賈聚娟 馬海峰 郝 光

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院神經內科,河北省張家口市 075000)

缺血性腦卒中是指腦局部血液循環(huán)異常引起的神經功能受損性疾病,該病有較高的傷殘率、復發(fā)率、病死率等,對患者健康造成嚴重影響[1]。缺血性腦卒中是腦卒中最常見的一種類型,發(fā)病人群主要為老年人群。雖然目前臨床上缺血性腦卒中的治療水平不斷提高,患者病死率明顯下降,但腦卒中后遺癥的發(fā)生率仍較高,可嚴重影響患者的生活水平,加重患者的心理壓力及醫(yī)療負擔。缺血性腦卒中患者常會出現(xiàn)認知功能障礙,表現(xiàn)為計算、執(zhí)行、言語、記憶及判斷理解等能力受損[2]。此外,缺血性腦卒中患者還可并發(fā)焦慮/抑郁,其發(fā)生率約為40%,可影響患者治療的配合度及效果[3]。

缺血性腦卒中發(fā)生的影響因素較多,發(fā)病機制相對復雜,其中炎癥反應可能在缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用。炎癥反應的發(fā)生涉及多種細胞因子及免疫細胞。其中,細胞分裂周期蛋白42(cell division cyclin 42,CDC42)是重要的免疫調節(jié)因子,不但可促進神經干細胞/祖細胞遷移而利于腦損傷組織的修復,還可促使中性粒細胞發(fā)生遷移,甚至誘導其極化表型的轉化[4]。Th17可通過合成并分泌白細胞介素(interleukin,IL)-6等細胞因子而介導炎癥反應,且在腫瘤、感染、自身免疫性疾病等的發(fā)生與發(fā)展過程中起重要作用[5];Th1可有效刺激及介導細胞免疫反應,其可分泌IL-2、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等炎癥因子,與神經退行性疾病密切相關;Th2則具有促進體液免疫的作用,其可下調Th1的活性,分泌IL-10、IL-5等抗炎因子[6-7]?；诖?本文探討缺血性腦卒中患者的外周血CDC42表達水平、炎癥相關Th(Th1、Th2、Th17)及細胞因子(IL-6、IL-10、TNF-α)水平,并分析上述指標與神經功能缺損、焦慮/抑郁及認知功能障礙程度之間的關系,了解上述指標與缺血性腦卒中發(fā)生、發(fā)展的關系,以期為該病的臨床干預提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021年12月至2022年12月于我院神經內科住院的200例缺血性腦卒中患者作為觀察組。納入標準:(1)至少伴有1種腦血管疾病高危因素(如糖尿病、高血壓、肥胖、高脂血癥等),且經頭顱CT或MRI診斷為新發(fā)腦梗死病灶;(2)局灶性腦神經功能損傷持續(xù)時間>24 h;(3)疾病發(fā)作后24 h內入院;(4)年齡>18歲。排除標準:(1)伴有顱內出血的患者;(2)伴有較嚴重的自身免疫性疾病、感染、炎癥等患者;(3)無法配合完成神經心理學評估的患者;(4)服用抗精神病藥物者或既往存在精神類疾病的患者;(5)存在血液系統(tǒng)惡性腫瘤或是其他腫瘤病史者;(6)存在濫用具有依賴性的藥物、酒精依賴癥者。另選取同期在我院體檢中心體檢的200例健康體檢者作為對照組。兩組的年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性,見表1。兩組研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書。本研究經我院醫(yī)學倫理委員會批準,并遵循赫爾辛基宣言及相應的規(guī)章制度。

表1 兩組一般臨床資料的比較

1.2 相關指標的檢測方法 分別抽取觀察組入院時、對照組體檢時晨起空腹狀態(tài)下的外周靜脈血6 mL,取3 mL血標本用于檢測Th1、Th2及Th17水平。取剩余3 mL血標本靜置30 min后,于4 ℃條件下以3 000 r/min離心20 min,提取上清液,置于-80 ℃冰箱保存,用于檢測CDC42 mRNA表達水平和細胞因子水平。

1.2.1 CDC42 mRNA表達水平的檢測:根據RNA提取試劑(北京百奧萊博科技有限公司,貨號:WE0193)、反轉錄試劑(江蘇開銳生物醫(yī)藥科技有限公司,貨號:KRSJH039)說明書,提取血標本RNA后進行反轉錄獲得cDNA。以GAPDH為內參,使用實時熒光定量PCR試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,貨號:Q222-01)及實時熒光定量 PCR系統(tǒng)(Life Technologies公司,型號:QuantStudioTM6 Pro)進行PCR擴增。CDC42上游引物序列為5′-GATACTCACTTTTTGCGGTCT-3′,下游引物序列為5′-ATGTAGGAAGTGCCAGAGCC-3′;GAPDH上游引物序列為5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,下游引物序列為5′-CAGGGGCCATGCTAATCTT-3′。反應體系包括上下游引物各0.5 μL、cDNA模板1 μL、SYBR Green 10 μL,加蒸餾水至20 μL。反應條件為95 ℃ 7 min;93 ℃ 25 s、66 ℃ 30 s、74 ℃ 13 min,共40個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算CDC42的mRNA表達水平。

