宋夢(mèng)瑤,錢 程,陸 茵,2

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210023)

作為威脅全球女性生命健康的頭號(hào)殺手,乳腺癌的治療一直成為臨床長(zhǎng)久未解決的問(wèn)題。免疫療法的出現(xiàn)為癌癥治療帶來(lái)了新的曙光,然而多年臨床治療結(jié)果顯示,腫瘤在發(fā)展過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)多種免疫逃避機(jī)制,某些癌癥類型天生就比其他類型的癌癥更善于“隱藏”。隨著對(duì)腫瘤免疫監(jiān)視的深入了解,部分類型癌癥,如黑色素瘤、膀胱癌和腎細(xì)胞癌,已被證明對(duì)免疫治療干預(yù)有持久的反應(yīng),然而,乳腺癌并未顯示出相同的治療效果。乳腺癌被認(rèn)為是一種免疫沉默的腫瘤,原因來(lái)自于較弱的免疫識(shí)別能力和強(qiáng)烈的免疫抑制機(jī)制[1-2]。

免疫細(xì)胞具有重要的輔助功能,并影響乳腺癌患者的術(shù)后康復(fù),高免疫浸潤(rùn)對(duì)乳腺癌的治療與恢復(fù)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的相關(guān)性,免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度可有效評(píng)估乳腺癌的預(yù)后與化療效果[3]。乳腺癌自身低免疫原性、T細(xì)胞浸潤(rùn)低以及腫瘤微環(huán)境中免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)已被確定為乳腺癌逃避免疫治療的潛在機(jī)制與挑戰(zhàn)[4]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages,TAMs)和腫瘤浸潤(rùn)樹突狀細(xì)胞(tumor infiltrating dendritic cells,TIDCs)可以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[5],而高CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)在三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)患者中展現(xiàn)出更高的存活率[6]。因此,免疫療法仍然是一種很有前途的乳腺癌治療策略。

大量臨床及臨床前證據(jù)表明,乳腺癌處于免疫監(jiān)視之下,免疫系統(tǒng)和乳腺癌之間復(fù)雜的相互作用研究仍處于起步階段?；诿庖攮h(huán)境的復(fù)雜性,單一療法可能并不能提供最有效的治療方式,目前面臨的挑戰(zhàn)是不斷尋找針對(duì)乳腺癌產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)的策略和方法。早期臨床使用抗血管生成藥、化療等方式與免疫抑制劑聯(lián)合治療,近幾年針對(duì)改變免疫微環(huán)境,如減少巨噬細(xì)胞瘤內(nèi)趨化與恢復(fù)其殺傷、吞噬功能的治療方式陸續(xù)出現(xiàn),并進(jìn)入臨床[1]。因此,從改變巨噬細(xì)胞數(shù)量及功能入手,中醫(yī)藥中活血化瘀法也存在相似的功效。中藥丹參及其各活性成分治療乳腺癌的研究層出不窮,現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)丹參對(duì)乳腺癌有治療作用[7]。丹參總酚酸(total salvianolic acid,TSA)如丹酚酸B、迷迭香酸、丹酚酸A等可有效抑制腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移[8-10],然而其對(duì)免疫微環(huán)境的研究仍較為匱乏,本文通過(guò)構(gòu)建惡性程度較高、免疫反應(yīng)較低的E0771乳腺癌小鼠模型,考察TSA增強(qiáng)anti-PD-L1的作用方式,為臨床合理使用TSA治療癌癥提供參考價(jià)值。

1 材料

1.1 細(xì)胞株鼠源乳腺癌細(xì)胞株E0771細(xì)胞由江蘇省藥效與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,并傳代培養(yǎng)。

1.2 動(dòng)物6周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6 J小鼠25只,體質(zhì)量(20±2) g,購(gòu)買自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(滬)2017-0005,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定,動(dòng)物倫理號(hào):202109A016。常規(guī)飼養(yǎng):自由飲食飲水,溫度(23±2) ℃,相對(duì)濕度53%±2%,12 h黑暗光照周期,適用性飼養(yǎng)1周。

