沈秉娜，尚盼盼，曾兵（學(xué)生），李林祥，楊興云，畢磊，鄭玉倩，屈明好，李文文，周曉麗，饒駿，曾兵（老師），3*

（1. 西南大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 402460；2. 巴中市農(nóng)林科學(xué)研究院，四川 巴中 636001；3. 重慶高校草食動物工程研究中心，重慶 400715）

鴨茅（Dactylis glomerata）是禾本科鴨茅屬牧草，又被稱為果園草，主要分布于歐亞大陸及非洲部分高海拔地區(qū)［1-2］。鴨茅是世界著名的優(yōu)良冷季型牧草，家畜的適口性強(qiáng)，生長季節(jié)早，與多年生豆科牧草如紫花苜蓿（Medicago sativa）等混播時(shí)，既能提高牧草產(chǎn)量，又可提升牧草飼用價(jià)值，可供青飼、青貯或調(diào)制干草，也常被用于草地改良和石漠化治理，是多用途類型草種資源，具有重要生態(tài)應(yīng)用價(jià)值和廣闊的開發(fā)前景［3-5］。我國的鴨茅資源大部分分布在西南地區(qū)、新疆天山等地的灌草叢和山坡草地，在我國南方各地現(xiàn)已被大量地種植和推廣應(yīng)用，體現(xiàn)出了良好的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益［6］。

氣候變化加劇了全球環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，影響作物生長，危及全球畜牧業(yè)的生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)增長［7］，在加劇的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)中，澇害是影響作物生產(chǎn)力最主要的非生物脅迫之一［8］。據(jù)政府間氣候變化專門委員會（intergovernmental panel on climate change，IPCC）綜合報(bào)道，21 世紀(jì)末高海拔地區(qū)和赤道太平洋地區(qū)年降水量呈增加趨勢，低海拔大陸地區(qū)和濕熱帶地區(qū)的極端降水事件將更加頻繁［9］。降水過度造成的淹水環(huán)境會抑制氣體通過土壤孔隙擴(kuò)散，導(dǎo)致土壤中厭氧呼吸增強(qiáng)，有害物質(zhì)積累，使作物根際環(huán)境惡化［10-11］，除此之外對作物表型性狀、生物量、活性氧離子積累和糖含量變化等方面也會產(chǎn)生不良影響［12-14］。在我國鴨茅的主要種植區(qū)如四川、重慶、云南、江蘇等南方地區(qū)，由于洪澇災(zāi)害頻繁，嚴(yán)重影響鴨茅的生長發(fā)育、品質(zhì)和產(chǎn)量。但目前對鴨茅非生物脅迫的研究主要是干旱脅迫處理后的形態(tài)和生理指標(biāo)變化［12，15］、干旱脅迫下葉片轉(zhuǎn)錄組分子機(jī)制［16］、冷脅迫下的主要生態(tài)型和相關(guān)生理研究［17-19］、熱脅迫方面主要集中在形態(tài)和生理指標(biāo)［20-22］以及耐熱性遺傳機(jī)制［23］、淹水脅迫方面主要是轉(zhuǎn)錄組分子機(jī)制的研究與形態(tài)和生理指標(biāo)方面［24-28］。對淹水脅迫后代謝組學(xué)的研究目前暫未見報(bào)道。因此探究鴨茅響應(yīng)淹水脅迫的抗逆分子機(jī)制有重要意義。

