張馨月,袁 博,白曉拴

(內(nèi)蒙古師范大學 生命科學與技術(shù)學院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022)

塑料作為高分子材料之一,得益于有機高分子技術(shù)的發(fā)展,人們不斷開發(fā)新的塑料產(chǎn)品、擴大生產(chǎn)規(guī)模,據(jù)聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署(UNEP)的數(shù)據(jù)顯示,2019年全球塑料年產(chǎn)量達到 4.60 億t,其中我國的塑料產(chǎn)量占比超過 30%,居世界首位[1]。尤其自2020年新型冠狀病毒感染暴發(fā)以來,口罩等一次性塑料防護用品使用量激增[2],這些人工合成的高分子聚合物在自然環(huán)境中無法被快速降解,給土壤等帶來嚴重的污染。人們將直徑小于5 mm的塑料顆粒稱為微塑料,微塑料通過多種途徑進入人體并產(chǎn)生危害:據(jù)研究顯示微塑料可以通過抑制乙酰膽堿酯酶活性對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用,并且在分子水平上影響細胞功能[3-4]。人體內(nèi)的微塑料超過一定量將引發(fā)炎癥,破壞免疫系統(tǒng)。此外,微塑料中的化學物質(zhì)還會導致糖尿病、癌癥等發(fā)生[5]。

1 PET概述

聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET),由對苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)脫水縮合而成的熱塑性聚酯,其結(jié)構(gòu)式如圖1。PET自1929年由杜邦實驗室合成以來,由于其優(yōu)越的物理力學性能及熱穩(wěn)定性成為最常用的合成塑料之一,并廣泛應(yīng)用于飲料包裝。據(jù)統(tǒng)計,市場中約有 70% 的飲料瓶采用了PET外包裝技術(shù)[6]。數(shù)量龐大的PET制品在廢棄后形成了“白色污染”,嚴重破壞了生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。因此,PET塑料垃圾的回收降解引起了世界的廣泛關(guān)注。

圖1 聚對苯二甲酸乙二醇酯分子式Fig.1 Molecular formula of polyethylene terephthalate

目前,針對PET廢棄物降解方法主要有3種:物理法、化學法和生物法。物理法即將PET廢棄物回收分類后進行粉碎等處理后,進行二次制造或改性造粒生產(chǎn)纖維[7]。該方法的缺點是有害物質(zhì)殘留、PET分子鏈受到破壞、黏度下降等,影響PET制品的質(zhì)量。化學法即利用化學方法對PET進行解聚,解聚形成的單體或低聚物可作為原料進行再生產(chǎn)。目前化學法是工業(yè)降解PET的主要方法,包括水解法、醇解法和氨解法3種[8]。相較物理法,化學法實現(xiàn)了PET的循環(huán)利用,但降解成本高昂、降解過程中使用的化學催化劑會對環(huán)境造成二次污染。因此研究人員迫切尋求更為經(jīng)濟環(huán)保的PET降解方法。

在1977年,Tokiwa等[9]發(fā)現(xiàn)了幾種可以水解多種聚酯的酶。隨著生物工程技術(shù)不斷發(fā)展,人們將目光轉(zhuǎn)向了生物降解。微生物首先分泌胞外酶,在胞外與大分子聚合物PET結(jié)合,將大分子PET轉(zhuǎn)化為水溶性的小分子化合物,并吸收至體內(nèi),這些水溶性的小分子在微生物體內(nèi)進一步分解,最終分解為二氧化碳、水等物質(zhì)(具體過程見圖2[10])。相較于物理法和化學法,生物法具有成本低、反應(yīng)條件溫和、綠色無污染等優(yōu)點。因此PET的生物降解已經(jīng)成為熱門話題之一,目前已經(jīng)報道了多種PET降解酶,研究人員對這些降解酶的結(jié)構(gòu)及降解機制進行深度解析,并對其進行多種工程改造,以獲得更為高效的降解酶,實現(xiàn)PET廢棄物的無污染降解。