1.3藥物 丹參飲片購(gòu)自江蘇省中醫(yī)院。

1.4 試劑DMEM培養(yǎng)基(Gibco,31800-022),FBS(Cellmax,SA301.02),一次性無(wú)菌注射器(上海米沙瓦醫(yī)科,20180202),異氟烷(瑞沃德,R510-22-10),anti-PD-L1單抗(BioXCell,BE0101),IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒(Biolegend,431304),MCP-1酶聯(lián)免疫試劑盒(Biolegend,432704),CD45-PerCP/Cyanine5.5(Biolegend,103132),CD11b-APC(Biolegend,101211),F4/80-PE/Cyanine7(Biolegend,123113),CD8-PE(Biolegend,100708),CD4-APC(Biolegend,100412),F4/80(proteintech,KHC0208),鼠兔通用二步免疫組化檢測(cè)試劑盒(中杉金橋,PV-9000),DAB顯色試劑盒(中杉金橋,ZLI-9018),Hiscript RT Super Mix for qPCR(Vazyme,R323-01),ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme,Q331-02)。

1.5 儀器CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific,Forma 3111),流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD,FACSCalibur),酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-tek,Synergy2),游標(biāo)卡尺(斑馬器材,Hc0494),分析天平(Sartorius,BSA224S-CW)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)E0771細(xì)胞使用10 % FBS+DMEM培養(yǎng)基,置于含5 % CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng),平均1～2 d傳代1次。

2.2 TSA的制備丹參采用唇形科鼠尾草屬植物丹參SalviamiltiorrhizaBudge.的干燥根及根莖飲片。TSA制備過(guò)程如下:使用天平稱取丹參飲片500 g置于圓底燒瓶?jī)?nèi),加入1.5 L雙蒸水,80 ℃加熱提取2次,每次提取2 h。合并提取液紗布過(guò)濾,濃縮至清膏,放冷,加入乙醇至含醇量為70%,靜置12 h,取上清,減壓回收乙醇并濃縮至稠膏,冷凍干燥,稱質(zhì)量共得132.017 0 g凍干粉,計(jì)算得率為26.034%。

2.3 E0771腫瘤模型的建立取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期E0771細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液密度為5×106個(gè)/mL。對(duì)20只小鼠異氟烷麻醉后,每只左側(cè)腋下淋巴結(jié)附近注射0.1 mL細(xì)胞懸液。

2.4 分組與給藥5 d后造模小鼠均長(zhǎng)出手指可觸的皮下腫瘤。將25只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、TSA組、anti-PD-L1組、TSA+anti-PD-L1組,每組5只?？瞻捉M、模型組小鼠每日給予雙蒸水灌胃;TSA組小鼠每日灌胃給藥10 g·kg-1TSA;anti-PD-L1組小鼠每3天腹腔注射給藥10 mg·kg-1anti-PD-L1;TSA+anti-PD-L1聯(lián)合組每日灌胃給藥10 g·kg-1TSA,且每3天腹腔注射10 mg·kg-1anti-PD-L1,連續(xù)給藥14 d。

2.5 腫瘤重量及體積測(cè)量小鼠最后一次給藥結(jié)束后,分析天平稱量并記錄腫瘤質(zhì)量。每4天使用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠腫瘤大小并記錄。腫瘤體積計(jì)算公式:腫瘤體積=a×b2/2,“a”為最大寬度,“b”為最小寬度。

2.6 臟器指數(shù)計(jì)算分析天平稱取記錄小鼠脾臟、肝臟重量,根據(jù)公式對(duì)每只小鼠臟器指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。臟器指數(shù)=臟器(mg)/體質(zhì)量(g)×100%。