代謝組以代謝物為代表，代謝物的重要性超越了基因組和蛋白質(zhì)組，位于生命信息傳遞的末端，并作為最終的研究方向，最接近作物現(xiàn)實(shí)的生存狀態(tài)［29］。代謝組學(xué)可以研究植物體內(nèi)不同組織及其在不同逆境脅迫下產(chǎn)生的所有小分子代謝物，這些代謝物在植物抗逆過程中有重要作用。目前，代謝組學(xué)已被用來研究植物在淹水脅迫下的分子機(jī)制，Wang 等［30］在菊花（Chrysanthemum morifolium）花芽分化過程中進(jìn)行淹水脅迫，檢測其不同生長階段的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)菊花不同生長階段黃酮類化合物積累量不同，且大量的黃酮類化合物在淹水脅迫后兩個(gè)階段均顯著增強(qiáng)。武紹龍［31］通過代謝組學(xué)技術(shù)探究淹水脅迫對馬纓杜鵑（Rhododendron delavayi）幼苗根系代謝的影響，結(jié)果顯示淹水脅迫處理后鑒定到的代謝物主要是脂類、酚酸類、黃酮、氨基酸及其衍生物和有機(jī)酸等。為探究澇漬脅迫下煙草（Nicotiana tabacum）代謝物的變化，吳棟等［32］利用質(zhì)譜技術(shù)對水澇脅迫下的煙草代謝物進(jìn)行檢測，共發(fā)現(xiàn)22 種代謝產(chǎn)物，其中初生代謝產(chǎn)物含量增加的主要有谷氨酸、脯氨酸、組氨酸等，次生代謝產(chǎn)物含量增加的主要有阿魏酸、煙堿、兒茶酚等。Komatsu 等［33］從淹水2 d 的4 日齡大豆（Glycine max）幼苗的根部和下胚軸中提取線粒體組分，鑒定差異表達(dá)代謝物，發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）相關(guān)代謝產(chǎn)物在淹水脅迫下積累較多，這些代謝產(chǎn)物在菊花抗淹水脅迫的機(jī)制中發(fā)揮重要作用。以上研究說明，代謝組作為一種目前常用的組學(xué)工具，能夠讓研究者對植物響應(yīng)淹水脅迫的分子機(jī)制有一個(gè)更全面、更深刻的認(rèn)識。

鑒于此，本研究以耐澇型和澇敏型鴨茅為試驗(yàn)材料，不淹水為對照，淹水脅迫處理8 和24 h 后，觀察植株根系形態(tài)變化，并在不同時(shí)間點(diǎn)取樣后進(jìn)行代謝組學(xué)分析，以篩選鴨茅響應(yīng)淹水脅迫的差異代謝物和相關(guān)代謝通路，旨在為解析鴨茅的淹水脅迫響應(yīng)機(jī)制和遺傳育種改良提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以課題組前期通過植株形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和根部顯微結(jié)構(gòu)［25，27］，于2021 年春季篩選出耐澇性存在顯著差異的兩個(gè)鴨茅品種，即耐澇型滇北（Dianbei，DB）和澇敏型安巴（Anba，AB）作為試驗(yàn)材料。選取均勻飽滿的鴨茅種子置于鋪好3 層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，22 ℃黑暗保濕條件下萌發(fā)7 d，再繼續(xù)培養(yǎng)7 d 后，選擇長勢一致的鴨茅幼苗移栽至裝有蛭石、營養(yǎng)土和珍珠巖（體積比為1∶3∶1）的花盆（口徑15.0 cm，高13.5 cm），置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，濕度70%～85%，溫度22 ℃/15 ℃（晝/夜），光周期14 h/10 h（晝/夜），光照5000 lx，土壤相對含水量保持在50%左右，培養(yǎng)期間根據(jù)植株需要每2 周澆1 次1/2 霍格蘭溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脅迫處理與代謝物提取 待鴨茅植株處于分蘗前期（生長30 d 左右）時(shí)開始淹水脅迫處理。將整體長勢一致的鴨茅移入水箱（長80 cm×寬 57 cm×高 50 cm），使植株完全浸沒于清水中，然后加水淹沒至植株葉片最高處，并確保水始終淹沒鴨茅最長葉片頂部。取樣時(shí)間分別為0、8 和24 h，0 h 為空白對照（CK），不做淹水處理。按時(shí)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集鴨茅根系組織，采集時(shí)快速清潔根系，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均取6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別命名為DB01，2，3，4，5，6、DB81，2，3，4，5，6、DB241，2，3，4，5，6、AB01，2，3，4，5，6、AB81，2，3，4，5，6、AB241，2，3，4，5，6。每個(gè)樣本取0.1000 g 經(jīng)液氮研磨后置于離心管中，加入80%甲醇水溶液500 μL；旋渦振蕩，冰浴靜置5 min 后4 ℃離心（12000 r·min-1，20 min）；取500 μL 上清液，加入質(zhì)譜級水進(jìn)行稀釋，使甲醇含量為53%；再次4 ℃離心（12000 r·min-1，20 min）后收集全部的上清液，用于后續(xù)代謝組學(xué)檢測分析。