圖2 PET塑料的生物降解機理Fig.2 Biodegradation mechanism of PET plastics

2 PET水解酶

PET水解酶,屬于α/β水解酶家族的羧酸酯水解酶[11]。目前已知PET水解酶有:酯酶、角質(zhì)酶、脂肪酶、PETase與MHETase。其中酯酶只能改善PET膜的表面親水性[12]、脂肪酶因其催化中心結(jié)構(gòu)域所限,對PET的水解活性較低[13]。而角質(zhì)酶及其同系物具有很強的PET水解能力,能夠在高溫下降解PET;同時PETase和MHETase可在常溫下高效水解PET[14]。因此大多研究集中于采用角質(zhì)酶與PETase降解PET。

2.1 角質(zhì)酶

角質(zhì)酶屬于α/β水解酶超家族,最早在植物及昆蟲病原真菌中發(fā)現(xiàn)。角質(zhì)酶具備羧酸酯酶和脂肪酶的部分特性,但又與之不同。與脂肪酶相比,角質(zhì)酶不需要界面活化,其催化絲氨酸可直接暴露于溶劑中,有利于PET的高效水解[15]。此外,角質(zhì)酶可形成氧陰離子空穴,該空穴位于活性位點,對于穩(wěn)定底物酯或酰胺羰基氧上的負電荷具有重要意義[16]。如圖3[17]所示,角質(zhì)酶可將PET水解成對苯二甲酸乙二酯(BHET)、單羥乙基對苯二甲酸酯(MHET)、苯二甲酸(TPA)、乙二醇(EG)等亞基。以TfCut2為例,在角質(zhì)酶的作用下,酯鍵催化斷裂,形成TPA末端鏈和HE末端鏈。TPA末端鏈和HE末端鏈繼續(xù)被降解成2-HE(MHET)2、(MHET)2、BHET、MHET、TPA等二聚體和單體,最終降解為MHET、TPA和EG[18]。

圖3 角質(zhì)酶PET降解機制Fig.3 Mechanism of PET degradation with cutinase

2005年,Silva等[19]發(fā)現(xiàn)腐皮鐮刀菌角質(zhì)酶(FsC)能夠?qū)ET纖維的表面進行改性,并將PET分解為TPA和EG;且實驗結(jié)果表明,FsC的最佳反應(yīng)溫度應(yīng)低于50 ℃,達到60 ℃時失活。Ronkvist等[20]發(fā)現(xiàn)在40 ℃的條件下,FsC能夠?qū)?7% 低結(jié)晶度的PET膜完全分解成TPA和EG單體。同時,在2009年Ronkvist等[20]還發(fā)現(xiàn)了一種來源于特異腐質(zhì)霉(Humicolainsoles)的HiC角質(zhì)酶能夠降解低結(jié)晶度的PET;HiC具有良好的熱穩(wěn)定性,可在70 ℃下反應(yīng)96 h[20]。此外,研究人員還從多種褐色喜熱裂孢菌(Thermobifidafusca)菌株中發(fā)現(xiàn)了TfH、ThcCut1和ThcCut2等角質(zhì)酶[15]。TfH可在55 ℃下降解 10% 結(jié)晶度的PET膜,三周后PET膜的重量減少了 50%,這是對TfH降解PET的首次報道[21]。Then等[22]通過在TfH中添加大量的Ca2+、Mg2+,使得在65 ℃下PET膜的質(zhì)量減少 13%,Ca2+、Mg2+的添加將酶的活性提高了 4.5 倍。Acero等[23]發(fā)現(xiàn)了兩個來自嗜熱纖維菌DSM44535的角質(zhì)酶ThcCut1和ThcCut2,二者緊密相關(guān)且均具有水解PET的能力。Kawai等[24]在綠色糖單胞菌AHK190病毒體中獲得了Cut190,該酶的活性及熱穩(wěn)定性與之前發(fā)現(xiàn)的角質(zhì)酶相比均有所提高。2012年,Sulaiman等[25]克隆出了堆肥宏基因組的LCC,LCC在pH值為 8.0 的條件下水解PET,顯示出12 mg·h-1·mg-1的酶活性[26]。以上提到的角質(zhì)酶均具有較高的熱穩(wěn)定性,溫度范圍可達65～75 ℃。而在pH值范圍,絕大多數(shù)的角質(zhì)酶適應(yīng)于中性或堿性pH值環(huán)境。例如,真菌角質(zhì)酶的最佳pH值為 7.5～10.0[24,27]。