2.7 ELISA檢測(cè)血漿IL-6、MCP-1含量按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作如下:黏附96孔板每孔中加入100 μL稀釋后的捕獲抗體,4 ℃孵育過(guò)夜。8 h后棄掉板內(nèi)溶液,每孔加入300 μL 洗滌液拍洗4遍,每孔加入200 μL檢測(cè)稀釋液,500 r·min-1室溫振搖1 h。棄板內(nèi)溶液,洗板×4。按照預(yù)先布板分別加入100 μL梯度稀釋后的標(biāo)品和血漿樣品,振搖2 h。棄板內(nèi)溶液,洗板×4,每孔加入100 μL檢測(cè)抗體,500 r·min-1室溫振搖1 h。棄板內(nèi)溶液,洗板×4,每孔加入100 μL標(biāo)記親和素(horseradish peroxidase,HRP),室溫振搖30 min。棄板內(nèi)溶液,洗板×5,室溫避光孵育15 min,每孔加入100 μL終止液,450 nm處檢測(cè)吸光度。

2.8 流式細(xì)胞術(shù)取小鼠脾臟組織、腫瘤接種側(cè)腋下淋巴(引流淋巴結(jié))及腫瘤組織進(jìn)行檢測(cè)。脾臟、淋巴:使用1×PBS研磨過(guò)70目篩網(wǎng),收集上述細(xì)胞懸液,4 ℃,1 500 r·min-1離心10 min,棄上清。每管加入2 mL紅細(xì)胞裂解液,避光室溫裂解5 min后離心,1×PBS洗滌,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,加入8 mL 1×PBS重懸,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,加入對(duì)應(yīng)抗體,4 ℃避光孵育40 min,1 000 r·min-1離心5 min,100 μL 1×PBS重懸,上機(jī)檢測(cè)。

腫瘤組織:取各組乳腺癌腫瘤組織1 cm3,剪碎后轉(zhuǎn)移至15 mL EP管,加入5 mL腫瘤組織消化液進(jìn)行消化,37 ℃搖床振搖40 min,每間隔10 min吹打一次。隨后加入等體積預(yù)冷的完全培養(yǎng)基終止消化。過(guò)70目篩網(wǎng)后1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,10 mL FACS-EDTA洗滌,1 000 r·min-1離心5 min,FACS-EDTA重懸,離心,加入對(duì)應(yīng)抗體,4 ℃避光孵育40 min,離心5 min,100 μL 1×PBS重懸,上機(jī)檢測(cè)。

2.9 免疫組化切取4 μm厚石蠟切片,75 ℃烤片5 h。二甲苯-無(wú)水乙醇-95 %乙醇-80 %乙醇-75 %乙醇-30 %乙醇依次復(fù)水,1×PBS洗滌3 min×3,抗原修復(fù),洗滌,內(nèi)源性過(guò)氧化物酶清除10 min,洗滌,3% BSA封閉1 h,洗滌,一抗4 ℃孵育過(guò)夜,洗滌,按照試劑盒說(shuō)明,分別滴加試劑2、試劑3,洗滌,滴加DAB顯色,流水沖洗5 min,蘇木精染色2 min,鹽酸分化20 s,流水沖洗5 min。30 %乙醇-50 %乙醇-75 %乙醇-80 %乙醇-95 %乙醇-無(wú)水乙醇-甲苯依次脫水,中性樹脂封片固定,顯微鏡下拍照。

2.10 qPCR稱取80 mg腫瘤組織加入研磨EP管,1 mL TRIzol裂解至組織消失。取勻漿每管加入200 μL氯仿,劇烈振搖15 s,室溫靜置3 min,12 000 r·min-1,4 ℃,離心15 min。吸取上層水相加入等量異丙醇,來(lái)回顛倒,室溫靜置3 min,12 000 r·min-1,4 ℃,離心15 min。棄上清,1 mL 75 %乙醇洗滌,7 500 r·min-1,4 ℃,離心10 min。棄上清,置于通風(fēng)櫥內(nèi)干燥至透明。加入30 μL DEPC水溶解RNA,55 ℃孵育10 min。Nano DropTMOne /One C檢測(cè)RNA濃度及純度,將樣本稀釋為500 g·L-1。按試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)成cDNA,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見Tab 1,點(diǎn)板,上機(jī)。