1.2.2 非靶向代謝組學(xué)分析 本研究基于液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)研究，代謝物的分離鑒定平臺為超高效液相色譜（UHPLC）與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用，即液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS），分析時(shí)每10 個(gè)樣本插入一個(gè)QC（質(zhì)量對照，quality control）樣本以考察整個(gè)分析過程的重復(fù)性，色譜柱為C18（hypesilGoldcolumn，美國）。樣品質(zhì)譜信號采集采用正負(fù)離子掃描模式，電噴霧毛細(xì)管電壓，MS/MS 二級掃描為數(shù)據(jù)依賴性掃描（datadependent scans）。將得到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入CD 3.1（compound discoverer 3.1）軟件，對得到的各代謝物進(jìn)行荷質(zhì)比（m/z）、保留時(shí)間參數(shù)篩選，再通過離子峰預(yù)測代謝物分子式；與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，利用空白樣品去除相關(guān)干擾離子，最后對定量分析結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，最后獲取代謝物數(shù)據(jù)和相對定量結(jié)果。分析對比模式為DB8hvs DB0h、DB24hvs DB0h、AB8hvs AB0h、AB24hvs AB0h、DB0hvs AB0h、DB8hvs AB8h、DB24hvs AB24h，為了更加準(zhǔn)確地挖掘數(shù)據(jù)中重要的信息，運(yùn)用主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）等多元統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析。篩選PLS-DA 模型變量的變量權(quán)重值（variable important in projection，VIP）＞1.0，差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞1.2 或FC＜0.833 且P-value＜0.05 的差異代謝物，利用京都基因和基因組途徑數(shù)據(jù)庫百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、人類代謝組數(shù)據(jù)庫（human metabolome database，HMDB）、脂質(zhì)代謝途徑研究計(jì)劃（lipid metabolites and pathways strategy，LIPID MAPS）數(shù)據(jù)庫對鑒定到的差異代謝物進(jìn)行注釋，富集結(jié)果以KEGG Pathway 為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，借助超幾何檢驗(yàn)方法，得到通路富集的P-value 值，其中以P-value≤0.05 為閾值，滿足此條件的KEGG 通路定義為在差異代謝物中顯著富集的KEGG 通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 淹水脅迫下鴨茅根系形態(tài)變化

DB 和AB 鴨茅幼苗經(jīng)過淹水脅迫處理8 和24 h 后，與0 h 相比，兩種鴨茅的根系長勢變?nèi)?，地上部分有伸長生長的趨勢（圖1）。隨著淹水脅迫處理時(shí)間的延長，DB 的根系有變短趨勢，在24 h 時(shí)更加明顯，同時(shí)在24 h 時(shí)莖基部產(chǎn)生了不定根（圖1C），根系尖端逐漸變黑，但地上部分長勢無明顯變化。AB 根系逐漸減少，地上部分逐漸出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象（圖1F），二者由于耐澇性強(qiáng)弱差異而表現(xiàn)出不同程度的澇害癥狀。

圖1 鴨茅幼苗在淹水脅迫下的形態(tài)特征Fig.1 Appearance characteristics of orchard grass seedlings under submergence stress

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

樣品的重復(fù)相關(guān)性是檢驗(yàn)測序結(jié)果是否可靠以及樣本的選擇是否合理的重要判斷依據(jù)，相關(guān)性分析可以評估組內(nèi)樣品之間的生物學(xué)重復(fù)，同時(shí)組內(nèi)樣品相對組間樣品的相關(guān)系數(shù)越高，獲得的差異代謝物越可靠。以斯皮爾曼等級相關(guān)系數(shù)（spearman rank correlation，r）作為生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性的評估指標(biāo)，r2越接近1，說明重復(fù)樣品相關(guān)性越強(qiáng)。如圖2 所示，2 個(gè)品種各3 個(gè)處理組6 個(gè)重復(fù)組間的相關(guān)系數(shù)均接近1，這表明組內(nèi)樣品的重復(fù)性較好，可以用于后續(xù)分析。

圖2 樣品間相關(guān)性圖Fig.2 Correlation diagram between samples

對獲得的各比較組之間的所有差異代謝物進(jìn)行層次聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA），將差異代謝物相對定量值進(jìn)行歸一化轉(zhuǎn)換并聚類分組，從而將表達(dá)模式相似的代謝物歸類，歸為同組的代謝物可能會具有相似的生物學(xué)功能或參與相同的代謝途徑，可以在此基礎(chǔ)上推測已知和未知代謝物的功能。如圖3 所示，DB組和AB 組樣本被明顯的分為2 類：第一類是DB0h、DB8h、DB24h；第二類是AB0h、AB24h、AB8h。說明2 個(gè)品種在淹水脅迫下代謝物存在差異。綜合來看，DB 組和AB 組在經(jīng)過淹水脅迫處理后0、8 和24 h 時(shí)的代謝物均有不同程度的變化，每個(gè)組的不同時(shí)間點(diǎn)都存在著明確高表達(dá)和低表達(dá)的區(qū)域。