2.2 PETase和MHETase

2016年,Yoshida等[28]篩選出了一種新的菌株大阪堺菌(Ideonellasakaiensis) 201 F6,該菌株以PET為唯一碳源。在此之前,人們普遍認為只有脂肪酶、酯酶等能夠水解酯鍵分解PET,數(shù)量稀少活性較低[29]。該菌株利用水解酶PETase在30 ℃的反應(yīng)條件下與 1.9% 的PET膜反應(yīng),6周后,低結(jié)晶度的PET膜完全分解為小片段——單(2-羥乙基)、MHET。此外,研究人員還發(fā)現(xiàn)了一種MHET水解酶(MHETase)。該酶與PETase協(xié)同反應(yīng),將分解的MHET進一步水解,最終轉(zhuǎn)化為TPA和EG(圖4[30])。

圖4 Ideonella sakaiensis 201 F6中關(guān)鍵PET降解酶的反應(yīng)Fig.4 Reaction of key PET-degrading enzymes in Ideonella sakaiensis 201 F6

IsPETase,一種來自細菌Ideonellasakaiensis的PETase(即一種降解PET的酶,被稱作IsPETase),屬于α/β水解酶超家族,α/β水解酶根據(jù)構(gòu)成氧陰離子孔的氨基酸,可以分為GX型、GGGX型和Y型,IsPETase等PET降解酶均為GX型[31-32]。經(jīng)過進一步研究發(fā)現(xiàn),IsPETase由290個氨基酸殘基組成,具有典型的α/β水解酶折疊方式[18,33]。該酶具有獨特的延長環(huán),以增強酶與PET的結(jié)合[18]。Liu等[34]發(fā)現(xiàn)IsPETase與角質(zhì)酶具有 53% 的氨基酸序列相似性,因此他們認為IsPETase是角質(zhì)酶的同源物。與角質(zhì)酶相比,IsPETase具有更寬的活性位點,有利于PET大分子進入催化中心。在活性位點處,發(fā)現(xiàn)了IsPETase的保守催化三聯(lián)體Ser160-His237-Asp206,絲氨酸殘基位阻較小,能夠產(chǎn)生更寬的口袋以供PET底物的結(jié)合,而角質(zhì)酶中則為苯丙氨酸殘基,位阻較大[18,33,35]。這些結(jié)構(gòu)均使得IsPETase對PET具有特異性的降解。IsPETase在活性位點具有兩個二硫鍵(角質(zhì)酶只含有一個二硫鍵),特殊的二硫鍵DS1能夠連接PETase特有的一段loop區(qū)[26,33];特殊的二硫鍵結(jié)構(gòu)使得PETase適于在中溫下水解PET;數(shù)據(jù)表明,PETase 30 ℃ 下的水解活性較其他水解酶高 5.5～120.0倍[30,36]。相對角質(zhì)酶等需要在高溫下才能水解PET,PETase表現(xiàn)出了更高的優(yōu)勢,并為生物降解PET提供了更多的可能性。

與其他PET水解酶相比,除上述所提到的特異性降解PET外,PETase還表現(xiàn)出了以下特征:(1)水解活性與酶濃度影響呈負相關(guān),酶濃度較高時水解活性反而出現(xiàn)降低現(xiàn)象[15]。(2)降解效率高;PET還能夠降解高結(jié)晶度PET膜,降解效率是其他PET水解酶的20.0倍[37]。

3 提高PET水解酶效率的方法

生物降解PET法相對其他處理方法表現(xiàn)出了極高的優(yōu)勢以及廣闊前景,其污染性低的特點也符合當下人們對綠色環(huán)保的追求,這項研究正受到越來越多的關(guān)注。然而,PET生物降解技術(shù)仍存在許多問題,水解酶由于其熱穩(wěn)定性及水解活性等限制,無法進行大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用,如何有效提高PET水解酶的降解速率成為科學家們思考的問題。

在2020年,發(fā)表于《Nature》的一篇文章中提到:來自法國圖盧茲南部比利牛斯聯(lián)合大學的研究團隊提出了一種新的可在10 h分解 90% PET的LCC角質(zhì)酶[38]。該團隊在評估驗證后選擇了ICCG和WCCG兩個最佳突變體,在20 h和15 h內(nèi)分別達到 82% 和 85% 的轉(zhuǎn)化率,進一步借助計算機進行輔助后,可在10 h內(nèi)達到 90% 的PET分解率。近期,Yuan等[39]利用彈性蛋白樣多肽(ELP)標記角質(zhì)酶,標記后的角質(zhì)酶相對野生型角質(zhì)酶活性和熱穩(wěn)定性等均有所提高,有效解決了酶降解PET過程中產(chǎn)物抑制的問題,但產(chǎn)量不足,需要進一步研究。