Tab 1 Primer sequence

3 結(jié)果

3.1 TSA聯(lián)合anti-PD-L1顯著降低乳腺癌小鼠腫瘤重量與模型組相比,TSA組、anti-PD-L1組、TSA+anti-PD-L1組小鼠乳腺癌腫瘤重量均明顯下降(P<0.01)。與單獨(dú)使用anti-PD-L1組相比,TSA+ anti-PD-L1組效果更佳顯著(P<0.05),見Tab 2。

Tab 2 Effect of TSA+anti-PD-L1 on weight of E0771 subcutaneous tumor in each group (n=5)

3.2 TSA聯(lián)合anti-PD-L1減緩小鼠腫瘤體積增長(zhǎng)如Fig 1所示,接種E0771乳腺癌細(xì)胞后,腫瘤體積增長(zhǎng)數(shù)據(jù)顯示,與模型組相比,TSA組、anti-PD-L1組均可有效抑制腫瘤增長(zhǎng)(P<0.01),而TSA+anti-PD-L1組抑制腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)程更加顯著,與單獨(dú)使用anti-PD-L1相比,TSA+ anti-PD-L1組抑制腫瘤增長(zhǎng)過(guò)程明顯(P<0.05)。

Fig 1 The tumor volume growth in each group(n=5)

3.3 TSA聯(lián)合anti-PD-L1對(duì)乳腺癌小鼠脾臟、肝臟臟器指數(shù)的影響與正常小鼠相比,模型組小鼠脾臟指數(shù)明顯升高(P<0.01),病理表現(xiàn)為脾臟腫大。與模型組、anti-PD-L1組相比,TSA聯(lián)合anti-PD-L1能有效降低小鼠脾臟指數(shù)(P<0.01),TSA組、anti-PD-L1組小鼠脾臟指數(shù)改變差異無(wú)顯著性。同時(shí),無(wú)論是模型組還是TSA組、anti-PD-L1組,小鼠肝臟指數(shù)均未見影響,見Tab 3。

Tab 3 Spleen and liver organ index of mice in each group (n=5)

3.4 TSA聯(lián)合anti-PD-L1減少小鼠血清IL-6,MCP-1分泌與空白組相比,模型組小鼠血清內(nèi)IL-6,MCP-1分泌含量明顯增加(P<0.01)。與模型組相比,TSA組、anti-PD-L1組及TSA+anti-PD-L1組給藥后可明顯減少小鼠血清內(nèi)IL-6,MCP-1含量(P<0.01),且TSA+anti-PD-L1組較anti-PD-L1組效果顯著(P<0.05),見Tab 4。

Tab 4 Effect of TSA+anti-PD-L1 on IL-6, MCP-1 secretion in serum in each group (n=5)

3.5 TSA聯(lián)合anti-PD-L1減少小鼠腫瘤組織內(nèi)巨噬細(xì)胞相關(guān)趨化因子mRNA表達(dá)與模型組相比,TSA組、anti-PD-L1組及TSA+anti-PD-L1組均可降低小鼠腫瘤組織內(nèi)與巨噬細(xì)胞趨化相關(guān)因子cxcl1,cxcl2,cxcl3,ccl2,gm-csfmRNA的表達(dá),且TSA與anti-PD-L1聯(lián)合給藥較anti-PD-L1單獨(dú)給藥相比cxcl2,cxcl3,ccl2表達(dá)水平下降顯著,見Fig 2。