圖3 差異代謝物聚類熱圖Fig.3 The clustering heat map of differential metabolites

2.3 PCA 和PLS-DA 分析

采用PCA 的方法，觀察兩組樣本之間的總體分布趨勢。如圖4 所示，DB0h和DB8h組內(nèi)，2 組組間樣本被明顯區(qū)分開，PC1 解釋了總變量的20.64%，PC2 解釋了總變量的16.48%；DB0h和DB24h組內(nèi)重復(fù)樣本之間距離較近，而組間樣本明顯分離，PC1 解釋了總變量的24.65%，PC2 解釋了總變量的17.80%；如圖5 所示，AB0h和AB8h2 組組間樣本可以區(qū)分開，PC1 解釋了總變量的22.40%，PC2 解釋了總變量的16.09%；AB0h和AB24h組間樣本被明顯分離，PC1 解釋了總變量的23.54%，PC2 解釋了總變量的17.11%；總體來看，不同淹水脅迫處理時(shí)間下，處理組間的代謝差異明顯，代謝調(diào)控不同。PLS-DA 是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法，PLS-DA 通過建立差異表達(dá)代謝物與樣本種類之間的關(guān)系模型來對樣本類別進(jìn)行預(yù)測。若R2和Q2越接近1，表明此模型越穩(wěn)定且具有較高的可信度；如圖6 和圖7 所示，各組中R2和Q2分別為0.95 和0.71、0.93 和1.11、0.92 和0.87、0.94 和0.74，均比較接近1，結(jié)果表明建立的模型能反映樣本的真實(shí)情況，模型的可靠性較高，試驗(yàn)誤差小。

圖4 DB 組主成分分析Fig.4 DB group principal component analysis

圖5 AB 組主成分分析Fig.5 AB group principal component analysis

圖6 DB 組PLS-DA 模型置換檢驗(yàn)結(jié)果Fig.6 DB group PLS-DA model substitution test result

圖7 AB 組PLS-DA 模型置換檢驗(yàn)結(jié)果Fig.7 AB group PLS-DA model substitution test result

2.4 差異代謝物篩選及分析

用T檢驗(yàn)（T-test）、偏最小二乘法判別方法的VIP（variable importance in the projection）值和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）相結(jié)合的方法來篩選差異代謝物，表1 統(tǒng)計(jì)了篩選條件（VIP＞1.0，F(xiàn)C＞1.2 或FC＜0.833 且Pvalue＜0.05）下各處理組合的差異代謝物數(shù)目。淹水脅迫處理后DB8hvs DB0h組篩選出了120 個(gè)差異代謝物（64個(gè)上調(diào)，56 個(gè)下調(diào)）；DB24hvs DB0h組篩選出155 個(gè)差異代謝物（60 個(gè)上調(diào)，95 個(gè)下調(diào)）；AB8hvs AB0h組篩選出93 個(gè)顯著差異代謝物（49 個(gè)上調(diào)，44 個(gè)下調(diào)）；AB24hvs AB0h組篩選出118 個(gè)顯著差異代謝物（60 個(gè)上調(diào)，58 個(gè)下調(diào)）；DB0hvs AB0h組篩選出了80 個(gè)差異代謝物（23 個(gè)上調(diào)，57 個(gè)下調(diào)）；DB8hvs AB8h組篩選出125 個(gè)差異代謝物（77 個(gè)上調(diào)，48 個(gè)下調(diào)）；DB24hvs AB24h組篩選出48 個(gè)差異代謝物（19 個(gè)上調(diào)，29 個(gè)下調(diào)）。淹水脅迫處理不同時(shí)間后，DB 和AB 兩個(gè)處理組間各自共有差異代謝物59 和42 個(gè)，而DB 和AB 兩個(gè)處理組在同一時(shí)間點(diǎn)共有差異代謝物8 個(gè)（圖8）。綜合來看，DB 組的差異代謝物始終較AB 組多，隨著淹水脅迫時(shí)間的延長，差異代謝物也逐漸增多。

表1 代謝物數(shù)目統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistical result of metabolites