1.2.2 Th1、Th2、Th17水平的檢測:按1 ∶1比例將3 mL外周靜脈血與RPMI-1640培養(yǎng)基(武漢賽奧斯生物科技有限公司,貨號:MED-1029)混合均勻,添加10 mg激活劑佛波酯[翌圣生物科技(上海)股份有限公司,貨號:50601ES03],加入2 μg/mL高爾基體阻斷劑[和元生物技術(上海)股份有限公司,貨號:AC14L343]與10 mg/mL離子霉素(北京伊塔生物科技有限公司,貨號:YT05990),于4 ℃下過夜培養(yǎng),將細胞收集于流式管,離心(3 500 r/min離心15 min)后提取上清液,加入異硫氰酸熒光素標記的抗人CD4單抗(湖南合創(chuàng)思醫(yī)療科技有限公司,湘長械備20221348號),室溫、避光下靜置0.5 h,固定、破膜后,加入藻紅蛋白標記的人抗小鼠γ干擾素單克隆抗體(上海聯(lián)邁生物工程有限公司,貨號:LM-11425-ES)、異硫氰酸熒光素標記的人抗小鼠IL-4單克隆抗體(上海羽朵生物科技有限公司,貨號:YDLC-9033)、藻紅蛋白標記的抗IL-17單克隆抗體(武漢艾美捷科技有限公司,貨號:AAT-2558),最后使用流式細胞儀[艾森生物(杭州)有限公司,型號:NovoCyte 2060R]檢測Th1、Th2及Th17水平。

1.2.3 IL-6、IL-10、TNF-α水平的檢測:采用ELISA檢測血清IL-6、IL-10、TNF-α水平,按照試劑盒說明書的操作步驟進行檢測。IL-6、IL-10、TNF-α的ELISA檢測試劑盒均購于武漢艾美捷科技有限公司,貨號分別為RP0870H-500、RD194572200R、3512-1HP-2。

1.3 缺血性腦卒中患者神經功能缺損程度的評估 于入院當天由具有5年及以上臨床經驗的主治醫(yī)師,采用美國國立衛(wèi)生院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)[8]評估患者的神經功能缺損程度。該量表包括意識水平、意識水平指令、意識水平提問、視野、凝視、上肢及下肢運動、語言、感覺、共濟失調、忽視癥、構音異常11項內容,每項內容按不同嚴重程度計為0～2分或0～4分,無法實施的項目計為9分并注明原因。該量表總分范圍為0～42分,總分越高表示患者的神經功能缺損越嚴重,其中<4分為輕度神經功能缺損,4～15分為中度神經功能缺損,>15分為重度神經功能缺損。

1.4 缺血性腦卒中患者焦慮/抑郁情況的評估 入院當天由具有5年及以上臨床經驗的主治醫(yī)師,分別采用焦慮自評量表(Self-Rating Anxiety Scale,SAS)及抑郁自評量表(Self-Rating Depression Scale,SDS)[9]評估患者的焦慮/抑郁情況。其中,SAS包含20項內容,其中正向評分有15項,負向評分有5項,每項內容均采用4級評分法(1～4分)進行評分,總分越高者焦慮情況越嚴重,其中50～59分為輕度焦慮,60～69分為中度焦慮,≥70分為重度焦慮。SDS包含20項內容,正向評分及反向評分的項目各10個,每項內容均采用4級評分法(1～4分)進行評分,總分越高者抑郁情況越嚴重,其中53～62分為輕度抑郁,63～72分為中度抑郁,≥73分為重度抑郁。

1.5 缺血性腦卒中患者認知功能障礙程度的評估 入院當天由具有5年及以上臨床經驗的主治醫(yī)師,采用簡易智力狀況檢查(Mini Mental State Examination,MMSE)量表[10]評估患者的認知功能障礙程度。該量表包括意識水平、注意與計算能力、語言能力、學習與記憶力能力、空間與時間定向5項內容。該量表總分范圍為30分,總分越高表示患者的認知功能越好,其中26～30分為正常,20～25分為輕度認知功能障礙,10～19分為中度認知功能障礙,0～9分為重度認知功能障礙。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗;計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗;采用Pearson檢驗進行相關性分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組研究對象CDC42 mRNA表達水平、炎癥相關Th及細胞因子水平的比較 觀察組的IL-6、TNF-α、Th1、Th17水平高于對照組,而CDC42 mRNA表達水平及Th2、IL-10水平低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象CDC42 mRNA表達水平、炎癥相關Th及細胞因子水平的比較 (x±s)

