調(diào)節(jié)下游炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，從而造成炎性因子不可控的增加，如IL-6，IL-1β、TNF-α等炎性因子的劇增[33-37]。本文研究中利用總NF-κBp65抗體進(jìn)行免疫組化，結(jié)果表明與NC組相比LD組NF-κBp65的核轉(zhuǎn)移率增高，且與藍(lán)染的細(xì)胞核顏色發(fā)生重疊呈現(xiàn)烏黑色，IL-6、IL-1β、TNF-α因子的表達(dá)顯著升高；在SY的干預(yù)下NF-κBp65核轉(zhuǎn)移率下降，IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)顯著降低，證明SY可以通過(guò)抑制NF-κBp65的激活，抑制其發(fā)生核轉(zhuǎn)移，從而抑制了下游的炎性因子的表達(dá)，降低肝臟的炎性反應(yīng)。

綜上，本試驗(yàn)結(jié)果顯示紫丁香苷對(duì)LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制NF-κBp65蛋白在肝臟的激活，抑制炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的產(chǎn)生，促進(jìn)肝臟抗氧化酶的產(chǎn)生有關(guān)。