圖8 各對比組差異代謝物韋恩圖Fig.8 Differences in metabolism among groups Venn diagram

圖9 展示了各組P-value 值前20 的差異代謝物，DB8hvs DB0h組15 個(gè)差異代謝物上調(diào)，5 個(gè)差異代謝物下調(diào)；DB24hvs DB0h組14 個(gè)差異代謝物上調(diào)，6 個(gè)差異代謝物下調(diào)；AB8hvs AB0h組11 個(gè)差異代謝物上調(diào)，9 個(gè)差異代謝物下調(diào)；AB24hvs AB0h組11 個(gè)差異代謝物上調(diào)，9 個(gè)下調(diào)；DB0hvs AB0h組P-value 值前20 的差異代謝物均為下調(diào)；DB8hvs AB8h組16 個(gè)差異代謝物上調(diào)，4 個(gè)差異代謝物下調(diào)；DB24hvs AB24h組6 個(gè)差異代謝物上調(diào)，14 個(gè)差異代謝物下調(diào)。表2 對各組P-value 值前20 的差異代謝物進(jìn)行了分類與統(tǒng)計(jì)，綜合7 個(gè)組篩選出的物質(zhì)較活躍的有4 類，即脂肪酸和綴合物、黃酮類化合物、氨基酸、多肽和類似物、糖及其衍生物，其中GABA 和茉莉酸（jasmonic acid，JA）等代謝物在前4 個(gè)處理組都存在，GABA 作為一種氨基酸參與鴨茅對淹水脅迫的響應(yīng)，JA 是一種植物激素，在鴨茅遭遇淹水脅迫時(shí)其含量減少，淹水脅迫阻礙了JA 的合成，而在同一處理時(shí)間的種間比較組發(fā)現(xiàn)在淹水處理8 h 時(shí)上調(diào)差異代謝物相比24 和0 h 時(shí)數(shù)目最多，顯然在淹水處理8 h 時(shí)DB 鴨茅做出了更為積極的響應(yīng)。上述結(jié)果表明這些差異代謝物可能與鴨茅根系響應(yīng)淹水脅迫的機(jī)制存在一定的相關(guān)性，這些差異代謝物參與到響應(yīng)淹水脅迫過程中，并在其中發(fā)揮著重要的作用。

表2 各組差異代謝物數(shù)目分類統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistical result of difference of metabolite number in each group

圖9 各組差異代謝物統(tǒng)計(jì)Fig.9 Statistical result of metabolites between groups

2.5 差異代謝物KEGG 富集分析

通過KEGG 富集分析，能夠識別參與差異代謝物過程的重要生化代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。富集結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，7 個(gè)比較組的差異代謝物主要富集在氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔助因子和維生素的代謝以及其他次生代謝產(chǎn)物生物合成這4 個(gè)代謝途徑中（表3）。DB8hvs DB0h組注釋到39 條代謝通路，DB24hvs DB0h組注釋到45 條代謝通路；AB8hvs AB0h組注釋到了48 條代謝通路；AB24hvs AB0h組注釋到57 條代謝通路；DB0hvs AB0h組注釋到22 條代謝通路；DB8hvs AB8h組注釋到24 條代謝通路；DB24hvs AB24h組注釋到14 條代謝通路。進(jìn)一步將富集到的前10 條代謝物通路繪制為KEGG 富集氣泡圖（圖10）：DB8hvs DB0h組富集到的通路主要是泛酸鹽和CoA 生物合成、色氨酸代謝、β-丙氨酸代謝和類黃酮生物合成以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；DB24hvs DB0h組富集到的通路主要是丙酸代謝、α-亞油酸代謝、類黃酮生物合成以及抗壞血酸和藻酸鹽代謝；AB8hvs AB0h組富集到的通路主要是氨基糖和核苷酸糖代謝、氨酰-tRNA 生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝以及硫代葡萄糖苷生物合成；AB24hvs AB0h組富集到的主要通路是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、色氨酸代謝、丙酸代謝以及硫代葡萄糖苷生物合成代謝途徑；DB0hvs AB0h組富集到的主要通路是ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)因子、β-丙氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝以及二萜生物合成代謝途徑；DB8hvs AB8h組富集到的主要通路是ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)因子、抗壞血酸和藻酸鹽代謝以及淀粉和蔗糖代謝途徑；DB24hvs AB24h組富集到的主要通路是淀粉和蔗糖代謝、核黃素代謝、類黃酮生物合成以及黃酮和黃酮醇的生物合成代謝途徑。

表3 各組KEGG 通路統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistical result of KEGG pathway for each group