3.6 TSA聯(lián)合anti-PD-L1對(duì)小鼠淋巴及脾臟內(nèi)CD4+,CD8+T細(xì)胞數(shù)量的影響通過(guò)流式檢測(cè)各組小鼠淋巴及脾臟內(nèi)CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞數(shù)量,如Fig 3所示,模型組小鼠淋巴內(nèi)CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞數(shù)量與空白對(duì)照組相比未見顯著差異,而TSA聯(lián)合anti-PD-L1可增加CD4+T(P<0.01)與CD8+T細(xì)胞(P<0.05)在淋巴內(nèi)的數(shù)量。TSA與anti-PD-L1聯(lián)合給藥較anti-PD-L1單獨(dú)給藥相比效果更佳明顯(P<0.05)。在脾臟流式檢測(cè)結(jié)果中,與空白組相比,模型組小鼠CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.01),TSA+anti-PD-L1聯(lián)合使用有效恢復(fù)小鼠脾臟內(nèi)CD4+T細(xì)胞數(shù)量(P<0.05),同時(shí)使小鼠CD8+T細(xì)胞增加(P<0.05)。

Fig 2 Expression of cxcl1, cxcl2, cxcl3, ccl2, gm-csf in each group by qPCR (n=4)

3.7 TSA聯(lián)合anti-PD-L1抑制乳腺癌小鼠腫瘤、淋巴內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)如Fig 4所示,流式結(jié)果顯示TSA、anti-PD-L1、TSA+anti-PD-L1聯(lián)合給藥組均可一定程度上降低腫瘤組織內(nèi)髓源性巨噬細(xì)胞(CD11b+F4/80+)的浸潤(rùn),其中與模型組(P<0.01)、anti-PD-L1組(P<0.05)相比,TSA與anti-PD-L1聯(lián)合給藥后抑制小鼠髓源性巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)效果顯著,免疫組化顯示相似的結(jié)果(Fig 5)。同時(shí),對(duì)小鼠淋巴內(nèi)髓源性巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示TSA可減少淋巴內(nèi)髓源性巨噬細(xì)胞數(shù)量(P<0.05),TSA+anti-PD-L1聯(lián)合組小鼠淋巴內(nèi)髓源性巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.01),見Fig 6。

4 討論

乳腺癌免疫療法面臨的最大障礙是如何將非免疫原性腫瘤轉(zhuǎn)化為高免疫原性腫瘤,進(jìn)而產(chǎn)生臨床治療反應(yīng)[11]。腫瘤特異性T細(xì)胞上表達(dá)抑制性受體,例如PD-1和CTLA-4,會(huì)抑制其增殖及殺傷性細(xì)胞因子的分泌功能。使用靶向CTLA-4(ipilimumab)和PD-1/PD-L1(nivolumab/pembrolizumab)的單克隆抗體進(jìn)行免疫檢查點(diǎn)阻斷已被證明可有效治療多種惡性腫瘤。其中,抗PD-1/PD-L1抗體在黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌和其他腫瘤的治療中顯示出巨大前景[12-13]。臨床單獨(dú)使用PD-1/PD-L1抗體在治療乳腺癌療效不顯著的情況下,單抗與各類治療方式如抗血管生成藥、化療聯(lián)合使用展現(xiàn)出一定的作用[12-13]。本研究通過(guò)構(gòu)建C57BL/6J小鼠E0771乳腺癌皮下瘤模型,發(fā)現(xiàn)TSA與anti-PD-L1聯(lián)合使用后腫瘤體積增長(zhǎng)趨勢(shì)顯著減緩,同模型組相比,有效抑制E0771乳腺癌小鼠腫瘤發(fā)展進(jìn)程,同時(shí)緩解了小鼠脾臟腫大現(xiàn)象。

Fig 3 Number of CD4+ T cells and CD8+ T cells in lymph and spleen in each group by flow cytometry (n=4)

Fig 4 Infiltration of myeloid macrophage in tumor of mice in each group by flow cytometry (n=4)

Fig 5 The positive expression of F4/80 in each group by IHC (×200) (n=5)

Fig 6 Infiltration of myeloid macrophage in lymph of mice in each group by flow cytometry (n=3)