2.2 觀察組患者的CDC42 mRNA表達水平、炎癥相關Th及細胞因子水平與NIHSS評分、SAS評分、SDS評分、MMSE量表評分的相關性 觀察組的NIHSS評分、SAS評分、SDS評分、MMSE量表評分分別為(20.57±3.26)分、(71.34±4.23)分、(75.06±5.18)分、(17.15±2.14)分。Th1、Th17、IL-6、TNF-α水平與NIHSS評分、SAS評分、SDS評分呈正相關,與MMSE量表評分呈負相關(P<0.05);而CDC42 mRNA表達水平及IL-10、Th2水平與NIHSS評分、SAS評分、SDS評分呈負相關,與MMSE量表評分呈正相關(P<0.05)。見表3。

表3 觀察組患者的CDC42 mRNA表達水平、炎癥相關Th及細胞因子水平與NIHSS評分、SAS評分、SDS評分、MMSE量表評分的相關性

3 討 論

腦卒中為病死率較高的疾病,約有70%的腦卒中為缺血性腦卒中,多數(shù)缺血性腦卒中患者易出現(xiàn)不同程度的神經功能缺損和認知功能障礙,其中認知功能障礙表現(xiàn)為記憶、行為、注意、執(zhí)行、視覺等能力下降,嚴重影響患者的日常生活[11-12]。雖然常規(guī)治療缺血性腦卒中的藥物可在一定程度上改善患者的相關臨床癥狀,但部分患者的神經功能無法恢復至正常狀態(tài),還有部分患者患病后極易出現(xiàn)焦慮/抑郁等不良情緒,對其病情恢復造成一定影響[13]。

炎癥反應及免疫反應是影響缺血性腦卒中發(fā)生的重要因素,且外周免疫細胞及膠質細胞參與調節(jié)缺血性腦卒中的炎癥反應[14]。腦卒中發(fā)生后可激活機體炎癥級聯(lián)反應,引起局部和/或全身性免疫反應,進一步加劇腦組織損傷[15]。CDC42屬于鳥嘌呤三核苷酸酶,是重要的免疫調節(jié)因子。CDC42參與神經細胞遷移及生長過程的調控,為缺血半暗帶的潛在血清標志物,而缺血/再灌注又可明顯改變CDC42的活性[16]。研究顯示,在認知功能障礙發(fā)病機制中,T淋巴細胞起到一定作用[17-18]。CD4+T淋巴細胞可分化成不同亞群的Th,其中Th1、Th2可互相影響,通過分泌特異性細胞因子發(fā)揮免疫調節(jié)及炎癥調控的作用。Th1主要分泌IL-2、TNF-α、γ干擾素等細胞因子,在炎癥反應中發(fā)揮重要作用;Th2主要分泌IL-4、IL-10等細胞因子,具有抗炎作用[19-20]。Th17為Th的亞群之一,可分泌IL-17、IL-23、IL-6及TNF-α等促炎因子,具有較強的促炎作用,在炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用[21]。同時,Th17可與調節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)互相影響、互相拮抗。Treg可抑制免疫反應過度激活,發(fā)揮保護神經的作用[22],其數(shù)量減少可提高炎癥細胞因子的表達水平與大腦小膠質細胞的數(shù)量,導致Th17數(shù)量增加,而Th17數(shù)量增加又可抑制Treg分化,加重炎癥反應,從而加重腦部損傷[23]。本研究結果顯示,觀察組的Th1、Th17、IL-6、TNF-α水平高于對照組,而Th2、IL-10水平及CDC42 mRNA表達水平低于對照組(P<0.05)。這提示缺血性腦卒中患者的外周血促炎性Th及細胞因子水平升高,而抗炎性Th及細胞因子水平降低,CDC42表達水平下調,動態(tài)監(jiān)測上述指標可能有助于評估缺血性腦卒中患者的病情。

本研究結果還顯示,觀察組的Th1、Th17、IL-6、TNF-α水平與NIHSS評分、SAS評分、SDS評分呈正相關,與MMSE量表評分呈負相關(P<0.05);而IL-10、Th2水平及CDC42 mRNA表達水平與NIHSS評分、SAS評分、SDS評分呈負相關,與MMSE量表評分呈正相關(P<0.05)。這說明外周血促炎性Th及細胞因子水平越高,而抗炎性Th及細胞因子水平、CDC42 mRNA表達水平越低,缺血性腦卒中患者的神經功能缺損、焦慮/抑郁、認知功能障礙程度越嚴重。其原因可能為炎癥反應及免疫反應在缺血性腦卒中的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用,而上述免疫細胞及因子的表達異常,可加重炎癥反應及免疫紊亂,進而促進缺血性腦卒中患者的病情進展,誘發(fā)或加重認知功能障礙、焦慮/抑郁等并發(fā)癥。

綜上所述,缺血性腦卒中患者外周血促炎性Th(Th1、Th17)及細胞因子(IL-6、TNF-α)水平升高,而抗炎性Th(Th2)及細胞因子(IL-10)水平降低,免疫調節(jié)因子CDC42表達水平下調,上述指標可在一定程度上反映患者的神經功能缺損、焦慮/抑郁及認知功能障礙程度,有助于監(jiān)測患者的病情程度及進展情況。