圖10 KEGG 富集氣泡圖Fig.10 KEGG enrichment bubble diagram

為了進(jìn)一步挖掘與本研究相關(guān)的差異代謝物，在KEGG 富集分析后，將參與主要代謝通路的差異代謝物挑選出來，做進(jìn)一步的分析（表4）。對各處理組富集的主要代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，在DB 組中所涉及較多的差異代謝物是黃酮類化合物，分別是：橙皮素、甘草素、芹黃素、新橙皮苷、柚皮素和柚皮苷，參與的代謝途徑是類黃酮生物合成途徑；而在AB 組中所涉及較多的差異代謝物是氨基酸及其衍生物，分別是：O-磷酸-L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸和色氨酸，參與的代謝途徑是氨酰-tRNA 生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、硫代葡萄糖苷生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及色氨酸代謝途徑；在DB 和AB 對比組中發(fā)現(xiàn)DB 的特異性差異代謝物是碳水化合物、氨基酸及其衍生物和黃酮類化合物，分別是蔗糖、異麥芽糖、6-磷酸海藻糖、L-鳥氨酸、L-組氨酸、D-鳥氨酸和芹菜素，參與的代謝途徑分別是ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)因子、淀粉和蔗糖代謝、β-丙氨酸代謝、類黃酮生物合成以及黃酮和黃酮醇的生物合成代謝途徑。上述代謝物可能在鴨茅響應(yīng)淹水脅迫中發(fā)揮重要作用，而在2 個(gè)組中不同的差異代謝物可能也是DB 和AB 耐澇性存在差異的原因。

表4 各組主要KEGG 通路注釋Table 4 Annotation of the main KEGG pathways for each group

3 討論

3.1 淹水脅迫對鴨茅根系形態(tài)的影響

淹水脅迫下植物會出現(xiàn)生長損傷和表型的變化，且根系指標(biāo)（長度、面積、生物量）比地上部指標(biāo)（枝條高度和生物量）更容易受到影響［34］，植物受淹后根系是第一個(gè)面臨低氧脅迫的器官，根系細(xì)胞的有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧呼吸，一系列無氧呼吸產(chǎn)物如乙醇、乙醛和乳酸等大量積累，打破細(xì)胞代謝穩(wěn)定，導(dǎo)致根系細(xì)胞死亡，黑根（水漬根）數(shù)量也會隨之增加［35］。本研究中，隨著淹水脅迫處理時(shí)間的延長，鴨茅根系逐漸減少，根系細(xì)胞也因?yàn)闊o氧呼吸產(chǎn)物的積累，導(dǎo)致根系尖端變黑，地上部分有伸長生長的趨勢，但在淹水脅迫處理24 h 時(shí)，AB 地上部分逐漸萎蔫，而DB 則無明顯變化，這可能是二者耐澇性強(qiáng)弱不同所致。淹水脅迫后在植株的莖基部會形成不定根以取代因缺氧而窒息死亡的初生根，從而提高植物的耐淹能力［36］，在淹水脅迫24 h 時(shí)，耐澇型的DB 鴨茅在莖基部產(chǎn)生了不定根（adventitious roots，ARs），以代替初生根，緩解根尖的缺氧脅迫，而澇敏型的AB 鴨茅則沒有明顯的不定根產(chǎn)生，受到澇害沒有得到很好的緩解，可見不同品種的鴨茅由于耐澇性強(qiáng)弱差異出現(xiàn)不同程度澇害癥狀。

3.2 淹水脅迫對鴨茅根系差異代謝物的影響

代謝組學(xué)可以解釋生物系統(tǒng)與其環(huán)境之間的相互作用以及所有相關(guān)的變化，是研究植物抗逆機(jī)制的方法之一，代謝物對植物生物量和結(jié)構(gòu)的影響是植物代謝中不可缺少的組成部分［37-38］。本研究利用LC-MS 方法對淹水脅迫下不同處理時(shí)間的兩種鴨茅根部進(jìn)行代謝組學(xué)分析。在前4 個(gè)處理組中，共獲得486 個(gè)差異代謝物，DB 組275 個(gè)，AB 組211 個(gè)。其中DB 在淹水脅迫8 h 時(shí)有120 個(gè)差異代謝物，在24 h 時(shí)有155 個(gè)差異代謝物；AB 在淹水脅迫8 h 時(shí)有93 個(gè)差異代謝物，在24 h 時(shí)有118 個(gè)差異代謝物。隨著淹水脅迫時(shí)間的延長，兩種鴨茅的差異代謝物也隨之增多，說明鴨茅對淹水脅迫做出了積極的響應(yīng)。但相對耐澇品種DB 的差異代謝物始終比相對不耐澇的AB 多，在短期脅迫下，DB 的代謝更加旺盛，對淹水脅迫的響應(yīng)也更加積極。有研究也發(fā)現(xiàn)澇敏型植物對淹水脅迫的響應(yīng)沒有耐澇型植物積極，代謝物也存在差異［39-40］。