3.1 酶的定向進化

定向進化是提高酶性能的有效方法之一,高通測量篩選技術(shù)可作為定向進化應(yīng)用的主要手段。PETase可特異性地降解PET,是一種極具潛力的PET水解酶。Shi等[40]基于一種新的高通量熒光篩選技術(shù),獲得了高性能突變體DepoPETase,DepoPETase可完全降解 10% 結(jié)晶度的PET材料,而對于高結(jié)晶度的PET材料,需先對材料進行處理,將結(jié)晶度降低至 10% 以下,再進行解聚。

近期,Liu等[41]利用基于雙熒光的高通量篩選方法,對IsPETase進行突變體篩選,獲得了6個高效IsPETase突變體,其活性提高了 1.3～4.9 倍。該實驗的高通量篩選方法經(jīng)證實具備廣泛的PET材料適用性,且方便快捷,在4 d內(nèi)能夠完成2 850個突變體的篩選,因此對PET降解的研究提供了新的數(shù)據(jù)參考,有助于優(yōu)化PET塑料的降解方案。

3.2 基于未培養(yǎng)微生物的可培養(yǎng)化提高PET水解酶效率

生物降解法限制之一在于目前能夠分泌降解PET酶的微生物數(shù)量極低,且酶分泌量不足,因此,需要進一步發(fā)掘更多的PET水解酶與微生物,并加大其產(chǎn)量,以擴大PET回收水解的工業(yè)化應(yīng)用。然而,人類對微生物的了解仍是狹隘的,在自然界中有6 000多種的微生物基因組中存在著高達16 170種有關(guān)塑料降解的酶基因,其中PET降解酶相關(guān)同源基因有8 233種,但目前僅有400余種微生物被鑒定出可降解PET,大部分都來源于未培養(yǎng)微生物[42],這些未培養(yǎng)微生物中可能存在高塑料降解能力的微生物類群。Sulaiman等[43]利用高通測量技術(shù)測定了未培養(yǎng)微生物宏基因組,并篩選出能夠降解PET的LC-角質(zhì)酶基因。Gao等[44]將塑料進行長期人工培養(yǎng),獲得了一個具有PET降解能力的微生物菌群。對未培養(yǎng)微生物進行人工培養(yǎng)也是提高PET降解酶產(chǎn)量的有效方法之一[45]。此外,研究人員利用原位培養(yǎng)裝置模擬微生物的原生環(huán)境,成功培養(yǎng)出數(shù)種未培養(yǎng)微生物。Nichols等[46]設(shè)計了一種新的原位培養(yǎng)裝置,將培養(yǎng)體系與外界環(huán)境以半透膜的形式隔離,成功解決了未培養(yǎng)微生物的VBNC狀態(tài)(活而不可培養(yǎng)態(tài)),獲得了未培養(yǎng)微生物的純菌株。原位培養(yǎng)裝置還能對微生物的群體感應(yīng)機制(Quorum Sensing,QS)進行最大程度的模擬,利用微生物的成膜性,極大提高了未培養(yǎng)微生物降解PET的能力[40,47]。綜上,未培養(yǎng)微生物的可培養(yǎng)化策略在PET生物降解方面表現(xiàn)出了廣闊的前景。