進(jìn)一步考察TSA聯(lián)合anti-PD-L1的具體作用方式,ELISA結(jié)果顯示TSA與anti-PD-L1聯(lián)合使用后,IL-6、MCP-1炎性細(xì)胞因子分泌減少,提示炎性環(huán)境的改變及其潛在機(jī)制有待探索。腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子的改變與免疫細(xì)胞的極化狀態(tài)、瘤內(nèi)募集和免疫排斥反應(yīng)相關(guān)[14]。qPCR結(jié)果顯示,TSA與anti-PD-L1聯(lián)合使用可顯著降低cxcl1,cxcl2,cxcl3,ccl2,gm-csfmRNA的表達(dá),這些炎性因子與巨噬細(xì)胞趨化呈高度相關(guān)。腫瘤來(lái)源的IL-10和巨噬細(xì)胞集落刺激因子被證明通過(guò)抑制樹突狀細(xì)胞成熟而損害其抗原呈遞能力,導(dǎo)致其功能障礙[15]。骨髓亞群包括TAMs、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞,構(gòu)成了免疫微環(huán)境的異質(zhì)成分,具有很強(qiáng)的免疫抑制潛力。研究表明,骨髓抑制細(xì)胞產(chǎn)生的瘤內(nèi)活性物質(zhì)能夠誘導(dǎo)CCL2趨化因子硝化并阻礙T細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)[16]。本文研究中,TSA與anti-PD-L1聯(lián)合使用促使脾臟和淋巴內(nèi)CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞數(shù)量增多?；诖?TSA通過(guò)調(diào)控免疫微環(huán)境的改變發(fā)揮治療作用也是中醫(yī)藥治療疾病整體觀念的體現(xiàn)。同時(shí),TSA降低腫瘤免疫微環(huán)境炎癥因子的釋放,減少髓源性巨噬細(xì)胞在乳腺癌中的數(shù)量,淋巴內(nèi)髓源性巨噬細(xì)胞數(shù)目同樣降低。研究表明,除腫瘤細(xì)胞外,在腫瘤微環(huán)境內(nèi)巨噬細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞上PD-L1的表達(dá),即宿主自身的免疫原性才是PD-1/PD-L1免疫治療發(fā)揮作用的關(guān)鍵[17]。因此,TSA與anti-PD-L1聯(lián)合使用后,可有效抑制瘤內(nèi)髓源性巨噬細(xì)胞的數(shù)量和PD-L1介導(dǎo)的免疫逃逸作用。針對(duì)部分臨床患者對(duì)于anti-PD-L1反應(yīng)不敏感問(wèn)題,除與傳統(tǒng)化療、抗血管療法聯(lián)合使用外,以TAMs趨化及功能恢復(fù)為目標(biāo)的治療方式逐漸成為聯(lián)合anti-PD-L1治療的新思路?；钛鏊幵谥嗅t(yī)藥治療癌癥時(shí)維持較高使用頻率,然而,研究發(fā)現(xiàn),活血化瘀療法對(duì)癌癥的治療并不在于其極高的殺傷活性,而是通過(guò)作用于腫瘤內(nèi)部環(huán)境,如促使血管正常化、抑制血栓形成、改變免疫細(xì)胞浸潤(rùn)等方式。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明,TSA可通過(guò)改變腫瘤免疫微環(huán)境,聯(lián)合anti-PD-L1對(duì)E0771乳腺癌進(jìn)行治療,為臨床應(yīng)用丹參治療癌癥提供部分科學(xué)依據(jù)。

綜上,本研究表明,TSA與anti-PD-L1聯(lián)合使用可有效減緩E0771乳腺癌小鼠的腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)程,減少IL-6,MCP-1炎性因子的釋放,巨噬細(xì)胞趨化相關(guān)因子cxcl1,cxcl2,cxcl3,ccl2,gm-csf的表達(dá),進(jìn)而抑制髓源性巨噬細(xì)胞向腫瘤組織浸潤(rùn),通過(guò)增加脾臟、淋巴結(jié)內(nèi)CD4+T細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)小鼠免疫微環(huán)境。針對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的治療方式的提出,為中醫(yī)藥治療乳腺癌提供了潛在的可能性。