新陳代謝是由生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)組成的，這些反應(yīng)在生物體內(nèi)產(chǎn)生各種各樣的有機(jī)化合物，植物的代謝可分為初級代謝和次級代謝，脂類和氨基酸途徑等初級代謝產(chǎn)生的低分子量有機(jī)分子直接參與植物的基本生命功能，對植物的生長、發(fā)育和生存至關(guān)重要［41-42］。本研究中7 個(gè)組篩選出的差異代謝物較活躍的有4 類，即：脂肪酸和綴合物、黃酮類化合物、氨基酸、多肽和類似物和糖及其衍生物，且大量的氨基酸類、有機(jī)酸類和黃酮類上調(diào)。這些物質(zhì)在鴨茅響應(yīng)淹水脅迫的過程中發(fā)揮了重大的作用。時(shí)羽杰等［43］發(fā)現(xiàn)淹水脅迫下藜麥（Chenopodium quinoa）花期產(chǎn)生的差異代謝物主要是氨基酸類、有機(jī)酸類、脂肪酸類和糖類，其中苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸是抗淹水脅迫的關(guān)鍵代謝物質(zhì)。吳棟等［32］分析水澇脅迫下煙草的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的主要差異代謝物是氨基酸類和有機(jī)酸類。

GABA 是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，對提高植物的抗逆性具有重要作用［44］，對緩解植物低氧脅迫損傷有重要作用。植物淹水脅迫的主要表現(xiàn)有低氧脅迫和缺氧脅迫2 個(gè)部分［45］，吳曉蕾等［46］采用水培法研究外源GABA 對甜瓜（Cucumis melo）植株在低氧脅迫下活性氧代謝的影響，證實(shí)外源GABA 可通過提高植株體內(nèi)抗氧化酶活性，從而促進(jìn)甜瓜的耐低氧能力。章垚琪等［47］分析厭氧處理對黃茶（Camellia sinensiso）葉中GABA 以及其他活性成分的含量和功能的影響，發(fā)現(xiàn)厭氧處理后黃茶中GABA 的含量大幅升高，經(jīng)代謝組學(xué)分析共篩選出218 種差異代謝物，包括氨基酸類、有機(jī)酸類、類黃酮和核苷酸等。當(dāng)植物受到非生物脅迫時(shí)，GABA 會大量積累，GABA 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH 值、離子運(yùn)輸、激活抗氧化系統(tǒng)和清除活性氧，增強(qiáng)了植物對非生物脅迫的耐受性，GABA 已經(jīng)成為提高植物非生物耐受性的有效化合物［48］。本研究中有4 個(gè)處理組在不同時(shí)間淹水脅迫處理下的差異代謝物中都出現(xiàn)了GABA，由此推測鴨茅可能通過積累GABA 來抵抗淹水脅迫。

植物次生代謝物可以改變根系微生物組成和功能［49］，這些次生代謝物屬于不同的類別，其中最突出的是黃酮類化合物［50］和JA［51］等物質(zhì)，JA 參與非生物脅迫產(chǎn)生的防御反應(yīng)［52］，Xu 等［53］發(fā)現(xiàn)，在澇漬敏感黃瓜（Cucumissativus）品系Pepino 的下胚軸中JA 含量在淹水2 d 后約為對照組的2 倍，而耐澇品種‘Zaoer-N’的下胚軸JA 含量在淹水過程中顯著降低，JA 含量與植物耐澇性可能呈負(fù)相關(guān)。淹水條件下，同一植物不同組織中JA 含量也會存在差異［36］，例如柑橘（Comamonas testosteroni）葉片JA 含量在淹水條件下顯著高于對照，但根系JA 含量卻急劇下降［54］。本研究中，JA 在4 個(gè)處理組中都下調(diào)，這可能是由于在缺氧條件下抑制JA 合成途徑的關(guān)鍵酶引起的。由此可以推測鴨茅在應(yīng)對淹水脅迫時(shí)，也通過這些次生代謝物改變其根系的微生物組成和功能來適應(yīng)逆境。