3.3 提高PET水解酶熱穩(wěn)定性與水解活性

由于PET材料自身需要在高溫下才能夠進行玻璃性轉(zhuǎn)化,因此反應(yīng)過程中需要水解酶具有較高的熱穩(wěn)定性。研究人員曾在水解酶中添加二價金屬離子(Ca2+、Mg2+等)增加穩(wěn)定性。然而Ca2+在反應(yīng)過程中可能會和其他物質(zhì)產(chǎn)生不溶性副產(chǎn)物[48],因此在工業(yè)中不能依賴Ca2+進行大規(guī)模降解。研究人員在此基礎(chǔ)上提出可利用二硫鍵對Ca2+結(jié)合位點進行替代,之前的研究表明,二硫鍵對于蛋白酶的熱穩(wěn)定性具有重要意義。Then等[49]對TfCut2酶進行改造,引入二硫橋或鹽橋,使得TfCut2突變體在 70.0 ℃下有效降解PET薄膜。Son等[50]對TfCut2改造獲得了IsPETase S92D/D157H雙突變體,在 40.0 ℃下反應(yīng)72 h,催化活性提高了 6.0 倍。該突變體的Tm(DNA熔解溫度)比野生型的提高了 8.0 ℃。Yin等[51]依據(jù)靜電相互作用提高IsPETase熱穩(wěn)定性,通過實驗發(fā)現(xiàn)突變體I139R水解活性提高 3.6 倍,并顯示出 56.4 ℃的最高Tm值。 Liu等[52]在DuraPETase的基礎(chǔ)上添加了一對二硫鍵,設(shè)計出了DuraPETase-4M突變體,增強了DuraPETase的整體剛性,提出增加關(guān)鍵區(qū)域的柔性可在一定程度提高PET降解的能力。同時,研究人員還通過蛋白質(zhì)表面靜電荷優(yōu)化來提高DuraPETase的熱穩(wěn)定性,使得該突變體可降解 93.3% 的無定型PET粉末和69.8%的PET預(yù)成膜,速率分別提高了 3.2 倍和 5.4 倍。該實驗進一步提高了IsPETase在PET降解方面的潛力與應(yīng)用。

3.4 基于計算機技術(shù)提高PET水解酶活性

除了上述基于酶結(jié)構(gòu)的改造外,計算機技術(shù)也被用于PET降解酶的熱穩(wěn)定改造[30]。目前已有多種基于計算的蛋白質(zhì)工程改造方法。目前開發(fā)的混合策略,可顯著擴大預(yù)測突變體的數(shù)量,增加了更多的組合途徑。貪婪算法目前在人工智能中的應(yīng)用愈加廣泛,Cui等[53]以該算法為基礎(chǔ),引入了蛋白質(zhì)工程的貪婪積累策略(GRAPE),該策略可最大化地利用突變集之間的可加性和(或)協(xié)同作用來探索上位性效應(yīng)。研究人員基于蛋白質(zhì)工程的貪婪積累策略[53]對PETase進行改造,利用融合策略預(yù)測了85個有益單點并進行檢驗,將得到的21個有益單點分為3個Cluster,依據(jù)貪婪算法將Cluster進行10輪迭代增加,獲得了具有10個氨基酸突變的DuraPETase突變體。該突變體的Tm值較野生型增加31 ℃,對 30% 的高結(jié)晶度PET的水解活性提升了 300.0 倍[33,54]。

4 總結(jié)與展望

截至目前,已發(fā)現(xiàn)的角質(zhì)酶等水解酶能夠有效降解PET,但這些水解酶法同時也存在著許多不足。水解酶PETase對底物具有專一性并且所需反應(yīng)溫度較低,但對降解PET具有較高的潛力,可對該水解酶做進一步的研究。而蛋白質(zhì)工程可針對酶的基因組進行增強改進,因此可利用蛋白質(zhì)工程對PETase水解酶進行工程改造,以提高其降解效率。此外,隨著高通量技術(shù)的發(fā)展,該技術(shù)可用于對酶進行定向進化以及篩選,目前已經(jīng)有諸多科學家通過該手段篩選了新的未培養(yǎng)微生物產(chǎn)生的水解酶,并思考這些未培養(yǎng)微生物的可培養(yǎng)化方案。此外研究人員還通過高通量技術(shù)獲得更為有效的水解酶突變體,提高了水解酶的活性及熱穩(wěn)定性,這可能成為更有效的手段之一。計算機技術(shù)的進步可在另一方向上輔助科學家進行探索,研究人員或許應(yīng)該更多地思考計算機對酶的預(yù)測篩選,以期更快地解決PET降解難題。

總之,PET生物降解法將成為PET乃至其他塑料制品降解的最有效手段之一,需要人們進行更多的研究來發(fā)掘這些酶的潛能,為塑料污染的徹底降解以及創(chuàng)造綠色的生態(tài)未來提供理論基礎(chǔ)和研究方案。