本研究在DB 組中8 和24 h 共同注釋到的主要通路是類黃酮生物合成途徑，類黃酮是植物重要的次生代謝物，具有抗氧化、自由基清除等功能，參與植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)過程［55］，非生物脅迫下植物細(xì)胞會產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS），從而對植物造成嚴(yán)重的氧化傷害。植物在長期進(jìn)化中能合成多種酶促和非酶促ROS 清除劑，后者包括黃酮類化合物［56］。Ma 等［57］通過廣泛靶向代謝組學(xué)分析淹水脅迫對菊花中黃酮類化合物合成的影響，發(fā)現(xiàn)淹水脅迫可以通過影響黃酮類合成途徑中相應(yīng)關(guān)鍵酶的表達(dá)來改變類黃酮的積累。姜百惠［58］對降香黃檀（Dalbergia odorifera）幼苗進(jìn)行了淹水脅迫和鹽脅迫，代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)淹水脅迫后產(chǎn)生的差異代謝物顯著大幅度上調(diào)的為黃酮類化合物，注釋到的KEGG 代謝通路主要是類黃酮生物合成途徑、新陳代謝途徑和次生代謝物的生物合成途徑。在本研究中隨著淹水脅迫時(shí)間的延長，DB 組始終通過類黃酮生物合成途徑等其他代謝途徑影響對脅迫的應(yīng)答機(jī)制。而在AB 組中則沒有注釋到類黃酮生物合成途徑，這或許是DB 比AB更耐澇的原因之一。在前4 個(gè)處理組中，富集到最多的代謝通路是氨基酸代謝途徑，植物在遭遇逆境脅迫時(shí)，會通過對氨基酸的合成和降解，來減輕逆境脅迫所帶來的危害，植物響應(yīng)淹水脅迫的代謝調(diào)控方式包括氨基酸代謝、碳代謝和氮代謝等［59］。在淹水脅迫下，紫花苜蓿氨基酸代謝相關(guān)的基因和代謝物被激活［60］，以調(diào)節(jié)維持正常的生理活動。Ma 等［57］研究發(fā)現(xiàn)黃條早竹（Phyllostachys praecox）的根部在缺氧脅迫下，磷脂和氨基酸是其主要代謝產(chǎn)物，脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝是機(jī)體響應(yīng)缺氧應(yīng)激的關(guān)鍵途徑。在本研究中也發(fā)現(xiàn)鴨茅通過大量的氨基酸代謝途徑來應(yīng)對淹水脅迫。此外，在DB 對比AB 的3 個(gè)組中發(fā)現(xiàn)了較多的差異代謝物是碳水化合物、氨基酸及其衍生物和黃酮類化合物，分別是蔗糖、異麥芽糖、6-磷酸海藻糖、L-鳥氨酸、L-組氨酸、D-鳥氨酸和芹菜素，參與的代謝途徑分別是ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)因子、淀粉和蔗糖代謝、β-丙氨酸代謝、類黃酮生物合成以及黃酮和黃酮醇的生物合成代謝途徑，推測這些差異代謝物是DB 比AB 更積極響應(yīng)淹水脅迫的原因之一。在鴨茅應(yīng)對淹水脅迫時(shí)，黃酮類化合物柚皮素、柚皮素查爾酮和芹黃素以及氨基酸及其衍生物γ-氨基丁酸、L-酪氨酸和色氨酸可能發(fā)揮著更重要的作用，在后續(xù)的研究中需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究對淹水脅迫不同時(shí)間后的兩個(gè)品種鴨茅根系代謝物進(jìn)行了分析。通過分析耐澇型和澇敏型鴨茅在不同脅迫處理時(shí)間下的差異代謝物和主要差異代謝物類型，發(fā)現(xiàn)隨著淹水脅迫時(shí)間的延長DB 和AB 組的代謝物都發(fā)生了變化，篩選出的差異代謝物較活躍的有4 類物質(zhì)，即脂肪酸和綴合物、黃酮類化合物、氨基酸、多肽和類似物和糖及其衍生物，且大量的氨基酸類（GABA、L-酪氨酸和色氨酸）和黃酮類（柚皮素、柚皮素查爾酮和芹黃素）上調(diào)，這些上調(diào)的代謝物可能是參與鴨茅抵御淹水脅迫的關(guān)鍵物質(zhì)。本研究為進(jìn)一步研究代謝物的基因調(diào)控作用以及全面解析鴨茅抵御淹水脅迫的代謝途徑提供參考。在實(shí)際生產(chǎn)中，可以考慮通過添加外源GABA 來減輕鴨茅受到的淹水侵害，但要更加注意在苗期的水分管理，避免長期淹水導(dǎo)致鴨茅的產(chǎn)量和品質(zhì)下降。